一种重组人源超氧化物歧化酶的生产方法(—)【技术领域】[0001]本发明涉及一种重组人源超氧化物歧化酶的生产方法，属于生物工程【技术领域】。(二)[0002]超氧化物歧化酶(SOD)能及时有效地清除机体内的超氧自由基，使生物体能够避免氧化损伤，是生物体抵御活性氧毒害作用的第一道防线，具有抗辐射、抗衰老、消炎、抑制肿瘤和癌症等功能。目前SOD酶已作为一种保健医药产品广泛应用于医药、食品、饮料、化妆品等行业，具有非常广阔的市场。[0003]市场上流通的SOD大多是从动物血液中提取的，容易受到污染，产生细菌内毒素，引起热源性问题，研制开发重组人超氧化物歧化酶不仅可解决人源SOD来源有限和因血制品污染而带来的安全性问题，而且可避免异源SOD在临床应用时可能出现的免疫性过敏反应。传统的SOD纯化方法较繁琐且费时费力，SOD产率较低、生产成本昂贵，不利于大规模的工厂化生产。因此开发其他更安全、更经济的提取或分离方法取代传统SOD生产方法具有十分重要的意义。本发明将含有人源SOD基因的工程菌进行发酵表达，高压匀质破碎后进行热变性，离心超滤后进行层析，克服了以现有技术存在的缺陷，可满足工业化生产的需要。(三)
[0004]本发明的目的是提供一种操作简单，适用于工业化生产的重组人源超氧化物歧化酶的生产方法。[0005](四)技术方案[0006]本发明涉及一种重组人源超氧化物歧化酶的生产方法。属于生物工程【技术领域】。该方法利用铜盐热变性除去大部分杂蛋白，离心后经过微滤除菌及杂质，利用超滤进行浓缩、除盐及小分子杂蛋白，阴离子层析纯化后，冷冻干燥。操作简单，成本低廉，适用于工业生产。
[0007]具体操作步骤为:
[0008](I)将含有人源超氧化物歧化酶基因的大肠杆菌进行发酵，发酵液用管式离心机离心，转速:16000r/min,流速:0.6-0.8mL/min,收集菌体,按照菌体湿重与纯水体积1: 10比例悬浮，用高压匀质机破碎，破碎压力为880bar，破碎一次；
[0009](2) 在破碎后混合液中加入2% -6%体积的lOmmol/L的CuCl2溶液，通入螺旋管加热器中进行热变性，热变性温度65-80°C，时间:10-30min。离心，收集上清；
[0010](3)膜处理，将步骤2所得上清液依次通过5 μ m的预处理膜、0.22 μ m滤膜、6kDa超滤膜；
[0011](4) DEAE-SephadexA50 柱层析,用 2.5_50mmoL/L 的 pH 7.6 的磷酸钾盐缓冲液进行梯度洗脱，收集具有SOD活力的洗脱液，超滤浓缩后，冷冻干燥，用邻苯三酚自氧化法测定SOD活性。


图1是本发明实施例1中CuCl2浓度对SOD活性影响的示意图；
图2是本发明实施例2中热变性温度及时间对SOD活性的影响的示意图。
(四)
[0012]下面通过具体实例应用，对本发明的技术方案进行进一步的说明。
[0013]实施例1: [0014]将60L发酵液用管式离心机离心，转速:16000rpm,流速0.6-0.8mL/min,收集发酵后的菌体，按照菌体湿重与纯水体积1: 10比例悬浮，用高压匀质机破碎，破碎压力为880bar，破碎一次。在破碎后混合液中分别加入2%、3%、4%、5%、6%体积的10mmol/L的CuCl2后通入螺旋管加热器中，65°C，20min。离心后，弃去沉淀。上清液进行膜处理，首先通过5 μ m预处理膜除去杂质，细胞碎片；然后过0.22 μ m滤膜，除去杂菌；最后用6kDa的超滤膜进行处理，除盐及小分子杂蛋白，浓缩至15L。浓缩液进行DEAE-S印hadeXA50柱层析，用
2.5-50mmoL/L的pH 7.6的磷酸钾盐缓冲液进行梯度洗脱，收集具有SOD活力的洗脱液，超滤浓缩后，将所得溶液冷冻干燥得到SOD精品。从图1中可以看出SOD活性可达到2700U/mg以上。
[0015]实施例2:
[0016]
[0017]
[0018]将60L发酵液用管式离心机离心，转速:16000rpm,流速:0.6-0.8mL/min,收集发酵后的菌体，按照菌体湿重与纯水体积1: 10比例悬浮，高压匀质机破碎，破碎压力为880bar，破碎一次。在破碎后混合液中加入5%体积的lOmmol/L的CuCl2后通入螺旋管加热器中，设置温度为650C、70°C、75°C ,80°C,控制蠕动泵速度，使其从进到出时间分别控制为10min、15min、20min、25min、30min,离心后，弃去沉淀。上清液进行膜处理，首先通过5 μ m预处理膜除去杂质，细胞碎片；然后过0.22 μ m滤膜，除去杂菌；最后用6kDa的超滤膜进行处理，除盐及小分子杂蛋白，浓缩至15L。浓缩液进行DEAE-S^hadex A50柱层析，用2.5-50mmoL/L的pH 7.6的磷酸钾盐缓冲液进行梯度洗脱，收集具有SOD活力的洗脱液，超滤浓缩后，将所得溶液冷冻干燥得到SOD精品。从图中看出热变性温度为70°C，时间为15min时，SOD活性最高为3170U/mg。
[0019]实施例3:
[0020]
[0021]
[0022]将60L发酵液用管式离心机离心，转速:16000rpm,流速0.6-0.8mL/min:收集发酵后的菌体，按照菌体湿重与纯水体积1: 10比例悬浮，高压匀质机破碎，破碎压力为800bar，破碎一次。在破碎后混合液中加入5%体积的lOmmol/L的CuCl2后通入螺旋管加热器中，设置温度为70°C，控制蠕动泵速度，使其从进到出时间在15min，离心后，弃去沉淀。上清液进行膜处理，首先通过5 μ m预处理膜除去杂质，细胞碎片；然后过0.22 μ m滤膜，除去杂菌；最后用6kDa的超滤膜进行处理，除盐及小分子杂蛋白，浓缩至15L。浓缩液进行分别用DEAE-32和DEAE-S印hadex A50柱层析，用2.5-50mmol/L的pH 7.6的磷酸钾盐缓冲液进行梯度洗脱，收集具有SOD活力的洗脱液，超滤浓缩后，将所得溶液冷冻干燥得到SOD精品。活性可达到3170U/mg，纯度92%以上。
[0023]层析纯化效果比较
[0024]