专利名称：微生物发酵生产乙酰胆碱酯酶的方法乙酰胆碱酯酶(acetylcholinesterase, EC3. I. I. 7,简写为AChE)是催化乙酰胆碱水解为胆碱和乙酸，在神经冲动传递过程中起重要作用，恢复突触后膜极化的酶。AChE分布广泛，参与细胞的发育和成熟，能促进神经元发育和神经再生(朱美财，生物化学与生物物理进展，1992)。乙酰胆碱酯酶作为生物酶制剂已经广泛应用于临床医学、环境监测，农业等行业中，但目前使用的AChE主要是从动植物中提取，虽然国内外对AChE的研究已久，但是我国微生物发酵生产AChE研究处于起步阶段，主要研究菌种选育及生理生化特性、酶活特性及基因克隆鉴定等基础性工作(周伯儒等，生物技术通讯，2012 ;吴明玮等，中国寄生虫学与寄生虫病杂志，2001 ;朱美财，生物化学与生物物理进展，1992)。关于微生物发酵生产AChE的产业化、规模化及应用还未见报道。微生物发酵生产AChE比从动植物中提取有很大的优势，微生物发酵工艺简单，可大规模生产；所需原料来源广泛；在常温常压的发酵方式下，生产成本低；而微生物代谢旺盛，产出率高，可以提高原料利用率，在节能方面有相当大的优势。这将有助于微生物发酵生产AChE的推广和应用。利用微生物发酵生产的AChE检测农药残留，检测疾病与治疗等领域具有深远的影响(周伯儒等，生物技术通讯，2012 ;匡培根等，中医杂志，1984);在生物传感器中利用的微生物发酵生产的AChE具有检测迅捷、灵敏度高、携带方便、操作简单，降低成本，提高工作效率等优点(刘辉等，食品安全质量检测学报，2010 ;张玉明等，环境化学，1986)。随着人类社会的发展，AChE应用于人类健康和环境保护等方面将越来越广泛。微生物发酵生产AChE具有广阔的开发潜力和应用前景。
本发明的目的是提供一种微生物发酵生产AChE的方法，该方法主要是微生物经过定向驯化后，在24 30°C液体发酵生产AChE的方法，这种生产方法获得的AChE粗酶液活性可以达到150U/ml，如再经过分离和纯化，可以得到不同浓度和纯度的酶制剂。该酶制剂应用操作简单、方便、快捷、成本低，提高工作效率。本发明所述的一种微生物发酵生产AChE的方法具体包括以下步骤(I)将产生乙酰胆碱酯酶的微生物进行6 10次活化，再经过产物定向驯化4 6次，使其在24 30°C环境条件下生长良好；(2)按常规方法将产物定向驯化后的AChE产生菌在24 30°C逐级扩大培养，制备成液体一级种子和二级种子；(3)将液体一级种子或二级种子，按发酵液体积的3 9%接种量接入液体发酵培养基中，在24 30°C培养60 114h时，即微生物发酵生产AChE结束；(4)将(3)的发酵液在4，000 8，OOOrpm离心收集液体；收集到的液体即为粗酶液；(5)根据不同需要和使用对象不同，将(4)得到的粗酶液进一步浓缩、分离纯化，制备成不同活性、纯度和剂型的酶制剂。本发明中使用的菌种来源于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)。初期活化和生长条件按菌种保藏单位提供的说明进行。微生物AChE产生菌株(例如，CGMCC编号1. 1114或I. 1108)。菌株先活化、定向驯化后，按本发明产酶条件发酵生产AChE，定向驯化后的菌株在4°C环境中可保存2个月，用10 25%甘油制成的菌悬液，在零下80°C条件下可以长期保藏。 0.035L,乳酸乙酯 0. 008 0. 012L。③液体种子培养基:酵母膏5. O 15. Og,蔗糖15. O 25. 0g, (NH4)2S042. O 8. OgjK2HPO4O. 5 2. OgjMgSO4 ·7Η20 0. 2 0. 8g,FeSO4. 7H20 O. 01 0. 05g,自来水 I. 0L,pH值自然，121°C高压蒸汽灭菌30min。④发酵产酶培养基:蔗糖15. O 25. Og,酵母膏5. O 15. Og,麦麸15. O 30. Og,(NH4)2SO4 3. O 9. 0g, K2HPO4 0. 5 I. 5g, MgSO4 · 7H20 O. 2 0. 8g, FeSO4 · 7H200. 01 0.05g,自来水I. 0L, pH值自然，121°C高压蒸汽灭菌30min。(2)将产生AChE的微生物按中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)提供的菌株说明进行6 10次活化，再经过产物定向驯化4 6次，使其在24 30°C环境条件下生长良好；(3)按常规方法将产物定向驯化后的AChE产生菌在24 30°C逐级扩大培养36 60h而后按5%的接种量进行逐级扩大培养，制备成液体一级种子和二级种子；(4)将(3)制备的二级种子，按发酵液体积的3 5%接种量接入10L液体发酵培养基中，在24 26°C培养96 114h时，即微生物发酵生产AChE结束；(5)将(4)的发酵液在4，000 8，OOOrpm离心收集到的液体，即为粗酶液；(6)根据不同需要和使用对象不同，将(5)得到的粗酶液进一步浓缩、分离纯化，制备成不同活性、纯度和剂型的酶制剂。实施例二 (I)培养基制备①菌种活化培养基葡萄糖5. 0g，蛋白胨10. 0g，牛肉膏3. 0g，NaCl 10.0g，蒸馏水I.OL, pH 值 7. 