专利名称：苏云金芽胞杆菌cry1Ca基因，表达蛋白及其应用的制作方法苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis，简称Bt)是ー种分布广泛的革兰氏阳性細菌，是ー种对害虫毒力强且对天敌无毒性的昆虫病原微生物，对高等动物和人无毒性。它是目前研究最为深入、使用最为广泛的微生物杀虫剂，对16个目3000多种害虫有活性。Bt在芽胞形成期可形成杀虫晶体蛋白(Insecticidal CrystalProteins, ICPs)， 也称δ-内毒素(delta-endotoxin)，它的形状、结构和大小均与其毒力有着密切关系 [Schnepf. E, Crickmore. N, Van Rie. J. , Lereclus. D, Baum. J, Feitelson. J, Zeigler. D. R., Dean. D. H. Bacillus thuringiensis and its pesticidal crystal proteins. Microbiol. Mol. Biol. Rev, 1998,62(3) :775-806.]。自 1981 年 khn印f 等克隆了 Bt 的第一个 ICPs 基因，并于1985年发表了它的DNA碱基序列及其编码蛋白的氨基酸序列起，目前(2011年10 月)已发现种杀虫晶体蛋白605种，被分为70类cry蛋白和2类cyt蛋白。当今，采用喷施化学农药防治手段固然可以减轻害虫对农作物的为害，但化学农药造成环境污染，长期以来，大量喷施化学杀虫剂，不仅会增强害虫的抗药性，使益虫及其它生态区系遭受破坏， 而且严重污染环境，提高生产成本，破坏生态平衡。苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白因其杀虫效果好、安全、高效等优点而被广泛的应用于虫害防治。苏云金芽胞杆菌除了直接作为生物农药以外，1996年全世界第一例转基因抗虫植物在美国获准应用，它使用的基因来自Bt cryIAc。在接下来的几年里，转cryIAb基因的抗虫玉米，转cry3Aa基因的抗虫土豆等相距问世。在中国，自1998年开始正式推广含有crylAc/cryIAb基因的抗虫棉以来，已经被普遍种植。在转基因作物商业化的第一个12年(1996-2007)中，由于能得到持续稳定的收益， 农民种植转基因作物量逐年増加。2010年，25个国家种植了转基因作物，全球转基因作物累计种植面积超过十亿公顷，19个为发展中国家，排名前十位的国家种植面积都超过100 万公顷，其中，有8个是发展中国家，90%都是小型农户。同吋，有30多个国家新近批准种植转基因作物，日本、新加坡等国家批准进ロ转基因农作物。总的来说，已经有59个国家同意种植或进ロ转基因产品，中国则批准了所有的商业化生物技木，2010我国种植转基因作物350万公顷，排世界第六。转基因作物商业化给エ业化国家和发展中国家的农民都带来了经济和环境效益。苏云金芽胞杆菌及其基因发掘已成为可持续发展农业中重要课题。由于目前商品化的转基因抗虫作物的抗虫基因种类比较单一，如此大面积推广种植存在害虫避难所减少与害虫抗药性上升的风险。因此需要不断分离高毒力的或者新的基因組合来避免害虫抗药性上升的风险。因此，筛选分离克隆新的、高毒力的Bt杀虫基因，可以丰富杀虫基因资源，为转基因作物与工程菌株提供新的基因来源，提高Bt转基因产品的抗虫效果，并且可以降低害虫对Bt毒蛋白的抗性风险，避免新的生态灾难降临，具有重要的经济、社会和生态效益。
本发明提供ー种对鳞翅目害虫小菜蛾、甜菜夜蛾高毒力的苏云金芽胞杆菌 LB-R-78，及其杀虫新基因CrylCal3基因和其晶体杀虫蛋白，以应用于转化微生物和植物， 使之表现出对相关害虫的毒性，并克服、延缓害虫对工程菌和转基因植物的抗药性产生。苏云金芽胞杆菌菌株LB-R-78，其保藏编号为CGMCC No. 5567。苏云金芽胞杆菌菌株LB-R-78在杀杀灭小菜蛾，棉铃虫，甜菜夜蛾中的应用。杀虫蛋白CrylCal3，其氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示。crylCal3基因，编码杀虫蛋白CrylCal3。优选其核苷酸序列如SEQ ID NOl所示。ー种表达载体，其特征是含有crylCal3基因。所述表达载体为pEB-crylCa，其骨架载体为pEB，其结构如图6所示。