专利名称：系统性红斑狼疮检测试剂盒的制作方法系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus, SLE)是一种较为常见的自身免疫性疾病，其特征为多种自身抗体的产生及免疫复合物的形成，最终由于针对自身的免疫反应造成几乎全身各个系统的损害如循环系统、泌尿系统、消化系统以及中枢神经系统的病变。SLE的病因和发病机制尚未完全明了，目前认为该病属于多基因遗传病，遗传因素及环境因素共同参与本病的发生、发展过程。SLE好发于女性，特别是育龄期妇女，累及心、 脑、肾等全身多个重要脏器。据估计，目前我国有SLE患者100多万人，平均患病率位居全球第二位。众多研究发现，该疾病具有较高的遗传倾向，通过分子诊断检测与SLE发生密切相关的基因位点就可以提前评估受检者患SLE的风险，提早预防和治疗。细胞毒性T 淋巴细胞相关抗原 4 (cytotoxic T lymphocyte associated antigen4, CTLA-4)是活化T细胞表面所表达的一种膜融合蛋白，对T细胞的活化起关键的负性调节作用，因此CTLA-4基因成为自身免疫性疾病的一个侯选易感基因。研究数据显示，CTLA-4基因第I外显子A49G多态性除了与SLE的发生密切相关外，还与Graves眼病、白癜风、自身免疫甲状腺病等相关。2004年徐安平等对中国南方地区人群研究结果显示CTLA4基因-1722T/C位点多态性与SLE明显相关，SLE患者TC基因型频率明显高于正常对照组。2009年孟炜课题组对中国南方人群研究发现CTLA-4基因-1722T/C位点与SLE 相关，病例组和对照组T/T、C/T、C/C基因型频率有显著差异，SLE患者TT基因频率明显升高。国内外的临床研究数据显示，CTLA-4基因-1722T/C位点多态性除了与SLE的发生密切相关外，还可以作为白癜风、乳腺癌等多种疾病发生的独立危险因素。亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)基因是叶酸代谢中的关键基因之一，维持正常的同型半胱氨酸水平。徐晓龔等2007年测定了 54例SLE患者和62例正常对照者的Hey、 VitB12叶酸的水平，并检测MTHFR基因677位的多态性。结果显示疾病组CC基因型频率显著低于正常对照组，总的突变T等位基因频率显著高于对照组。2009年，冯磊光等人对52 例SLE患者(男5例，女47例；平均年龄37 14. 34岁)及78例年龄性别相匹配的健康对照者(男8例，女70例；平均年龄34±8. 53岁)作病例-对照研究。结果发现，研究人群中MTHFR 677TT纯合变异型及T等位基因在SLE患者中显著增多，MTHFR基因677TT纯合变异与SLE的发病有关，是SLE的危险因素。CTLA4基因上A49G和T_1772C、MTHFR基因上C677T的3个SNPs可以作为SLE的独立危险因素进行基因检测。因此，建立简单、快速的系统性红斑狼疮易感基因检测方法，及时筛查出易患系统性红斑狼疮的高危人群，有针对性的进行健康指导，对于保障人类安全健康具有非常重要的意义。
基于CTLA4基因上A49G和T_1772C、MTHFR基因上C677T的3个SNPs位点基因型可用来评估系统性红斑狼疮发病风险级别，本发明提供一种系统性红斑狼疮基因检测试剂盒。该试剂盒包括检测CTLA4基因上A49G和T_1772C、MTHFR基因上C677T的3个SNPs位点基因型的特异性引物对及DNA测序引物；PCR反应组件(包括Taq酶、dNTP混合液、反应缓冲液、ddH20等)；PCR产物纯化组件(包括SAP酶、ExoI酶、ddH20等);DNA测序反应组件(包括BigDye mix，EDTA溶液、100%乙醇溶液、70 %乙醇溶液、 HIDI 溶液、ddH20 等)。本发明试剂盒的组分和含量包括PCR 反应体系10 X PCR 反应缓冲液 2. 5ul ；25mM dNTP 混合液 O. 2ul ；5U/ul Taq DNA聚合酶O. 125ul ;20uM特异性引物对(每条引物各O. 25ul) ；ddH2019. 175ul。