0，121°C 高压蒸汽灭菌 30min。②菌种定向驯化培养基牛肉膏15. O 25. Og,葡萄糖18. O Tl. 0g, K2HP043. O 6. 0g, (NH4)2SO4 4. O 6. 0g，MgS04. 7H20 O. 5 I. 5g，NaCl O. 3 O. 6g，FeSO4 ·7Η20 O. 01 —O.04g，蒸馏水1.0L，pH值自然，121 °C高压蒸汽灭菌30min，后加入三醋酸甘油酯O. 025 O.035L,乳酸乙酯 O. 008 O. 012L。③液体种子培养基酵母膏5. O 15. 0g，蔗糖15. O 25. 0g, (NH4)2SO4 2. O 8. 0g，K2HPO4 O. 5 2. 0g，MgS04 ·7Η20 O. 2 O. 8g，FeSO4. 7Η20 O. 01 O. 05g，自来水 I. 0L，pH值自然，121°C高压蒸汽灭菌30min。④发酵产酶培养基蔗糖15. O 25. Og,酵母膏5. O 15. Og,麦麸15. O 30. Og,(NH4)2SO4 3. O 9. 0g, K2HPO4 O. 5 I. 5g, MgSO4 · 7H20 O. 2 O. 8g, FeSO4 · 7H200. 01
0.05g,自来水I. 0L, pH值自然，121°C高压蒸汽灭菌30min。(2)将产生AChE的微生物按中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)提供的菌株说明进行6 10次活化，再经过产物定向驯化4 6次，使其在24 30°C环境条件下生长良好；(3)按常规方法将产物定向驯化后的AChE产生菌在24 30°C逐级扩大培养36 60h而后按5%的接种量进行逐级扩大培养，制备成液体一级种子和二级种子；(4)将(3)制备的二级种子，按发酵液体积的5 7%接种量接入50L液体发酵培养基中，在26 28°C培养78 96h时，即微生物发酵生产AChE结束；(5)将(4)的发酵液在4，000 8，OOOrpm离心收集到的液体，即为粗酶液；(6)根据不同需要和使用对象不同，将(5)得到的粗酶液进一步浓缩、分离纯化，制备成不同活性、纯度和剂型的酶制剂。实施例三(I)培养基制备①菌种活化培养基葡萄糖5. 0g，蛋白胨10. 0g，牛肉膏3. 0g，NaCl 10.0g，蒸馏水
1.0L, pH 值 7. 0,121°C高压蒸汽灭菌 30min。②菌种定向驯化培养基牛肉膏15. O 25. Og,葡萄糖18. O Tl. 0g, K2HP043. O
6.0g, (NH4) 2S044. O 6. OgjMgSO4. 7H20 0. 5 I. 5g，NaCl 0. 3 0. 6g, FeSO4 ·7Η20 O. 01
0.04g，蒸馏水I. 0L，pH值自然，121°C高压蒸汽灭菌30min，后加入三醋酸甘油酯0. 025
0.035L,乳酸乙酯 0. 008 0. 012L。③液体种子培养基酵母膏5. O 15. 0g，蔗糖15. O 25. 0g, (NH4)2SO4 2. O
8.0g，K2HPO4 0. 5 2. 0g，MgS04 ·7Η20 O. 2 0. 8g，FeSO4. 7Η20 O. 01 0. 05g，自来水 I. 0L，pH值自然，121°C高压蒸汽灭菌30min。④发酵产酶培养基蔗糖15. O 25. Og,酵母膏5. O 15. Og,麦麸15. O 30. Og,(NH4) 2S043. O 9. 0g，K2HPO4O. 5 I. 5g, MgSO4 ·7Η20 O. 2 0. 8g, FeSO4 ·7Η200· 01 0. 05g,自来水I. 0L, pH值自然，121°C高压蒸汽灭菌30min。(2)将产生AChE的微生物按中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)提供的菌株说明进行6 10次活化，再经过产物定向驯化4 6次，使其在24 30°C环境条件下生长良好；(3)按常规方法将产物定向驯化后的AChE产生菌在24 30°C逐级扩大培养36 60h而后按5%的接种量进行逐级扩大培养，制备成液体一级种子和二级种子；(4)将(3)制备的二级种子，按发酵液体积的7 9%接种量接入100L液体发酵培养基中，在28 30°C培养60 78h时，即微生物发酵生产AChE结束；(5)将(4)的发酵液在4，000 8，OOOrpm离心收集到的液体，即为粗酶液；(6)根据不同需要和使用对象不同，将(5)得到的粗 酶液进一步浓缩、分离纯化，制备成不同活性、纯度和剂型的酶制剂。


本发明所述的一种微生物发酵生产乙酰胆碱酯酶(简写为AChE)的方法是将产生AChE的微生物进行6～10次活化，再经过产物定向驯化4～6次，使其在24～30℃环境条件下生长良好；按常规方法将产物定向驯化后的AChE产生菌在24～30℃逐级扩大培养，按发酵液体积的3～9％接种量接入液体发酵培养基中，在24～30℃培养60～114h时，即微生物发酵生产AChE结束；发酵液在4,000～8,000rpm离心收集液体，收集的液体即为粗酶液；根据不同需要和使用对象不同，可以将粗酶液进一步浓缩、分离纯化，制备成不同活性、纯度和剂型的酶制剂。