专利名称：一种纳豆激酶发酵菌剂的制备方法利用纳豆激酶发酵菌剂发酵制备的食用纳豆富含纳豆激酶、异黄酮等功能因子， 对预防心脑血管疾病具有显著作用。纳豆激酶发酵菌剂的制备可实现纳豆小规模速酿生产，使纳豆成为价廉易制的保健食品。因此，纳豆激酶发酵菌剂的制备对于家庭化制备食用纳豆以及纳豆的工业化生产具有重要意义。
本发明的目的在于提供一种制备工艺简单、稳定性好，且能够达到批量生产的纳豆激酶发酵菌剂的制备方法。为了实现上述目的，本发明采用了以下技术方案(I)对纳豆芽孢杆菌进行活化得活化纳豆芽孢杆菌，将活化纳豆芽孢杆菌扩培得纳豆芽孢杆菌种子，将纳豆芽孢杆菌种子进行发酵得纳豆芽孢杆菌发酵液；(2)无菌条件下收集纳豆芽孢杆菌发酵液，对纳豆芽孢杆菌发酵液进行喷雾干燥， 即得纳豆激酶发酵菌剂。所述活化采用斜面培养基，斜面培养基的配方包括10 15g/L蛋白胨、4 6g/L 酵母膏、4 5g/L NaCl以及15 20g/L琼脂，斜面培养基的pH为7. 2 7. 5。所述活化的步骤为将纳豆芽孢杆菌接种于斜面培养基，于28 32°C培养20 30h，将培养后的菌种再次接种于斜面培养基，于28 32°C培养20 30h，即得活化纳豆芽孢杆菌。所述扩培采用种子培养基，种子培养基的配方包括10 15g/L蛋白胨、4 6g/L 酵母膏以及4 5g/L NaCl，种子培养基的pH为7. 2 7. 5。所述扩培的培养条件为150 200r/min、28 32°C下培养13 16h。所述发酵采用发酵培养基，发酵培养基的制备步骤为将干黄豆加入5倍量体积的水中(5mL水/g干黄豆)，于常温下浸泡8 14小时，然后转入高压锅中于121 126°C、 O. I O. 15Mpa下处理I小时，处理后滤除黄豆得豆水，用无菌水补足豆水体积至浸泡黄豆时的加水体积，然后加入Na2HPO4至终浓度为O. 2 O. 3g/L，再加入NaH2PO4至终浓度为 O. 2 O. 3g/L，调节pH至6. 5 7. 5，即得发酵培养基。所述发酵培养基的固形物含量为I. I I. 3%，总糖含量为O. 19 O. 25mg/mL。所述发酵的条件为接种量为3 6%，发酵温度为35 40°C，发酵罐通气量为 200 400L/h，发酵罐搅拌器转速为200 300r/min ;发酵开始后的9 12h、15 17h分别进行发酵培养基补料，补料量原始发酵液量的体积比=I 6，发酵20 24h后放罐， 无菌条件下收集纳豆芽孢杆菌发酵液，放罐时菌体湿重为27 30g/L。所述喷雾干燥的步骤为无菌条件下向发酵液中加入脱脂奶粉至终浓度为40 60g/L作为保护剂,然后利用喷雾干燥机进行喷雾干燥,喷雾干燥进口温度为120°C,出口温度为60 70°C，压缩机压力O. 2 O. 4MPa，无菌条件下收集固形物，即得纳豆激酶发酵菌剂。所述纳豆激酶发酵菌剂的活菌数大于6. 5X IO8个/克。与现有技术相比，本发明具有以下技术效果I、本发明公开的纳豆激酶发酵菌剂的制备方法发酵周期短，为20 24h，显著短于文献报道的最短发酵周期33h，在工业生产中可显著降低生产成本，提高生产效率。且发酵液中纳豆芽孢杆菌菌体浓度较高，达27 30g/L。所制备菌剂活菌数含量较高，大于 6. 5X108 个 / 克。2、本发明公开的纳豆激酶发酵菌剂的制备方法生产成本低。菌剂制备过程中，发酵培养基采用豆水培养基(可来源于豆制品生产废料)，取代传统工艺中葡萄糖等培养基原料，既节省了发酵培养基制备成本，减少了环境污染，又缩短了发酵周期。3、本发明公开的纳豆激酶发酵菌剂的制备方法，具有周期短、成本低、操作简便、 便于工业化生产等优点、稳定性及重现性都较好，所得菌剂活菌数大于6. 5 X IO8个/克，遗传稳定性能良好，发酵纳豆性能良好，适宜进行大规模生产。无菌条件下收集发酵液，加入脱脂奶粉至终浓度为40g/L作为保护剂，然后利用喷雾干燥机进行喷雾干燥，喷雾干燥进口温度为120°C，出口温度为60°C，无菌条件下收集固形物，即得纳豆激酶发酵菌剂，采用平板计数法计得活菌数为6. 