京尼平苷作为乙酰胆碱酯酶抑制剂的应用的制作方法[0002]阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)是一种常见、高发的神经退行性疾病。随着生活条件的改善，AD发病率正逐年增加，已经成为继肿瘤、心脏病和脑血管病之后引起老年人死亡的第四大病因。临床特征表现为持续性认知功能和学习障碍。因为AD的病理特征包括β样淀粉蛋白(β-amyloid, Αβ )聚合、沉积形成老年斑和tau蛋白过渡磷酸化形成神经纤维缠结，另外一个典型病理特征是乙酰胆碱(Acetylcholine, Ach)水平降低，因此AD的治疗策略之一是用乙酰胆碱酯酶(Acetylcholinesterase, AChE)抑制剂来减少乙酰胆碱的消耗。[0003]通常AChE活性在AD病人脑内的大部分区域都是降低的，而实验发现，老年斑附近的AChE活性反而明显升高。有人认为AChE的活性异常可能与这种A β的毒性有关。而且AChE还可能加速Αβ沉积，并且与Αβ结合形成复合物，二复合物的毒性比Αβ自身的毒性更大，加速了神经细胞的凋亡。人们用翻译核酸的方法来抑制AChE活性，发现可明显减少Αβ诱导的神经细胞凋亡。这对于发展新的AD治疗要去提供了新的思路。[0004]由于乙酰胆碱 酯酶抑制剂可通过减少突触间隙乙酰胆碱降解，增加突触间乙酰胆碱的利用，因此人们致力于发现乙酰胆碱酯酶抑制剂，并开发成为治疗AD的药物。目前人们已从中草药、微生物代谢产物和化学合成的化合物库中发现了一些具有较强活性的乙酰胆碱酯酶抑制剂。其中包括他克林(Tacrine)、多奈哌齐9donepezil)、利斯的明(Rivastigmine)、加兰他敏(Galantamine)、石杉碱甲(Huperzine)等,尽管这些化合物对改善早期和中度AD患者的认知功能有一定的作用，然而由于存在各种不良反应，如肝脏毒性、胃肠功能紊乱和口服生物利用度低等，因此其临床应用受到极大的限制。[0005]人们目前正致力于从天然产物中筛选、发现并获得毒副作用小的新型乙酰胆碱酯酶抑制剂。[0006]桅子:别名黄桅子、山桅、白蟾，是茜草科植物桅子的果实。目前，桅子的果实是传统中药，属卫生部颁布的第I批药食两用资源，具有护肝、利胆、降压、镇静、止血、消肿等作用。在中医临床常用于治疗黄疸型肝炎、扭挫伤、高血压、糖尿病等症。[0007]京尼平苷(结构如附图1所示)是一种环烯醚萜葡萄糖苷，易溶于水，是桅子的主要药效成分，其提取方法和产品应用已有大量文献报道。京尼平苷对消化系统、心血管系统和中枢神经系统疾病均有显著疗效，此外，京尼平苷还有一定的抗炎和治疗软组织损伤的作用。但是有关京尼平苷对乙酰胆碱酯酶的抑制作用还未见报道。[0008]在前期研究中，我们应用以Luciferase为报告基因的GLP-1受体激动剂高通量筛选(High throughput screen)模型，发现传统中药桅子提取物中存在胰高血糖素I (Glucago-like peptide I, GLP-1)受体激动剂,经过分离纯化和与标准品对照证实,京尼平苷(Geniposide)是一种新的GLP-1受体激动剂。京尼平苷可通过激活GLP-1受体,释放cAMP，并通过MAPK激酶途径诱导PC12细胞神经样分化，显示出神经营养作用；我们还进一步研究发现，京尼平苷能够通过PI3K、MAPK和PKA信号通路调节抗凋亡蛋白Bcl_2的表达，抑制氧化应激诱导的PC12细胞凋亡，提高细胞活力，表明京尼平苷具有一定的神经保护作用。


[0009]本发明发现了京尼平苷在医药方面的新用途，京尼平苷可在体内外抑制乙酰胆碱酯酶活性，是一种新的乙酰胆碱酯酶抑制剂。
[0010]本发明提出了京尼平苷作为乙酰胆碱酯酶抑制剂，在治疗和预防乙酰胆碱酯酶活性异常的疾病的药物中的应用。
[0011]本发明进一步提出京尼平苷作为乙酰胆碱酯酶抑制剂，在治疗和预防阿尔茨海默病、唐氏综合症的药物中的应用。
[0012]本发明还提出一种治疗和预防乙酰胆碱酯酶活性异常疾病的乙酰胆碱酯酶抑制剂，所述抑制剂包括治疗有效剂量的活性成分京尼平苷以及药学可接受的载体，所述活性成分京尼平苷的重量百分比为0.0P/0-99.99% ;所述制剂包括片剂、胶囊、注射剂等。
[0013]本发明的“药学接受的载体”是指制药上使用的赋形剂或者辅助剂。
