专利名称：一种大肠杆菌高效表达重组人源超氧化物歧化酶的方法超氧化物歧化酶(SOD)是具有专一清除生物体内的超氧离子，平衡机体的氧自由基，保护人体细胞免受有毒化学物质、幅射、紫外等环境因素破坏，SOD酶在抗衰老，抗辐射性，消炎，抑制肿瘤和癌症，以及自身免疫疾病的治疗方面有重要的作用；目前SOD酶已作为一种保健医药产品广泛应用于食品饮料、化妆品等行业，具有非常广阔的市场。目前国内的SOD大多是从动物血液中提取的，由于含有各种难以消除的病毒及外源污染，欧盟已于 1999年颁布法令，禁止从动物血液中提取的SOD用于人类；而从植物中提取SOD的方法往往受到原材料的制约，且成本较高；因此开发其他更安全、更经济的提取或合成方法取代传统SOD生产方法将是一个趋势。利用工程微生物制备SOD的工艺具有工艺简单，生产成本低，对环境友好等特点，已成为SOD产业化的发展方向；目前日本、加拿大等国家也开始研究采用基因重组等新的生物工程技术来合成SOD ；国内已有企业利用生物工程技术来生产 S0D，但产量远不能满足日益增长的市场需求，随着人们对超氧化物歧化酶(SOD)逐渐认识并应用，超氧化物歧化酶市场具备较好的机遇。
本发明是为了提供了一种重组大肠杆菌高效表达人源重组超氧化物歧化酶的方法。本发明的技术方案是这样实现的本发明为一种重组大肠杆菌高效表达人源重组超氧化物歧化酶的方法；利用大肠杆菌作为菌种，以酵母粉、蛋白胨、葡萄糖、KHP04、(NH4)2HP04、MgS04 ·7Η20、柠檬酸、柠檬酸铁为原料，进行液体深层次发酵生产超氧化物歧化酶，发酵液经管式离心机进行固液分离，得到菌体及发酵液上清液；所得到的菌体再经过均质机破碎，热处理，离心收集上清液，超滤， 微滤和喷雾干燥得到粉状超氧化物歧化酶产品；具体包括下述步骤1、菌种及种子液扩大培养1. 1本发明所用菌种为大肠杆菌BL21 (hS0D-pET-28a)重组菌株。1. 2将大肠杆菌试管斜面菌种在无菌条件下转入已制备好的装在3L三角瓶600mL 一级种子培养基中(pH 6.8 7.2;灭菌条件1211灭菌301^11) ；250rpm、37士 1 °C培养 12 14小时备用。1. 3用100L种子罐对菌种进行扩大培养将工业级的酵母粉480g，蛋白胨900g，IM磷酸缓冲液(pH = 6. 8) 6L，生物素2%ig， 葡萄糖600g分别投入100L种子罐内，用自来水定容到60L ；搅拌均勻；然后用蒸汽直接灭菌，115度保温30分钟，再降温至37度，接入按步骤1. 2所得的600mL —级种子菌液；在通气量0. 6 1 ；温度37 士 1°C;罐压力0. 03 0. 05MPa的条件下培养他，得扩大培养的大肠杆菌二级种子液。2、用1000L发酵罐发酵生产超氧化物歧化酶将工业级的葡萄糖5kg、6. 65kg 的 KH2P04、2kg 的(NH4)2HP04、6kg 的 MgSO4 ·7Η20、柠檬酸1. ^g、柠檬酸铁(111)0. 05kg分别投入1000L发酵罐内，用自来水定容到500L，搅拌均勻；然后用蒸汽直接灭菌，115度保温30分钟，再降温至37度，灭菌后由NH4OH调整 PH 到 7. 0，再添加 0. 8L 的微量元素液(2. 5mg/L 的 KIU. 5mg/L 的 MnCl2 · 4H20、1. 5mg/L 的 CuCl2 ·2Η20、3· Omg/L 的 H3BO3,2. 