9 X IO8个/克，发酵纳豆性能良好。实施例2 (I)纳豆芽孢杆菌的活化制备纳豆芽孢杆菌斜面培养基，斜面培养基的配方包括12g/L蛋白胨、5g/L酵母膏、4g/L NaCl以及17g/L琼脂，斜面培养基的pH为7. 3，接种保藏的纳豆芽孢杆菌于斜面培养基，30°C培养25h，将培养后的菌种再次接种于斜面培养基，30°C下培养25h，即得活化纳豆芽孢杆菌；(2)纳豆芽孢杆菌的扩培制备纳豆芽孢杆菌种子培养基，种子培养基的配方包括12g/L蛋白胨、5g/L酵母膏以及4g/L NaCl，种子培养基的pH为7. 3，接种活化纳豆芽孢杆菌于种子培养基，ISOr/ min、30°C培养15h，即得纳豆芽孢杆菌种子液；(3)纳豆芽孢杆菌发酵培养基的制备取600g干黄豆加3000mL水浸泡14小时，然后转入高压锅于122°C，0. IMpa下处理I小时,处理后滤除黄豆得豆水,用无菌水补足豆水至3000mL，然后加入Na2HPO4至终浓度为O. 2g/L，再加入NaH2PO4至终浓度为O. 2g/L，调节pH至7. O,即得发酵培养基，发酵培养基的固形物含量为I. 3%，总糖含量为O. 21mg/mL ；(4)纳豆芽孢杆菌的发酵取种龄为15h的纳豆芽孢杆菌种子液120mL接种于3000mL发酵培养基进行发酵，发酵温度为37°C、发酵罐通气量350L/h，发酵罐搅拌器转速为280r/min，发酵开始后的 10h、17h分别进行发酵培养基补料(单次补料量500mL)，发酵22h后放罐，放罐时菌体湿重为 29. 7g/L ；(5)纳豆芽孢杆菌的干燥无菌条件下收集发酵液，加入脱脂奶粉至终浓度为50g/L作为保护剂，然后利用喷雾干燥机进行喷雾干燥，喷雾干燥进口温度为120°C，出口温度为65°C，无菌条件下收集固形物，即得纳豆激酶发酵菌剂，采用平板计数法计得活菌数为7. 5 X IO8个/克，发酵纳豆性能良好。实施例3 (I)纳豆芽孢杆菌的活化制备纳豆芽孢杆菌斜面培养基，斜面培养基的配方包括15g/L蛋白胨、6g/L酵母膏、5g/L NaCl以及20g/L琼脂，斜面培养基的pH为7. 5，接种保藏的纳豆芽孢杆菌于斜面培养基，32°C培养30h，将培养后的菌种再次接种于斜面培养基，32°C下培养30h，即得活化纳豆芽孢杆菌；(2)纳豆芽孢杆菌的扩培制备纳豆芽孢杆菌种子培养基，种子培养基的配方包括15g/L蛋白胨、6g/L酵母膏以及5g/L NaCl，种子培养基的pH为7. 5，接种活化纳豆芽孢杆菌于种子培养基，200r/ min、32°C培养16h，即得纳豆芽孢杆菌种子液；(3)纳豆芽孢杆菌发酵培养基的制备取1200g干黄豆加6000mL水浸泡10小时，然后转入高压锅于124°C，O. 15Mpa下处理I小时,处理后滤除黄豆得豆水,用无菌水补足豆水至6000mL，然后加入Na2HPO4至终浓度为O. 2g/L，再加入NaH2PO4至终浓度为O. 2g/L，调节pH至7. O,即得发酵培养基，发酵培养基的固形物含量为I. 29%，总糖含量为O. 25mg/mL ；(4)纳豆芽孢杆菌的发酵取种龄为16h的纳豆芽孢杆菌种子液240mL接种于6000mL发酵培养基进行发酵， 发酵温度37°C、发酵罐通气量300L/h，发酵罐搅拌器转速为250r/min，发酵开始后的12h、 17h分别进行发酵培养基补料(单次补料量IOOOmL)，发酵24h后放罐，放罐时菌体湿重为 30.Og/L ；(5)纳豆芽孢杆菌的干燥无菌条件下收集发酵液，加入脱脂奶粉至终浓度为60g/L作为保护剂，然后利用喷雾干燥机进行喷雾干燥，喷雾干燥进口温度为120°C，出口温度为60°C，无菌条件下收集固形物，即得纳豆激酶发酵菌剂，采用平板计数法计得活菌数为7. OX IO8个/克，发酵纳豆性能良好。实施例4 (I)纳豆芽孢杆菌的活化制备纳豆芽孢杆菌斜面培养基，斜面培养基的配方包括10g/L蛋白胨、6g/L酵母膏、4g/L NaCl以及15g/L琼脂，斜面培养基的pH为7. 