专利名称：一种脱氮假单胞菌发酵生产维生素B₁₂高产菌株的诱变方法维生素B12为钴胺素类化合物，主要用于治疗恶性贫血；与叶酸合用治疗其他巨幼细胞贫血、抗叶酸药引起的贫血及脂肪泻；亦用于某些神经系统疾患如神经炎、神经萎缩等，肝脏疾病如肝硬化、肝炎等，以及血液系统疾病如白细胞减少症、再生障碍性贫血等的治疗。已经被列为我国基本医疗保险项目中的甲类品种，在我国大城市的用药普及率已经达到90 %以上，其需求量日趋旺盛。目前国内外商品化的维生素B12几乎都是通过微生物发酵进行生产的。其中在发酵过程中作为活细胞催化剂的微生物是整个发酵过程的核心。因此，选育出产物产量高， 遗传性状稳定和发酵条件优良的菌株对于维生素B12的微生物发酵生产具有非常现实的意义。
本发明的目的就在于提供一种产物产量高，遗传性状稳定和发酵条件优良的脱氮假单胞菌发酵生产维生素B12高产菌株的诱变方法。为实现上述发明目的所采取的技术方案为一种脱氮假单胞菌发酵生产维生素B12高产菌株的诱变筛选方法，其特征是以脱氮假单胞菌为出发菌株，将其菌悬液首先用甲磺酸乙酯进行化学诱变筛选后，再将选筛出来的菌株在低能离子注入机上进行低能离子注入诱变筛选获得脱氮假单胞菌发酵生产维生素B12高产菌株；所述的菌悬液采用如下方法获得取培养好的脱氮假单胞菌菌株新鲜斜面，用 0. lmol/L、pH7. 0的磷酸缓冲液洗下菌体，装入带玻璃珠的三角瓶中振荡池，用磷酸缓冲液调节菌体数约为IO7 IO8个/ml ；所述的化学诱变筛选过程为a.在菌悬液中加入0. 05mol/L甲磺酸乙酯，混勻后置于恒温振荡箱中振荡50分钟，随后，立即加入0. lmol/L硫代硫酸钠溶液终止反应；同时另取菌悬液，不加甲磺酸乙酯作对照品；b.用0. 2mol/L、pH7. 0 7. 4磷酸盐缓冲液将诱变后的菌悬液及对照品采用10倍倍比法分别稀释至10_4，然后分别吸取10_2、10_3、10_4的菌悬液进行平板培养基培养，培养温度32°C，培养5 6天；c.初筛从平板培养基上挑选抗性突变株至斜面培养基，培养7 后将菌株接至种子培养基，培养Mh，接至发酵摇瓶培养，培养16 后测VB12的单位，选取VB12含量高于对照品5%以上的高产菌株进行复筛；d.复筛将菌株从斜面接至种子培养基，24h后将10%的种子液接至摇瓶培养基， 每株接3瓶，培养165 17 后测各菌株的维生素B12的发酵单位，以此确定高产菌株；所述的离子注入诱变筛选的过程为A.从化学诱变获得的高产菌株斜面培养基上刮取菌落接至种子培养基中，于 35 37°C振荡培养50h，再于6°C放置lh，使之同步生长，然后加0. 5%酵母膏，继续振荡培养20 60min ；培养液于2°C下3000r/min离心洗涤，收集菌体；移取适量菌体于盛0. 85% 的生理盐水和玻璃珠的无菌三角瓶中，在300r/min的旋转式摇床上振荡lOmin，使其分散， 过滤；通过细胞计数板计数，用生理盐水将细胞悬液稀释至IO8个/ml备用；B.离子注入诱变取上述0. 5ml菌悬液均勻涂布于无菌培养皿中，无菌风制成菌膜后进行等离子体诱变；在低能离子注入机上进行，采用能量为IOkeV,剂量分别为(1 9) X1014ions/cm2，采用脉冲式注入，每个脉冲为5s，间隔为30 50s，同时做对照样品；C.离子注入诱变后的样品用无菌生理盐水洗涤后进行10倍法稀释，取10_4、10_5、 10_6 3个稀释度涂布平板，32 士 1 °C，50 士 5 %相对湿度下培养6d，对长出的单菌落进行观察计数；D.菌株初筛离子注入后，各处理组分别挑取140个单菌落，32士 1°C，50士5%相对湿度下培养 3d，然后挖块接种进行摇瓶初筛；E.菌株复筛从初筛结果中选出效价高的突变株，经过反复多次复筛，选出前15%的突变株再进行复筛，复筛时，一株接三瓶平行样。对挑选出的典型诱变菌株，逐一进行发酵摇瓶考察， 选择起步效价、放瓶发酵单位和OD值均较高的菌种。上述过程中1.平板培养基(投料配比g/1000ml)甜菜糖蜜(50% ) 120g、硫酸铵0. 20g、硫酸镁2. 5g、硫酸锰0. 2g、硫酸锌0. 2g、磷酸氢二铵2. 35g、琼脂15g。用20% NaOH溶液调pH， 消前7. 0 7. 4。以上培养基配制好经灭菌(0. 11 0. 12MPa, 121°C，30min)后，分别装于无菌培养皿中制成平板培养基。2.斜面培养基配方(投料配比g/1000ml)甜菜糖蜜(50% ) 140g、硫酸铵0. 45g、 硫酸镁3. lg、硫酸锰0. 2g、硫酸锌0. 2g、磷酸氢二铵2. 35g、琼脂^g。用20% NaOH溶液调PH，消前7. 0 7. 4。以上培养基配制好后，分别装于试管中，经灭菌(0. 11 0. 12MPa, 121°C，30min)后制成斜面使用。用消毒后的蒸馏水0. 