专利名称：鼠李糖乳杆菌grx19及其应用的制作方法乳酸菌饮料是以乳或乳制品为原料，经乳酸菌发酵后加入水，以及白砂糖和(或) 甜味剂、酸味剂、果汁、茶、咖啡、植物提取液等一种或几种调制而成的饮料。发酵乳是以生牛(羊)乳或乳粉为原料，经杀菌、发酵后制成的PH值降低的产品。近年来我国乳酸菌饮料及发酵乳消费量快速增长，但目前我国市售乳酸菌饮料及发酵乳品质差异较大，由于活菌型乳酸菌饮料及发酵乳需冷藏销售、货架期短，影响运输销售并造成浪费。因此开发不需要冷链贮藏的活菌型乳酸菌饮料和发酵乳产品不仅具有重要意义， 且具有广阔的市场需求。
本发明目的在于为了克服前述和其它缺点，筛选获得一种可用于发酵乳(饮料)制品发酵的鼠李糖乳杆菌grxl9分离株，发明活菌型并具有长货架期的乳酸菌饮料及发酵乳产品的制备技术。本发明鼠李糖乳杆菌grxl9 {Lactobacillus rhamnosusgr^)于 2Oll 年 I2 月 02日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区大屯路 (中国科学院微生物研究所)。保藏号为CGMCC No :5519.本发明的另一目的在于建立延长货架期(即贮藏时间延长)乳酸菌饮料及发酵乳的制备方法。所述方法是将鼠李糖乳杆菌grxl9单独或与其它乳酸菌混合作为发酵剂菌种，按照常规方法制备活菌型乳酸菌饮料后，在70-75°C /15-20s条件下热处理，采用无菌灌装或卫生灌装得到在常温下销售的活菌型乳酸菌饮料。所述方法还可以是将鼠李糖乳杆菌grxl9单独或与其它乳酸菌混合作为发酵剂菌种，利用常规方法制备发酵乳后，添加或不添加稳定剂，在70-75°C /15-20s条件下热处理，采用无菌灌装或卫生灌装，生产在常温下销售的活菌型发酵乳制品或使发酵乳货架期得到延长。经试验利用本发明获得的乳酸菌制备的发酵乳及乳酸菌饮料，经常规巴氏杀菌后，产品符合GB 19302—2010和GB 21732—2008中相关活菌型产品的规定。图1是本发明鼠李糖乳杆菌grxl9革兰氏染色显微观察图。图2是本发明鼠李糖乳杆菌grxl9的基因组DNA电泳图。图3是本发明鼠李糖乳杆菌grxl9的PCR扩增条带。图4是本发明所述的长货架期活菌型乳酸菌饮料在30天内活菌数的变化。图5是本发明所述的长货架期活菌型乳酸菌饮料在30天内酸度以及pH的变化。图6是本发明所述的长货架期活菌型发酵乳产品在15天内活菌数的变化。图7是本发明所述的长货架期活菌型发酵乳产品在15天内酸度以及pH的变化。
发明者通过从我国传统发酵制品一乳扇中分离获得的大量乳酸菌，通过比较它们的加工以及耐热特性，获得一株加工及耐热综合性能最佳的乳酸菌菌株。并通过鉴定证实了本发明的菌株是鼠李糖乳杆菌grxl9 {Lactobacillus rhamnosus讶nW)。1.1样品来源与采集
本发明乳酸菌来源于云南大理民族乳制品——乳扇。乳扇是我国云南极富特色的传统乳制品之一，是一种用牛乳加入采用乳酸菌天然发酵酸浆制作的酸凝拉伸型干酪。乳扇样品分别采集于中国云南大理白族自治州洱源地区。样品存放于灭菌采样瓶中，置于4°C条件下保存。1. 2从乳扇中分离出乳酸菌
取1. Og乳扇样品将其在MRS培养基42°C培养M小时富集。将该培养物涂布在MRS平板上，然后在42°C培养48小时。培养后，收集在琼脂培养基上出现的菌落，并进一步纯化， 淘汰非乳酸菌菌株。将分离获得的菌株用含11% (W/W)脱脂乳的肉汤培养物，培养、冻干、保存在-18°C，然后用于各种检测细菌特征的试验。1. 3耐热乳酸菌的筛选
将从云南筛选获得的213株乳酸菌的耐热特性进行了比较。将不同乳酸菌分别按 4%(ff/ff)的接种量接种于脱脂乳培养基中，培养至凝乳，分别测定凝乳时和经60°C /5min, 60°C /10min,65°C /5min,65°C /IOmin和72°C /15s热处理后的活菌数量，比较不同菌株的耐热特性，选择耐热能力最好的菌株。通过对筛选菌株耐热能力的比较，可以看出，不同菌株耐热特性存在很大差异。在 213株菌株中，有101株菌不耐受60°C /5min的热处理强度，占试验菌株数量的47%以上， 其中本发明菌株grxl9在60°C /5min的热处理强度后活菌数量能达到106CFU/mL ；但有47 株菌株仍能够耐受60°C /IOmin的热处理强度，占试验菌株数量的2 左右，其中本发明菌株在60°C /IOmin的热处理强度后活菌数量能达到104CFU/mL，为最高；有1 株菌不耐受 65 0C /5min的热处理强度，占试验菌株数量的60%，其中本发明菌株在65 °C /5min的热处理强度后活菌数量能达到103CFU/mL，为最高；所有菌株在65°C /IOmin的热处理强度下都不能存活；有106株菌不耐受72°C /15s的热处理强度，占试验菌株数量的50%，其中本发明菌株在72°C /15s的热处理强度后活菌数量能达到107CFU/mL，为最高。综合比较菌株在相对低温度长时间处理和相对高温度短时处理条件下均具有较高存活菌株数的乳酸菌，筛选出耐热特性最好的菌株，即为本发明菌株，命名为grxl9。
1. 4菌株的鉴定
(1)乳酸菌菌株革兰氏染色
采用革兰氏染色法检测菌株的特征。本发明菌株呈革兰氏阳性，为无芽孢，杆状，大小为1. 0-1. 5um (如图1所示)。然后，研究该乳酸菌，以阐明其培养特征。结果是，该菌种在MRS琼脂平板上长成直径为2-3mm的白色菌落，最佳培养温度为37°C。(2)生理生化鉴定
从纯化好的本发明菌株固体培养基上挑单菌落接种到糖发酵微量鉴定管中用无菌石蜡油封口。放入37°C恒温培养箱培养。分别于24h和4 后观察各管中液体颜色变化情况，若变色为阳性，反之阴性，对照《伯杰氏细菌鉴定手册》初步确定分离菌株的属种，初步鉴定该菌株为鼠李糖乳杆菌。表1本发明菌株生理生化鉴定结果


本发明涉及鼠李糖乳杆菌grx19(Lactobacillusrhamnosusgrx19)及其应用，所述鼠李糖乳杆菌grx19的保藏号为CGMCC No.5519。该菌株可用于生产长货架期的活菌型乳酸菌饮料及发酵乳制品。将鼠李糖乳杆菌grx19单独或与其它乳酸菌混合作为发酵剂菌种，按照常规方法制备活菌型乳酸菌饮料及发酵乳产品后，在70-75℃/15-20s条件下热处理，采用无菌灌装或卫生灌装，可生产出在常温下销售的活菌型乳酸菌饮料及发酵乳制品。