专利名称：一种dna分子及重组质粒和大肠杆菌的制作方法L-苏氨酸是人体所必需的8种氨基酸之一，广泛应用于医药、食品、饲料等，目前 L-苏氨酸主要以微生物发酵的方法生产，多种细菌可用于L-苏氨酸生产，如谷氨酸棒杆菌、大肠杆菌等。由于大肠杆菌发酵生产L-苏氨酸具有繁殖迅速、发酵温度高、生理生化基础研究较深入的优势，逐渐成为L-苏氨酸生产的常用菌株。随着世界对L-苏氨酸需求量的不断增加，L-苏氨酸高产菌株的研究越来越受到重视。其中，影响大肠杆菌高产的最关键的一个因素就是其耐受L-苏氨酸的能力，只有解除L-苏氨酸对代谢途径的抑制，才能进而增加L-苏氨酸的产量。虽然野生型的大肠杆菌具有表达L-苏氨酸耐受蛋白的基因，但该基因所表达的蛋白量较低，仅为大肠杆菌正常生长所需，并不能耐受大于0. IM浓度的L-苏氨酸，使得野生型的大肠杆菌的产酸能力较低。因此，利用生物技术手段对野生型大肠杆菌进行改造，使其能够具有较高L-苏氨酸耐受能力，对L-苏氨酸的生产具有十分重要的意义。发明内容有鉴于此，本发明的目的是提供一种DNA分子及重组质粒和大肠杆菌，使得所述大肠杆菌对L-苏氨酸具有较高的耐受活性。为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案一种DNA分子，其核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示。本发明从NCBI数据库获得来自于耶尔森氏菌属-Yersinia enterocolitica subsp. enterocolitica 8081菌株的一段蛋白质序列，其氨基酸序列如SEQ ID N0:4所示， NCBI蛋白序号为Gi :123440599，该蛋白具体功能尚未得到公开确认，而经申请人研究其具有耐受L-苏氨酸的活性，但是表达该蛋白的基因来源于同大肠杆菌种属差异较大的耶尔森氏菌属，其在大肠杆菌中并不能正确表达该蛋白。故本发明按照大肠杆菌W3110密码子的偏好性，优化密码子，通过核酸合成仪合成核苷酸序列如SEQ ID NO :1所示的DNA分子， 测序验证该序列的正确性，合成基因酶切位点为Smal/Hindlll，其中优化、合成工作由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。本发明还提供一种重组质粒pKR-D，由质粒pKK223-3在其SmaI和HindIII酶切位点间插入如SEQ ID NO 1所示核苷酸序列的DNA分子获得，经PCR和酶切验证并测序， 表明如SEQ ID NO 1所示核苷酸序列的DNA分子已成功构建至质粒pKK223_3中Sma I和 HindIII酶切位点间，其质粒图谱见图1。
本发明还提供一种重组质粒PKTR-D，其由以下方法制备
以重组质粒pKR-D为模板，用核苷酸序列如SEQ ID NO :2所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO 3所示的下游引物扩增，BamHI/SphI双酶切扩增产物，获得由Tac启动子、SEQ ID NO 1所示核苷酸序列的DNA分子、rrnB Tl Terminator终止子、rrnB Terminator终止子组成的片段，然后与经过BamHI/SphI双酶切的质粒pKK223-3_ThrA，BC 连接即得；
其中，所述Tac启动子、rrnB Tl ^Terminator终止子位于片段两端，SEQ ID N0:1所示核苷酸序列的DNA分子位于Tac启动子、rrnBTerminator终止子之间，rrnB Terminator 终止子位于SEQ ID NO :1所示核苷酸序列的DNA分子和rrnB Tl Terminator终止子之间。
经PCR和酶切验证并测序，表明所述片段已成功构建至质粒pKK223-3-HirA’BC中 BamHI和SphI酶切位点间，其质粒图谱见图2。
质粒pKK223-3 和 pKK223_3_ThrA，BC 已在文献“Kwang Ho Lee, Molecy Iar Systems Biology 3 :149，2007”中公开，并可通过市售获得，两者皆为强表达质粒，以两者为基础质粒构建的重组质粒pKR-D和pKTR-D有助于本发明所述DNA分子在大肠杆菌中的表达。其中，PKR-D带有基础质粒PKK223-3的Tac强启动子，能增加大肠杆菌中所述 DNA分子的拷贝数和表达量，并通过基础质粒PKK223-3原有的具有强终止结构的rrnB Tl Terminator终止子和rrnB Terminator终止子终止该基因的表达，以防所述DNA分子中TAG 终止密码子不能终止基因表达造成的通读。
pKTR-D是以pKR-D为模板，将上述带有Tac启动子、rrnB TlTerminator终止子和 rrnB Terminator终止子的所述DNA分子克隆到质粒pKK223_3_ThrA，BC中BamHI和SphI 酶切位点间，同样具有上述优势。此外，pKTR-D带有基础质粒pKK223-3-ThrA’BC的定点突变苏氨酸操纵子_ThrA’BC，该操纵子与引入的强Tac启动子可以共同增强所述DNA分子的表达量，有利于改造后的大肠杆菌的L-苏氨酸耐受能力的提高。
