专利名称：一种分离培养人胚嗅鞘细胞以及纯化的方法嗅黏膜嗅鞘细胞(olfactory ensheathing cells,OECs)能促进中枢轴突的再生。 近年来嗅鞘細胞移植的研究，为中枢神经系统损伤后的再生带来希望。OECs主要分布在嗅球和嗅黏膜中，目前进行OECs移植的实验材料大多取自嗅球，获取足够数量的OECs是临床应用的前提。另外，由于OECs具有特殊的細胞形态，突起十分细长。成纤维胞不能被p75 抗体标记，据此可以区分出OECs和成纤维細胞。OECs培养的最终目的是应用于临床修复脊髓损伤，这要求具有足够的細胞数，鉴于OECs的取材及培养都有难度，而且其他細胞污染难以避免，如何在保证细胞活性的前提下纯化OECs具有重要的临床意义。
本发明提出一种分离、培养人胚OECs，并采用免疫吸附法进行纯化的方法，所述方法包括如下步骤Sl =OECs的分离培养取2-3月龄流产胎儿，解剖显微镜下分离出两侧嗅球，移入含D-Hank’ s液的培养皿，在解剖显微镜下去除毛細血管网，将嗅球最外层的嗅神经层、小球层连同包被的软膜一起剥下。用D-Hank’S液洗2次，用虹膜剪剪碎，然后用0. 25%胰酶 37°C消化30min，加入含血清培养液终止消化。200目滤网过滤去除大块组织，过滤液600g 离心5min。弃上清，用含!7orskolin和BPE的全培养液重悬，调整細胞浓度为lX105/ml， 接种于p75包被的培养皿。每2天换液1次。S2 培养皿的包被将p75单抗用D-Hanks液配制成1 1000的浓度，浸没包被培养皿皿底后吸出，置超净台自然干燥后备用，用前培养液湿润。S3 =OECs的纯化培养7天后更换条件培养液(其为全培养液加入终浓度为 2X10-7mol/L的Ara-C)，培养48小时后替换为全培养液。S4 =OECs的染色鉴定将纯化后生长良好的細胞，用常规方法进行免疫細胞化学染色。贴壁細胞去培养基，用PBS洗3次，经4%的多聚甲醛固定30min。PBS洗涤3次， 0. 3% TritonX-100处理20min。PBS漂洗3次，10%羊血清室温封闭20min，吸出血清，加入鼠抗人p75IgG单抗，37°C孵育2小时后PBS洗3次，加入FITC结合的羊抗鼠IgG(l 500) 孵育30m in。显色后在显微镜下观察。本发明的分离、培养及纯化人胚嗅鞘細胞的方法，OECs经培养2 14天后仍保持雪旺细胞的双极和三极形态，细胞排布由杂乱无章，走向排列一致；采用适量的DMSO有保护轴突及髓鞘、减少水肿、促进神经周围血液流速、稳定细胞溶酶体膜和清除自由基之功效。通过下面结合附图的详细描述，本发明前述的和其他的目的、特征和优点将变得显而易见。其中图1至图4所示为纯化后生长良好的細胞在培养生长及处理的不同阶段的显微放大图；图5所示为本发明的分离、培养及纯化人胚嗅鞘細胞的方法流程示意图。
养皿皿底后吸出，置超净台自然干燥后备用，用前培养液湿润。S3 =OECs的纯化培养7天后更换条件培养液(其为全培养液加入终浓度为 2X10-7mol/L的Ara-C)，培养48小时后替换为全培养液。S4 =OECs的染色鉴定将纯化后生长良好的細胞，用常规方法进行免疫細胞化学染色。贴壁細胞去培养基，用PBS洗3次，经4%的多聚甲醛固定30min。PBS洗涤3次， 0. 3% TritonX-100处理20min。PBS漂洗3次，10%羊血清室温封闭20min，吸出血清，加入鼠抗人p75IgG单抗，37°C孵育2小时后PBS洗3次，加入FITC结合的羊抗鼠IgG(l 500) 孵育30m in。显色后在显微镜下观察。