专利名称：鸡马立克氏病病毒miRNA缺失疫苗株及其应用的制作方法鸡马立克氏病(MD)是一种严重危害养禽业发展的高度传染性、肿瘤性疾病。该病可引起鸡发生多发性淋巴瘤，导致鸡只衰竭、死亡。同时损伤鸡体的免疫器官，产生严重的免疫抑制，易并发其他疾病。该病病程较长，并且发生该病后常导致整个鸡群的淘汰，一旦发生该病，损失往往特别巨大。疫苗是控制该病的主要手段，在种鸡群、蛋鸡群中MD疫苗是必须使用的疫苗，肉鸡群中使用该疫苗可以较大幅度地提高养殖效率。MD的病原-马立克氏病毒(MDV)毒力呈不断演化的趋势。近些年，随着MDV更强毒力毒株的出现，尤其是特超强毒的出现，现有的疫苗毒株，包括广泛应用的HVT、CVI988疫苗株不能对其进行良好的保护。在我国不同地区的养鸡场中，MD疫苗免疫鸡群常有MD的发生。最近的报道表明，即使应用最新型的MDV疫苗，一些MDV强毒株也能引起免疫鸡群发生接近50%的MD死亡率。我们研究组最近几年连续从现地MD免疫失败的养鸡场分离到20多株MDV强毒株，对其中部分毒株的免疫攻毒试验表明，有些毒株可以突破HVT疫苗、HVT+SB1双价疫苗以及血清1型的CVI988疫苗的免疫保护，证明我国流行的MDV野毒的毒力在逐步的提高， 现有的所有MD疫苗均不能提供有效保护。因此，迫切需要研制新的MD疫苗毒株，以便有效防控MDV。疱疹病毒可利用其自身编码的miRNA进行基因调控，最近的研究证实由MDV编码的3-6个miRNA在基因表达的调控作用对MDV的致瘤作用起到重要作用，其中一些miRNA 所针对的一些重要蛋白或转录因子都是对MDV致瘤起重要作用的。血清1型MDV编码的14个miRNA基因(分别命名为mdv_miR-Ml、mdv-miR-M2......mdv_miR-M14，其中部分miRNA基因的位置如附图10所示。)全部位于病毒基因组的反转重复序列区中，并形成3个明显的miRNA基因簇。第一个基因簇miRNA 位于TRL/IRL重复序列区中、紧邻Meq基因上游、与R-LORF 8转录物反向；第2个基因簇 miRNA主要位于IRS/TRS重复序列与病毒潜伏感染相关基因转录物(latency-associated transcript, LAT)的内含子中；第3个基因簇位于Ll/LORFfe阅读框中。MDVl编码的miRNAs 的高水平表达和潜在的致瘤宿主miRNAs的确定了 miRNAs在MDV的致病和肿瘤转化过程中起重要的作用。与血清I型miRNA相比，血清II型MDV编码的绝大部分miRNA都位于TRL/ IRL重复序列一段长约4. 2kb的区域中，聚集形成一个较大的基因簇，而MDV2-miR-17则单独位于mS/TRS重复序列中ICP4的ORF中，但转录方向正好与之相反。HVT(血清III型 MDV)编码的miRNA的基因组织形式与血清II型miRNA非常相似，几乎全部位于TRL/IRL重复序列区中，形成一个明显的miRNA基因簇。一系列研究表明，MDV编码的miRNAs很可能是病毒致肿瘤作用的重要的转录阶段的调控因子，对它的研究可进一步揭示MDV的致肿瘤机制。本研究为了验证MDV-I编码的miRNA与MDV致瘤性的关系，重组病毒 rMSAmiR9-12的构建成功为研究MDV致瘤机制和基因功能提供一个新的平台。本研究采用基因工程手段以带有β -半乳糖苷酶(LacZ)报告基因并缺失Meq基因的重组MDV流行毒株rMS Δ Meq为亲本病毒，通过反向同源重组方法，对MDV-1的Meq基因上游部分第一簇miRNA进行缺失，构建重组病毒rMS AmiR9-12。在研究其致病性和免疫原性的基础上，筛选适合的MD疫苗毒株，以期获得对流行的MDV强毒具有更好免疫保护效果的疫苗。
本发明所要解决的技术问题是克服现有弱毒疫苗的不足，提供一种新的鸡马立克氏病病毒基因缺失疫苗株，该株可以有效预防鸡马立克氏病，并具有分子标记，利于免疫鸡群的野毒感染和免疫监控，用该疫苗株所制备的疫苗对目前我国流行的鸡马立克氏病病毒的攻击可以提供良好的免疫保护效力。本发明所要解决的技术问题之一是构建了缺失鸡马立克病病毒致肿瘤相关的 miRNA重组马立克氏病毒，从而提供一种马立克氏病病毒基因缺失疫苗株；本发明提供的鸡马立克氏病病毒miRNA基因缺失疫苗株，其特征在于所述的miRNA基因缺失疫苗株为rMSAmiR9-12株，分类命名为禽疱疹病毒2型(feillid herpesvirus 2)，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址在北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所，其微生物保藏号是CGMCC No. 4613。保藏日期为2011年2月24日。本发明所要解决的技术问题之二是提供了制备该基因缺失疫苗株的方法其特征在于缺失MDV-I的Meq基因上游部分第一簇miRNA，尤其是通过同源重组的方法构建了缺失 mdv-miR-M9、mdv-miR-M5 和 mdv_miR-M12 的重组马立克病毒株 mdv-miR-M9-12,命名为 rMSAmiR9-120本发明的基因缺失疫苗株是以带有半乳糖苷酶报告基因并缺失meq基因的重组MDV流行毒株rMS-LacZ Δ Meq为亲本毒株。