PCR 产物纯化体系lU/ul SAP 酶 O. 75ul ;10U/ul ExoI 酶 O. 375ul ; ddH203. 875ul。测序反应体系25%BigDye mix lul ；3. 2uM DNA 测序引物 lul ;125mMEDTA 溶液 lul ; 100% 乙醇溶液 15ul ;70% 乙醇溶液 30ul ;HIDI 溶液 8ul ;ddH202ul。本试剂盒供一人份检测使用，试剂盒的保存温度为-20°C。PCR扩增的反应体系为10 X PCR反应缓冲液2. 5μ I ;25mM的dNTP混合液O. 2 μ I、 5U/ul Taq酶O. 125 μ 1、DNA模板 I μ I (12_15ng左右)、20uM正向引物反向引物各 O. 25 μ I、 ddH20 19. 175μ I ；反应条件为94°C 4分钟变性和酶激活，94°C 30秒变性，55°C 30秒退火，72°C I 分钟延长，循环28次，最后72°C延长5分钟以上。3、PCR扩增产物纯化使用检测试剂盒中的PCR产物纯化组件，反应体系为总体积25ul，包含PCR产物 20ul, lU/ul SAP 酶 0.75ul，10U/ul ExoI 酶 O. 375ul，去离子水 3. 875ul。在ABI2720型PCR扩增仪上进行反应，反应条件为37°C、15min，72°C、20min。4、DNA测序反应使用检测试剂盒中的测序反应组件，其中，含有下列DNA测序引物(1)CTLA4(A49G)测序引物5’ -CTGAACACCGCTCCCATAAA-3’(2)CTLA4(T-1772C)测序引物5，-CACAGAAGCAAAGAACCCAT-3，(3)MTHFR(C677T)测序引物5’ -AGGGAGGCTTCAACTACGC-3’反应的体系为总体积5ul，包含PCR纯化产物Iul，25% Bigdye mixlul,3. 2uMDNA 测序引物Iul，去离子水2ul。在ABI2720型PCR扩增仪上进行反应，反应条件为98°C 2min，进行25个循环的 960C 30s, 550C 30s, 60°C 4min。反应结束后加入125mM EDTA溶液Iul和100 %乙醇溶液15ul，于室温下沉淀 15min ;在4°C, 3600rpm/min的转速离心30min,轻轻倒去上清液；加入70%乙醇溶液30ul, 3600rpm/min离心15min,轻轻倒去上清液；室温放置20min后加入HIDI溶液8ul,放入测序仪中。5、基因型分析熟悉DNA测序技术的本领域技术人员能够通过辨识DNA测序图谱确定所检测的 SNP位点的基因型。实施例2.为人群进行系统性红斑狼疮基因检测的服务I.采样及抽提DNA由医院检验科医师指导受检者使用口腔采样拭进行口腔上皮细胞取样，采用酚氯仿法进行口腔上皮细胞的DNA抽提。2.基因型检测使用本发明提供的试剂盒，对受检者基因组DNA的CTLA4基因上A49G和T_1772C、 MTHFR基因上C677T的3个SNPs位点分别进行DNA测序，确定这3个SNPs位点的基因型。3.系统性红斑狼疮基因高危人群风险评估分析通过对受检者SNPs基因型的分析，出具系统性红斑狼疮风险评估分析报告单。报告中详细说明了受检者CTLA4基因上A49G和T-1772C、MTHFR基因上C677T的SNP位点基因检测信息以及遗传风险评估结果。除此之外，根据受检者的风险级别，并由医师向受检者详细说明和解读系统性红斑狼疮基因检测报告单。
本发明提供了一种检测系统性红斑狼疮基因突变位点方法，检测探针以及检测试剂盒。该试剂盒包括检测CTLA4基因上A49G和T-1772C、MTHFR基因上C677T的3个单核苷酸多态性位点基因型的特异性引物与检测探针、PCR反应组件、PCR产物纯化组件、DNA测序反应组件等。本发明的试剂盒通过检测与系统性红斑狼疮发生密切相关的3个单核苷酸多态性位点的基因型，从基因层面来评估系统性红斑狼疮的风险级别，提早预防系统性红斑狼疮的发病。本发明采样方法是口腔黏膜细胞采样，无痛、无创、避免了交叉感染。测序检测结果准确，可靠，不必购置价格昂贵的进口专用仪器，方法易普及推广。