本发明将重组质粒pKR-D按照本领域常规方法转化到经氯化钙法制备的大肠杆菌W3110感受态细胞中，得到一种能够耐受L-苏氨酸的新型大肠杆菌，命名为MHZ-0211-1， 经PCR和酶切验证并测序，表明所述重组质粒pKR-D已成功转入大肠杆菌W3110中，并于 2011年12月四日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为 CGMCC No :5665，分类命名为大肠埃希氏菌，Escherichia, coli。
本发明将重组质粒pKTR-D按照本领域常规方法转化到经氯化钙法制备的大肠杆菌W3110感受态细胞中，得到一种能够耐受L-苏氨酸的新型大肠杆菌，命名为MHZ-0211-2， 经PCR和酶切验证并测序，表明所述重组质粒pKR-D已成功转入大肠杆菌W3110中，并于 2011年12月四日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为 CGMCC No :5666，分类命名为大肠埃希氏菌，Escherichia, coli。
所述大肠杆菌W3110购自于美国模式培养物集存库，商品货号为ATCC Number 39936 。
将保藏编号为CGMCC No :5665和CGMCC No :5666的大肠杆菌(以下简称为 MHZ-0211-1 和 MHZ-0211-2)与分别转入 pKK223_3 和 pKK223_3_ThrA’ BC 的两株大肠杆菌W3110(以下简称为MHZ-0200-1和MHZ-0200-2)进行L-苏氨酸耐受试验，结果表明，MHZ-0211-1和MHZ-0211-2两菌株均可耐受0. 4M的L-苏氨酸，而MHZ-0200-1和 MHZ-0200-2两菌株在0. 1-0. 5M范围内均不耐受，表明本发明所述的新型大肠杆菌菌壳耐受较高浓度的L-苏氨酸。
此外，将MHZ-0211-1、MHZ-0211-2、MHZ-0200-1 和 MHZ-0200-2 分别在相同环境下进行L-苏氨酸发酵试验，结果表明，MHZ-0211-1和MHZ-0211-2两菌株L-苏氨酸产量分别为0. 4g/L、l. lg/L，而MHZ-0200-1和MHZ-0200-2L-苏氨酸产量分别为0、0. 9g/L，本发明所述新型大肠杆菌L-苏氨酸产量均高于各自的对照菌株，表明其可以应用于L-苏氨酸发酵中。
由以上技术方案可知，本发明以一段功能未知的蛋白序列为参照，优化并合成一段新DNA序列，并克隆至强表达载体pKK223-3和pKK223-3_ThrA，BC中，转化到大肠杆菌 W3110中得到两株具有高L-苏氨酸耐受活性的新型大肠杆菌，能够应用于L-苏氨酸的发酵中。
生物材料保藏信息说明
1、MHZ-0211-1大肠杆菌，已于2011年12月四日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No :5665，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，分类命名为大肠埃希氏菌，Escherichia, coli。
2、MHZ-0211-2大肠杆菌，已于2011年12月四日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No :5666，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，分类命名为大肠埃希氏菌，Escherichia, coli。


图1示本发明所述重组质粒pKR-D质粒图谱；
图2示本发明所述重组质粒pKTR-D质粒图谱；
图3示本发明所述重组质粒pKR-D的电泳鉴定其中，最右侧为Marker,从上之下依次为 5000bp、3000bp、2000bp、1500bp、 IOOObp、750bp、500bp、250bp、IOObp ；左侧条带为双酶切产物条带，从上至下依次为 4296bp、893bp ；
图4示本发明所述重组质粒pKTR-D的电泳鉴定其中，最右侧为Marker,从上之下依次为 5000bp、3000bp、2000bp、1500bp、 IOOObp、750bp、500bp、250bp、IOObp ；左侧条带为单酶切产物条带，从上至下依次为 5201bp、4824bp。

本发明公开了一种DNA分子及重组质粒和大肠杆菌，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的DNA分子、重组质粒、大肠杆菌已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
下面结合实施例，进一步阐述本发明。其中，实施例部分如未说明，则所有分子克隆、转化等生物技术方法均参照《分子克隆试验指南》(J.萨姆布鲁克等著，科学出版社出版,第三版)O
实施例1 本发明所述DNA分子的优化和合成
本发明从NCBI数据库获得来自于耶尔森氏菌属-Yersinia enterocoliticasubsp. enterocolitica 8081的一段蛋白质序列，其氨基酸序列如SEQ ID NO :4所示，NCBI 蛋白序号为Gi :123440599。本发明按照大肠杆菌W3110密码子的偏好性，优化密码子，通过核酸合成仪合成核苷酸序列如SEQ ID NO :1所示的DNA分子，测序验证该序列的正确性， 合成基因酶切位点为Smal/Hindlll。以Smal/Hindlll为插入位点，将其克隆到高拷贝质粒载体pUC57上，以大肠杆菌DH5 α为受体菌株进行扩增。