实验结果分析倒置相差显微镜下观察，原代培养Mh内大部分細胞已经贴壁，呈球形。培养2天后，开始出现少量双极细胞及三角形細胞，突起短小。5天后，大部分细胞胞体折光性较强， 呈三角形、梭形，细胞发出纤细的突起，偶见成纤维细胞(如图1所示)；培养第7天，双极细胞与三极细胞连成网络状，有些細胞由圆形变成梭形，突起更细更长。培养第10天，細胞形态呈现双极、三板，走向较一致，大致与雪旺细胞形态接近，双极细胞折光性很强，成纤维细胞明显增多(如图2所示)。经Ara-C处理后，成纤维細胞明显减少(如图3所示)。OECs 的染色結果，染色可见P75呈阳性，经Ara-C处理后培养的細胞，由于成纤维细胞大部分被去除，P75阳性率即细胞纯度可达90%以上(如图4所示)。
OECs位于嗅球表面两层即嗅神经层和小球层，每层结构间的差別有限，即便在解剖显微镜下也很难将这两层结构完整剥下，所以本发明采用胰酶消化的方法收集OECs，但同时也增加其他細胞污染的可能。成纤维细胞是OECs培养体系中最棘手的污染細胞，其分裂増殖和贴壁速度极快，远远超出OECs。本发明根据成纤维细胞与OECs有丝分裂的时象差，利用Ara-C处理48h，能有效祛除大部分成纤维細胞，以减少其下一歩的非特异贴壁。p75是神经营养因子低亲和カ受体，也是OECs特异性的标记物，在OECs膜表面由跨膜、細胞外和胞质等三部分組成，其抗体能和細胞外部分发生特异性结合。因此，包被在培养皿上的p75抗体可将OECs吸附在培养皿表面。实验过程中，由于采用了胰酶消化以及反复的洗涤，对細胞的损伤很大，用P75抗体包被培养皿可使尽可能多的OECs贴壁，然后通过培养液的作用使其快速生长増殖。i^orsko Iin是ー种腺苷酸环化酶的激活剂，活化的腺苷酸环化酶使ATP转变成cAMP。cAMP激活蛋白激酶A，后者使磷脂酶C上的丝氨酸残基磷酸化，从而引起靶细胞的生物学反应、如細胞分泌、細胞通透性变化、細胞分裂、线粒体氧化磷酸化以及各种酶促反应。BP E可促进OECs的存活、増殖与生长，与i^orskolin的共同作用，可阻止经过酶剥蚀、不利条件刺激(如細胞清洗，吹打作用)后的細胞活性下降。其次， 本实验以DMSO溶解i^orskolin，使培养液中含有一定量的DMS0。适量的DMSO有保护轴突及髓鞘、减少水肿、促进神经周围血液流速、稳定细胞溶酶体膜和清除自由基之功效。在细胞消化、反复吹洗过程中，细胞难免遭受机械和化学损伤。在这种对氧敏感的細胞培养体系中，可能产生自由基和溶酶体崩解，DMSO的介入进ー步减小了細胞的损伤。本发明的实验中，OECs经培养2 14天后仍保持雪旺细胞的双极和三极形态，细胞排布由杂乱无章，走向排列一致。这种现象可保持很长时间，与Forskolin激活OECs影响细胞形态的信号转导系统有关。OECs在培养3 4天时呈巨噬细胞、条梭或形态不规则状，5天以后大致与雪旺细胞形态接近，呈条梭状，这可能是OECs再现外周雪旺细胞形态特性。本发明并不局限于所述的实施例，本领域的技术人员在不脱离本发明的精神即公开范围内，仍可作ー些修正或改变，故本发明的权利保护范围以权利要求书限定的范围为准。


本发明提出一种本发明提出一种分离培养人胚嗅鞘细胞以及纯化的方法，所述方法包括如下步骤S1OECs的分离培养；S2培养皿的包被；S3OECs的纯化；以及S4OECs的染色鉴定。本发明的分离、培养及纯化人胚嗅鞘细胞的方法，OECs经培养2～14天后仍保持雪旺细胞的双极和三极形态，细胞排布由杂乱无章，走向排列一致；采用适量的DMSO有保护轴突及髓鞘、减少水肿、促进神经周围血液流速、稳定细胞溶酶体膜和清除自由基之功效。