[0014]本发明使用的术语“治疗有效剂量”是指为要实现其治疗作用的活性成分的有效剂量，该剂量通常是以及患者的症状、年龄、体重、性别、给药方法、给药时间与间隔、以及药物制剂的特性等等而变化。本领域所属技术人员应理解在剂量方面没有特性的限制，通常情况下活性成分的给药剂量约为每天每例患者16-128 mg/天，优选为32-96 mg/天，更优选为40-80 mg/天,通常为I次`给药。或者,大多数情况下,每日的有效剂量范围为0.4-1.6mg/Kg体重,优选为0.8-1.2 mg/Kg体重。但是,在某些情况下,有必要使用以上限制之外的剂量，由医生的处方决定。
[0015]本发明涉及京尼平苷对包括乙酰胆碱酯酶活性的直接抑制、对培养的神经细胞中乙酰胆碱酯酶活性的抑制、和对AD转基因动物脑内乙酰胆碱酯酶活性的抑制。京尼平苷可通过上述途径，但不局限于上述途径发挥对乙酰胆碱酯酶活性的抑制作用。
[0016]由于AD患者老年斑周围存在明显的乙酰胆碱酯酶活性异常升高现象，而且已有一些乙酰胆碱酯酶抑制剂对改善AD的认知功能和提高AD患者的学习能力有明显的作用，因此，京尼平苷可能通过抑制乙酰胆碱酯酶对AD有潜在的治疗价值。



[0017]图1.京尼平苷的化学结构式；
图2.京尼平苷抑制乙酰胆碱酯酶活性的量效关系；
图3.不同剂量的京尼平苷对培养的神经细胞中AChE活性的影响；
图4.京尼平苷处理不同时间后神经细胞中乙酰胆碱酯酶活性的差异；
图5.京尼平苷对阿尔茨海默病小鼠模型动物脑内乙酰胆碱酯酶活性的影响。

实验材料
APP/PSN转基因AD小鼠:南京大学模式动物研究所 PC12细胞:购自中科院上海生化所细胞库 血清、培养基:RPMI1640，Gibco公司 京尼平苷:中国药品生物制品检定所 乙酰胆碱酯酶、碘化乙酰胆碱和DTNB: Sigma公司 其他化学试剂:Sigma公司 仪器设备
二氧化碳孵育箱=Heraeus公司
倒置显微镜:日本Nikon
酶标仪:美国热电Varioskan
高温高压灭菌锅:T0MYAU0CLAVESS325，Gene公司
离心机:Superfuge, Heraeus 公司
纯水仪:美国Millipore公司
低速离心机:Ependof公司
实验方法
1、PC12细胞培养`
大鼠PC12神经细胞在37° C、5%C02的孵箱中培养，培养基为DMEM补加5%胎牛血清和10%马血清，100 U/mL青霉素，100 μ g/mL链霉素，2-3天换一次培养液，当细胞密度达到80左右时进行传代。细胞传代时，先倒尽瓶中的培养基，加入适量的0.25%胰蛋白酶/0.02%EDTA消化，轻轻吹打，以吹散细胞团，取对数生长期的细胞进行实验。
[0019]2、AChE活性分析
为了考察京尼平苷对AChE活性的直接作用，我们选用经典的Ellman分光光度法体外考察京尼平苷对人乙酰胆碱酶的抑制作用，并且使用空白组，利斯的明为阳性对照组进行实验。配置Tris缓冲液pH为7.2，底物碘化乙酰胆碱(Acetylcholineiodide，ACTI)浓度0.02 mol/L,显色剂二硫硝基苯甲酸(5，5- dithiobis- (2-nitrobenzoic acid, DTNB)浓度
0.03 mol/L, AChE 总量0.035 Units，京尼平苷浓度0、0.01、0.1、1.0、10 和 100 μ mol/L。
[0020]取Tris缓冲液30 μ L，AChE 20 μ L，各种浓度的抑制剂10 μ L于96孔板中，在37°C下保温10分钟后，加入15 4 1^底物4(^1，15 μ L显色剂DTNB，10分钟之内用酶标仪在412 nm处读取每孔吸光度。空白组用15 μ Ls缓冲液分别代替底物和抑制剂，标准组用15 UL Tris缓冲液代替抑制剂。
[0021]抑制率计算公式I =100 X (As 一 A空)/(A标一A空)％
每个实验至少重复三次，每次设3个复孔求平均值代表盖茨实验结果。
[0022]3、京尼平苷对培养细胞中AChE活性的影响