所述的miRNA基因缺失疫苗株在可用于制备防治鸡马立克氏病疫苗。本发明的一种预防鸡马立克氏病的疫苗组合物，其特征在于由有效量的权利要求 1所述的miRNA基因缺失疫苗株和药学上接受的载体或佐剂组成。具体的，本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的制备本发明的缺失鸡马立克病病毒致肿瘤相关的miRNA的重组马立克氏病病毒是通过以下手段得到的重组病毒转移载体质粒构建、亲本病毒感染CEF总DNA和载体质粒 DNA共转染经蚀斑筛选和纯化获得重组病毒-rMSAmiR9-12并鉴定、重组病毒生物学特性及免疫保护效力分析。本发明的缺失鸡马立克病病毒致肿瘤相关的miRNA的基因缺失疫苗株的制备，包括以下步骤1、重组病毒转移载体质粒构建设计并体外合成用于扩增同源臂和重组鉴定引物，通过PCR方法获得MS株 mdv-miR-M9前面927bp的C片段和mdv_miR-M12后面2735bp的D片段，然后将片段C和PUC19载体用Me I和)(ba I酶切、连接获得质粒PUC19-C，再将D片段和质粒PUC19-C用 Xba I和HindIII酶切、连接获得重组病毒的转移载体质粒PUC19-C-D (简写pUCXD)。连接后的质粒pUCXD用酶切和PCR方法进行鉴定，并送测序鉴定。2、重组病毒-rMSAmiR9_12的获得及鉴定提取亲本病毒rMS-LacZAMeq株的总DNA，用紫外分光光度计进行定量。转移载体质粒pUCCD进行中提质粒及纯化，同时也用紫外分光光度计进行定量。将8 IOug的母本病毒总DNA与1 2ug的重组病毒转移载体质粒共转染CEF。培养4 6d待出现MDV 典型蚀斑后，倒掉培养液，加20 μ L终浓度为0. 2mg · mL-1的Bulo-Gal染色，37°C,5% CO2 中培养，显微镜下观察选择白色病毒蚀斑用0. 25%的胰酶消化，加入长成单层的CEF中， 37°C，5%C02继续培养，待长出蚀斑后，再次纯化。直到克隆后所有的蚀斑都为白色。将纯化的重组病毒接种原代CEF上，待蚀斑生长到70%时收获细胞，提取重组病毒的总DNA ；以提取的重组病毒的总DNA为模板，进行PCR鉴定。再以NCBI上Md5株基因序列设计引物 P4进行PCR扩增，产物连接到pMD-18T载体上，测序鉴定，经测序鉴定纯化的病毒命名为 rMSAmiR9-1203、重组病毒生物学特性稳定试验是重组病毒在体外连续传10代并检测LacZ表达情况；相同的生长条件下亲本病毒MS株和重组病毒rMSAmiR9-12株，在显微镜下观察体外生长特性蚀斑大小、折光性、形状和形态的变化情况；1日龄SPF鸡腹腔接种重组病毒rMSAmiR9-12每只 20000PFU进行致病性试验，每天观察鸡的精神状态和有无马立克临床症状，15周龄后全部剖杀，观察病理组织变化，同时进行病理学检测、AGP检测及提取羽髓DNA，进行实时荧光定量PCR检测羽髓中的病毒含量。4、重组病毒免疫保护效力分析将重组病毒免疫1日龄SPF鸡，免疫后7天接种超强毒Md5进行攻毒，同时设置重组病毒免疫不攻毒组、814免疫组、814株免疫攻毒组、不免疫只攻毒组、空白对照组。观察并记录鸡群临床症状、死亡情况，并计算疫苗保护指数。
图1为本发明提供的载体质粒pALadB示意图；图2为本发明提供的质粒pALadB酶切鉴定结果；图3为本发明提供的重组病毒rMS-LacZ AMeq在CEF上的蚀斑染色结果；图4为本发明提供的重组病毒rMS-LacZ AMeq的Meq基因缺失的PCR鉴定结果；图5为本发明提供的重组病毒rMS-LacZ Δ Meq基因组Meq基因拷贝数PCR鉴定结果；图6本发明提供的病毒基因组总DNA电泳图；图7本发明提供的同源臂C和片段D的扩增结果；图8本发明提供的重组病毒转移载体质粒鉴定结果；图9本发明提供的重组病毒鉴定结果；图10本发明提供的重组病毒rMSAmiR9_12测序结果示意图；图11本发明提供的MS与rMSAmiR9_12在CEF上生长曲线；
图12本发明提供的MS毒株与rMS Δ miR9_12毒株感染病理学组织变化。



本发明公开了鸡马立克氏病病毒miRNA缺失疫苗株及其应用，其特征在于以带有β-半乳糖苷酶报告基因并缺失Meq基因的重组MDV流行毒株rMS-LacZΔMeq为亲本毒株，缺失了mdv-miR-M9、-M5和mdv-miR-M12，从而构建成的重组毒株rMSΔmiR9-12株，本发明还公开了该基因缺失疫苗株在防制鸡马立克氏病中的应用及应用效果。本发明基因缺失疫苗株的微生物保藏号是CGMCC No.4613。本发明miRNA缺失疫苗株遗传性状稳定、安全性好，对于鸡马立克氏病具有良好的免疫保护效力，可应用于制备成防治鸡马立克氏病病毒的单苗或联苗等。