所述表达载体为pSTK-crylCa，其骨架载体为pSTK，其结构如图7所示。ー种微生物转化体，其特征是含有crylCal3基因。crylCal3基因在杀灭小菜蛾，棉铃虫，甜菜夜蛾害虫中的应用。所述应用是将CrylCal3基因表达的蛋白作为生物杀虫剂的有效成分。本发明从辽宁千山圆通观附近土壌中分离得到一株苏云金芽胞杆菌菌株 LB-R-78，其保藏编号为CGMCC No. 5567，该菌株生物学特性为在生长周期中可以产生芽胞， 并且同时产生有毒杀鞘翅目害虫作用的伴胞晶体，其对小菜蛾具有很强的杀灭能力；从该菌株中得到ー个新基因的阳性克隆，即pEB-crylCa (见图6)，对其进行测序分析，发现克隆 crylCa中含有3573个碱基，见SEQ ID NOl，编码1191个氨基酸，见SEQ ID N02。与已发表的基因相比，与crylCa5相似性最高，相差5个氨基酸；从上述阳性克隆提取质粒，转入受体菌，得到表达菌株，測定基因的表达蛋白的活性，基因crylCa表达的蛋白对小菜蛾，甜菜夜蛾的初筛生测结果为校正死亡率为100%，见表1。crylCal3基因可按生物技术的常规方法转化微生物、植物，表现出对相关鳞翅目害虫的毒性。将上述基因转化菌株，表达得到的蛋白可以制成生物农药用于杀死鳞翅目害虫。 同吋，可以转入植物构建抗虫转基因植物，用于害虫的防治。本发明分离克隆的Bt crylCal3基因序列及其基因表达产物能够对鞘翅目害虫产生强毒力，特別是对小菜蛾有高活性，是很好的生物杀虫基因，有很广泛的应用前景。通过该crylCal3基因与crylAc、cryIAb, crylBa、cry2Ab等基因表达产物组合，可扩大对鳞翅目害虫的虫谱。通过应用于转化微生物和植物，使它们表现出对相关害虫的毒性，可克服或延缓昆虫对工程菌和转基因植物抗药性的产生。菌株保藏信息菌种分类命名苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)保藏机构中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏日期2011年12月12日保藏编号CGMCCNo. 556图1光学显微镜下观察菌株LB-R-78菌体的形态，图2电镜下菌株LB-R-78菌体形态图3含有目的基因的基因组PCR鉴定，其中1 菌株 LB-R-78PCR-RFLP 结果，2 菌株LB-R-78PCR扩增产物M =Marker (100, 200、500、750、1000、2000bp)图4crylCal3基因全长PCR结果M :Marker(300、500、800、1500、2000、3000、5000bp)，1 :pEB_crylCa质粒 DNA 的 Sal I 消化产物；2 :pEB-crylCa 质粒 DNA 的 Sma I/Sal I 消化产物；3 :pEB_crylCa 质粒 DNA 3. 6kb全长扩增产物；4，5 :pSTK-cry ICa酶切图谱图5crylCal3基因在大肠杆菌中表达蛋白的SDS-PAGE其中a为pEB-crylCa重组质粒的表达，b为pSTK-crylCa重组质粒的表达。M 蛋白高分子量 marker (200，116，97，66，44kDa)，1 :IPTG 诱导的 pEB-crylCa 可溶组分；2 =IPTG诱导的pEB空载体可溶组分；3 =IPTG诱导的pEB-crylCa非可溶组分；4 IPTG诱导的pEB空载体非可溶组分；5，6 =BSA ；7 :pSTK-crylCa重组质粒在Bt无晶体突变株中的表达图6pEB_crylCa结构示意图，图 7pSTK_crylCa 结构示意图。7J ο生物学測定表明，对小菜蛾、甜菜夜蛾的初筛生测结果为校正死亡率为100%。实施例2.获得新基因2. 1利用cryl类基因通用引物检测菌株LB-R-78，引物如下

本发明涉及“苏云金芽胞杆菌cry1Ca13基因，表达蛋白及其应用”，属于生物防治技术领域。杀虫蛋白，具有如SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列，及编码该杀虫蛋白的基因，优选所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO1所示。上述基因对鳞翅目害虫具有高毒力，以应用于转化微生物和植物，使之表现出对相关害虫的毒性，并克服、延缓害虫对工程菌和转基因植物的抗药性产生。