5mg/L 的 Na2MoO4 · 2H20U. 3mg/L 的 Zn (CH3COO) 2 ·2Η20 盐酸硫铵4. 5mg/L) ； IOOg的CuS04*5H20、50g ZnSO4接入60L—级种子培养液；在风量1 0. 6 0. 8、温度37士 1°C、罐压力0. 03 0. 05MPa的条件下培养，一段时间以后补葡萄糖，到OD6tltl 达到40左右开始用IPTG诱导，诱导2小时后，向发酵罐中流加微量元素CuSO4 · 5H20和 ZnSO4,共诱导10小时，得到发酵液，利用管式离心机将发酵液进行固液分离，所得到的菌体再经过均质机破碎，热处理，离心收集上清液，得到超氧化物歧化酶清液；所谓风量比是一立方米发酵液与每分钟所需要的进气量之比。3、将步骤2得到的超氧化物歧化酶清液采用0. 22 μ m的超滤膜和故的微滤膜对粗酶液进行过滤和浓缩；然后采用离心式喷雾干燥塔进行喷雾干燥；进口温度130 1400C，出口 50 60°C，得到粉状超氧化物歧化酶包埋产品。4、超氧化物歧化酶活性测定在一般情况下，SOD酶活性测定只能应用间接活性测定法；本实验采用邻苯三酚自氧化方法；邻苯三酚在碱性条件下，能迅速自氧化，释放出02_，生成带色的中间产物，反应开始后反应液先变成黄棕色，几分钟后转绿，几小时后又转变成黄色，这是因为生成的中间物不断氧化的结果；这里测定的是邻苯三酚自氧化过程中的初始阶段，中间物的积累在滞留30 4 后，与时间成线性关系，一般线性时间维持在^iin的范围内，中间物在 325nm波长出有强烈光吸收；当有SOD存在时，由于它能催化02_与H+结合生成仏和H2O2， 从而阻止了中间产物的积累，因此，通过计算即可求出SOD的酶活性。酶活力单位定义在25°C恒温条件下，每毫升反应液中，每分钟抑制邻苯酚自氧化率达50%的酶量定义为1个酶活力单位。具体操作如下测自氧化速率(1)取PH8. 2的SOD buffer 4. 5ml于石英比色杯325nm测光密度值，调零。(2)取 PH8. 2 的 SOD buffer4. 5ml 于 IOmL 印管中(25°C水浴保温)，加入 45mmol/ L邻苯三酚溶液IOul混勻后迅速于石英比色杯325nm波长测光密度值。(3)每隔30s测一次，若测anin，求出邻苯三酚的自氧化率ODA，(ODA/min在 0. 06士0. 002最好)，因为这时得误差较小，如果自氧化速率高则加浓Hcl，看情况而定，自氧化速率低加SOD buffer)测酶活(1)取调整好的SOD buffer 4. 5ml于IOml EP管中(于25°C水浴中保温)，分别加入待测酶液IOul和45mmol/L邻苯三酚溶液IOul，混勻后迅速于石英比色杯中，325nm波长测光密度值。(2)每隔30s测一次，共测2min，求出光密度值变化速率0DB。计算酶活力本发明是一种大肠杆菌高效表达重组人源超氧化物歧化酶的方法，利用大肠杆菌作为菌种，以酵母粉、蛋白胨、葡萄糖、KH2PO4、(NH4)2HPO4、MgSO4·7H2O、柠檬酸、柠檬酸铁为原料，进行液体深层次发酵生产人源超氧化物歧化酶，本发明的有益效果在于通过改进发酵方式，采用二级种子培养及喷雾干燥制得超氧化物歧化酶酶粉，简化了发酵工艺，节省了设备和时间，实现了超氧化物歧化酶的高产率发酵，使本发明可以适用于大规模工业生产，大大降低了超氧化物歧化酶的生产成本，具有很好的社会经济效益。