为了考察京尼平苷对培养的神经细胞中AChE活性的影响，我们分别用10 μ M京尼平苷处理细胞0、12、24、48小时，或者用0、0.1、1.0、10和100 μ M京尼平苷处理细胞24小时，随后收集并裂解细胞，待蛋白定量之后，测定各组细胞中AChE的活性。具体的步骤是:取40 μ L细胞裂解液、40 μ L碘化乙酰胆碱(6.7 mM，用蒸馏水配置)、20 μ L Ellman溶液(0.15 mM DTNB,用0.1 M的PBS，pH 7.4配置)，混合均匀之后，在10分钟之内用酶标仪在412 nm处测定吸光值，计算京尼平苷对AChE活性的抑制作用。
[0023]4、京尼平苷对AD转基因大鼠脑内AChE活性的影响 实验分组:对照组(7只)一标“对照(C) ”
低剂量组(7只)10 mg/Kg京尼平苷——标“低”
中剂量组(7只)20 mg/Kg京尼平苷一标“中”
高剂量组(7只)40 mg/Kg京尼平苷一标“高”
给药方式:受试药物(灌胃)
给药量: 受试药物:每次200微升灌胃 给药时间:4周，每天I次，
给药结束之后，麻醉动物断头处死，取全脑，匀浆之后，测定其中的蛋白浓度，将蛋白浓度调至相同浓度。测定各组匀浆液中AChE的活性。具体的步骤是:取40 UL脑组织匀浆液、40 μ L乙酰胆碱(6.7 mM，用蒸馏水配置)、20 μ L Ellman溶液(0.15 mM DTNB,用
0.1 M的PBS，pH 7.4配置)，混合均匀之后，在10分钟之内用酶标仪在412 nm处测定吸光值，计算京尼平苷对AChE活性的抑制作用。
[0024]实验结果
1、京尼平苷对AChE活性的直接抑制作用
我们用经典的Ellman法分析了京尼平苷对AChE的直接抑制作用，结果发现，京尼平苷可剂量依赖的抑制AChE活性，经曲线拟合，其IC5tl大约是120 nmol/L.实验结果如附图2所示。
[0025]2、京尼平苷对神经细胞中AChE活性的影响
为了考察京尼平苷对培养的PC12神经细胞中AChE活性的影响，我们测定了用不同浓度京尼平苷处理神经细胞24小时和用京尼平苷处理神经细胞不同时间之后神经细胞中AChE的活性，实验结果表明，京尼平苷可剂量和时间依赖的抑制神经细胞中的AChE活性，实验结果如附图3和附图4所示。
[0026]3、京尼平苷对AD转基因大鼠脑组织中AChE活性的抑制
为了考察京尼平苷在整体动物水平上对AChE活性的影响，我们在APP/PSN转基因AD小鼠上考察了京尼平苷对AChE活性的影响，在用京尼平苷连续灌胃给药4周之后，在麻醉状态下处死动物，取全脑匀浆，测定蛋白浓度之后，测定不同剂量的京尼平苷对AD模型小鼠脑内AChE活性的差异，结果表明，高剂量组京尼平苷可明显抑制AD模型小鼠脑内的AChE活性，表明京尼平苷对整体动物模型上的AChE也有一定的抑制作用。实验结果如见附图5所示。
[0027]本发明下述实施方案中，下述量的药物和其它组分是用标准制药技术合并在一起的。采用标准制药技术将所得制剂降入胶囊壳体或者压制成片。
[0028]实施例1:
胶囊制备方法:将京尼平苷和淀粉甘醇酸钠混合，然后加入十二烷基硫酸钠水溶液后进行湿法制粒。然后将该湿材料在流化床、干燥盘或其它适当干燥器中干燥。然后可将干燥的颗粒碾磨，以达到合适的粒径分布，之后与其它组分混合。然后将该混合物装入两片硬明胶胶囊壳体中。
[0029]鉬分毎粒中含量 京尼平苷40 mg 十二烷基硫酸钠5 mg
含水乳糖71 mg
硬脂酸镁4 mg
淀粉甘醇酸钠80 mg
胶囊总重量200 mg。
[0030]实施例2:
胶囊制备方法:用十二烷基硫酸钠水溶液将京尼平苷和淀粉甘醇钠制粒，随后将该湿料在流化床、干燥盘或其它适当干燥器中干燥，然后将干燥颗粒碾磨，以达到合适的粒径分布，之后与其它组分混合，最后按重量装入胶囊壳中。
[0031]鉬分毎粒中含量 京尼平苷40 mg 十二烷基硫酸钠5 mg
含水乳糖63 mg
滑石4 mg`
胶态二氧化硅4 mg
硬脂酸镁4 mg
淀粉甘醇酸钠80 mg
胶囊总重量200 mg。
[0032]实施例3:
片剂制备方法:用十二烷基硫酸钠水溶液将京尼平苷、淀粉甘醇钠和微晶纤维素制粒，随后将该湿料在流化床、干燥盘或其它适当干燥器中干燥，然后将干燥颗粒碾磨，以达到合适的粒径分布，将该混合物压制成片，如果需要，而将这些片剂包衣。
[0033]组^_每片中含暈 京尼平苷40 mg 十二烷基硫酸钠6 mg 微晶纤维素40 mg 淀粉甘醇钠60 mg 含水乳糖49 mg 硬脂酸镁5 mg 片剂总重量200 mg。