其中优化、合成工作由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。
实施例2 构建重组质粒pKR-D
提取上述大肠杆菌DH5a中pUC57质粒，Smal/Hindlll双酶切，50 μ 1体系，T by ffer+BSA，酶切产物进行1 %琼脂糖凝胶电泳，待合适时间取下凝胶，切胶回收目的基因片段，取3μ 1与已制作好的同样用Smal/Hindlll双酶切的pKK223_3质粒1 μ 1混合，加入高效连接酶4μ1制作8μ1的连接体系。16°C过夜连接，次日转化已制作好的大肠杆菌 Trans Tl感受态细胞，终浓度100 μ g/ml氨苄青霉素LB平板筛选，培养20h后挑单菌落， 提质粒用使用HindIII和BamHI双酶切验证，见图3。结果表明，已将所述DNA分子构建至 PKK223-3，形成新重组质粒pKR-D，质粒图谱见图1。
由图3可知，质粒转化大肠杆菌能够提出质粒，酶切条带位置正确、大小正确，且测序结果与所述DNA分子序列一致，说明该质粒已经构建成功。
实施例3 构建重组质粒pKTR-D
提取实施例2中大肠杆菌中的质粒pKR-D做模板，以序列表中SEQ ID NO :2和 SEQ ID NO :3所示引物，扩增目的基因片段，该片段带有pKTR-D上的一段源于基础质粒 PKK223-3 的 Tac 启动子序列和 rrnB Tl Terminator、rrnB Terminator 终止子序列。BamHI/ SphI酶切扩增产物，取3 μ 1与已制作好的同样用BamHI/SphI双酶切的pKK223_3_thrA’BC 质粒1 μ 1混合，加入高效连接酶4 μ 1制作8 μ 1的连接体系。16°C过夜连接，次日转化已制作好的大肠杆菌Trans Tl感受态细胞，终浓度100 μ g/ml氨苄青霉素LB平板筛选， 培养20h后挑单菌落，提质粒HindIII酶切验证，见图4。结果表明，已将所述片段构建至 pKK223-3-thrA，BC，形成新重组质粒pKTR-D，质粒图谱见图2。
由图4可知，质粒转化大肠杆菌能够提出质粒，酶切条带位置正确、大小正确，且测序结果与所述DNA分子序列一致，说明该质粒已经构建成功。
实施例4 转化重组质粒pKR-D至大肠杆菌W3110
氯化钙法制备大肠杆菌W3110感受态细胞，从实施例2中的大肠杆菌Trans Tl感受态细胞中提取质粒PKR-D，转化W3110菌株，氨苄青霉素浓度100 μ g/ml浓度平板筛选，得到MHZ-0210-1大肠杆菌。
经PCR和酶切验证并测序，表明所述重组质粒pKR-C已成功转入大肠杆菌W3110 中，并于2011年12月四日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No :5665，分类命名为大肠埃希氏菌，Escherichia, coli。
实施例5 转化重组质粒pKTR-D至大肠杆菌W3110
氯化钙法制备大肠杆菌W3110感受态细胞，从实施例3中的大肠杆菌Trans Tl感受态细胞中提取质粒PKTR-D，转化W3110菌株，氨苄青霉素浓度100 μ g/ml浓度平板筛选， 得到MHZ-0210-2大肠杆菌。
经PCR和酶切验证并测序，表明所述重组质粒pKTR-D已成功转入大肠杆菌W3110中，并于2011年12月四日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No :5666，分类命名为大肠埃希氏菌，Escherichia, coli。
实施例6 =L-苏氨酸耐受试验
参照实施例4或实施例5的方法，将质粒pKK223-3和质粒pKK223-3_thrA，BC分别转化到大肠杆菌W3110中，得到MHZ-0200-1以及MHZ-0200-2大肠杆菌。
按照《分子克隆试验指南》配制1. 5%琼脂的M9基本培养基，115°C灭菌20min，分别配制成含0、0. 1M、0. 2M、0. 3M、0. 4M、0. 5M的L-苏氨酸的培养基，待冷却到60°C左右，加入 100mg/ml氨苄青霉素使终浓度100 μ g/ml, IM的IPTG 0. 1 μ 1/ml，倒平板。菌株培养过夜， 稀释10000倍取100 μ 1涂布平板，每1 观察生长状况，培养7 菌落生长情况结果见表 1。
表1各菌种L-苏氨酸耐受试验结果


本发明涉及生物技术领域，公开了如SEQ ID NO1所示核苷酸序列的DNA分子，以及由质粒pKK223-3在其Sma I和HindIII酶切位点间插入所述DNA分子获得的重组质粒pKR-D和由质粒pKK223-3-ThrA’BC在其BamHI和SphI酶切位点间插入由Tac启动子、所述DNA分子、rrnB T1Terminator和rrnB Terminator终止子组成的片段获得的重组质粒pKTR-D。将本发明所述重组质粒转入W3110大肠杆菌中获得两株具有高L-苏氨酸耐受活性的菌种，能够应用于L-苏氨酸的发酵中。