5，接种保藏的纳豆芽孢杆菌于斜面培养基，28°C培养30h，将培养后的菌种再次接种于斜面培养基，28°C下培养30h，即得活化纳豆芽孢杆菌；(2)纳豆芽孢杆菌的扩培制备纳豆芽孢杆菌种子培养基，种子培养基的配方包括10g/L蛋白胨、6g/L酵母膏以及4g/L NaCl、种子培养基的pH为7. 5，接种活化纳豆芽孢杆菌于种子培养基，150r/ min、32°C培养13h，即得纳豆芽孢杆菌种子液；(3)纳豆芽孢杆菌发酵培养基的制备取20g干黄豆加IOOmL水浸泡9小时，然后转入高压锅于126°C，0. 15Mpa下处理 I小时，处理后滤除黄豆得豆水，用无菌水补足豆水至IOOmL,然后加入Na2HPO4至终浓度为 0. 3g/L，再加入NaH2PO4至终浓度为0. 3g/L，调节pH至6. 5，即得发酵培养基，发酵培养基的固形物含量为I. I %，总糖含量为0. 19mg/mL ；(4)纳豆芽孢杆菌的发酵取种龄为13h的纳豆芽孢杆菌种子液3mL接种于IOOmL发酵培养基进行发酵，发酵罐通气量为400L/h，发酵温度为35°C、发酵罐搅拌器转速为200r/min，发酵开始后的9h、 15h分别进行发酵培养基补料(单次补料量为16. 7mL)，发酵20h后放罐，放罐时菌体湿重为 27g/L ；(5)纳豆芽孢杆菌的干燥无菌条件下收集发酵液，加入脱脂奶粉至终浓度为40g/L作为保护剂，然后利用喷雾干燥机进行喷雾干燥，喷雾干燥进口温度为120°C，出口温度为70°C，无菌条件下收集固形物，即得纳豆激酶发酵菌剂，采用平板计数法计得活菌数为6. 6 X IO8个/克，发酵纳豆性能良好。实施例5 (I)纳豆芽孢杆菌的活化制备纳豆芽孢杆菌斜面培养基，斜面培养基的配方包括15g/L蛋白胨、4g/L酵母膏、5g/L NaCl以及20g/L琼脂，斜面培养基的pH为7. 2，接种保藏的纳豆芽孢杆菌于斜面培养基，32°C培养20h，将培养后的菌种再次接种于斜面培养基，32°C下培养20h，即得活化纳豆芽孢杆菌；(2)纳豆芽孢杆菌的扩培制备纳豆芽孢杆菌种子培养基，种子培养基的配方包括15g/L蛋白胨、4g/L酵母膏以及5g/L NaCl、种子培养基的pH为7. 2，接种活化纳豆芽孢杆菌于种子培养基，200r/ min、28°C培养16h，即得纳豆芽孢杆菌种子液；(3)纳豆芽孢杆菌发酵培养基的制备取20g干黄豆加IOOmL水浸泡12小时，然后转入高压锅于126°C，O. 15Mpa下处理 I小时，处理后滤除黄豆得豆水，用无菌水补足豆水至IOOmL,然后加入Na2HPO4至终浓度为 O. 25g/L，再加入NaH2PO4至终浓度为O. 25g/L，调节pH至7. 5，即得发酵培养基，发酵培养基的固形物含量为I. 3 %，总糖含量为O. 25mg/mL ；(4)纳豆芽孢杆菌的发酵取种龄为16h的纳豆芽孢杆菌种子液6mL接种于IOOmL发酵培养基进行发酵，发酵罐通气量为400L/h，发酵温度为40°C、发酵罐搅拌器转速为300r/min，发酵开始后的9h、 15h分别进行发酵培养基补料(单次补料量为16. 7mL)，发酵24h后放罐，放罐时菌体湿重为 27g/L ；(5)纳豆芽孢杆菌的干燥无菌条件下收集发酵液，加入脱脂奶粉至终浓度为60g/L作为保护剂，然后利用喷雾干燥机进行喷雾干燥，喷雾干燥进口温度为120°C，出口温度为60°C，无菌条件下收集固形物，即得纳豆激酶发酵菌剂，采用平板计数法计得活菌数为6. 6 X IO8个/克，发酵纳豆性能良好。
本发明公开了一种纳豆激酶发酵菌剂的制备方法。该方法包括纳豆芽孢杆菌的活化、纳豆芽孢杆菌的扩培、纳豆芽孢杆菌发酵培养基的制备、纳豆芽孢杆菌的发酵、纳豆芽孢杆菌的干燥等工艺，该方法具有周期短、成本低、工艺简单、便于工业化生产等优点，稳定性及重现性都较好，所得菌剂活菌数大于6.5×108个/克，发酵性能良好，适宜进行大规模生产。本发明对纳豆激酶发酵菌剂的工业化生产、家庭化制备食用纳豆以及纳豆的工业化生产具有重要意义。