5ml注入冻干管，使其内容物悬浮，将悬浮液接到三支斜面培养基上，在观 30°C培养72小时，得到斜面。3.种子培养基(投料配比g/1000ml)甜菜糖蜜(50% ) 100g、硫酸铵0. 8g、硫酸镁2. 6g、硫酸锰0. 2g、硫酸锌0. 2g、氯化钴0. 02g、前体0. Olg、用20% NaOH溶液调pH，消前 7.0 7.4。经灭菌(0. 11 0. 12MPa，121°C，30min)后制成种子培养基。4.菌种摇瓶发酵培养基(投料配比g/1000ml)甜菜糖蜜50% 180g、蔗糖16g、 氯化胆碱11. 3g、硫酸铵3. 6g、硫酸镁2. 5g、硫酸锌0. 4g、氯化钴0. 04g、、前体0. Olg、甘油 1.58、甘油磷酸88。经灭菌(0. 11 0. 12MPa,12rC,30min)后制成摇瓶培养基。5.斜面接种瓶将第三代斜面的培养物1 2cm2接入300ml三角瓶(内装60ml 种子培养基)在观 30°C，相对湿度40 60%，摇床上培养20 Mh，转速为300 320转/分钟。6.种瓶接发酵瓶将上述种子液3ml移至300nlml三角瓶中(内装已灭菌的发酵培养基30ml)内，培养温度30 33°C，湿度40 60%，摇床转速观0 300转/分钟，培养时间为165 175小时后，放瓶并测定发酵单位。甲磺酸乙酯(Ethyl Methan Sulfonate)是一种烷化剂。1953年，KLMARK首次报告了 EMS对突变诱导的有效性。此后，EMS在诱变育种中得到广泛应用，并且效果很好。其作用机理是通过与核苷酸中的嘌呤、嘧啶分子直接反应来诱发突变。EMS诱发的突变体主要通过两个步骤完成首先鸟嘌呤的06位置被烷基化，而后在DNA复制过程中，烷基化的鸟嘌呤与胸腺嘧啶配对，导致碱基交换，即GC变为AT，形成点突变。低能离子诱变是80年代广泛应用于金属材料表面改性的一项高新技术。1986年中国科学院等离子物理研究所率先开展低能离子注入生物学效应并将此项技术应用于植物育种。目前已在诱变机理和育种应用上取得重要进展。低能离子注入诱变育种具有损伤轻，突变率高和突变谱广的特点，是人工诱变方法的一个新发展。低能离子注入生物学效应的原初过程包括能量沉积、动量传递、离子注入和电荷交换4个方面。能量为几十至几百keV的荷能离子通过发生器注入生物体内，在其到达终位前，将同靶材料中的分子原子发生一系列的碰撞。起初的入射能量较高，与靶分子、原子的相互作用主要是非弹性碰撞过程(电子阻止过程)，使生物分子电离或激发导致电离损伤。以后入射离子能量逐渐降低，弹性碰撞将起主要作用(核阻止过程)，通过碰撞、级连和反冲碰撞，导致靶原子移位，留下断链或缺陷。随着入射离子能量进一步降低，核阻止本能急剧上升，能量损失达到峰值。这时慢化的原初离子也将以高斯分布的形式沉积下来。如果注入离子是活性离子，则它们在沉积过程中将不断与生物分子键合、置换，形成新的分子基团。伴随着入射离子的能量沉积，其中一小部分能量将随着动量方向到达表面，引起生物体表面的二次离子发射，即溅射。溅射离子可以是原子、分子或离子。本发明采用以甲磺酸乙酯为诱变剂的化学诱变法和低能离子束诱变法相结合的方法，最终获得了遗传性状稳定、发酵条件优良的菌种。本发明诱变方法易行、操作安全，其诱变效果远高于传统的物理化学诱变方法，以此方法诱变得到的菌种同原始菌株相比，发酵单位提高8 12%。
图1为甲磺酸乙酯与致死率关系图；图2为诱变剂量与致死率、变异率的关系；图3为离子注入诱变处理突变株初筛结果。

无菌培养皿中制成平板培养基。2)斜面培养基配方(投料配比g/1000ml)甜菜糖蜜(50% ) 140g、硫酸铵0. 45g、 硫酸镁3. lg、硫酸锰0. 2g、硫酸锌0. 2g、磷酸氢二铵2. 35g、琼脂^g。用20% NaOH溶液调PH，消前7. 0 7. 4。以上培养基配制好后，分别装于试管中，经灭菌(0. 11 0. 12MPa, 121°C，30min)后制成斜面使用。用消毒后的蒸馏水0. 5ml注入冻干管，使其内容物悬浮，将悬浮液接到三支斜面培养基上，在观 30°C培养72小时，得到斜面。3)种子培养基(投料配比g/1000ml)甜菜糖蜜(50% ) 100g、硫酸铵0. Sg、硫酸镁2. 6g、硫酸锰0. 2g、硫酸锌0. 2g、氯化钴0. 02g、前体0. Olg、用20% NaOH溶液调pH，消前 7.0 7.4。经灭菌(0. 11 0. 12MPa，121°C，30min)后制成种子培养基。4)菌种摇瓶发酵培养基(投料配比g/1000ml)甜菜糖蜜50% 180g、蔗糖16g、 氯化胆碱11. 3g、硫酸铵3. 6g、硫酸镁2. 5g、硫酸锌0. 4g、氯化钴0. 04g、、前体0. Olg、甘油 1.58、甘油磷酸88。经灭菌(0. 11 0. 12MPa,12rC,30min)后制成摇瓶培养基。5)斜面接种瓶将第三代斜面的培养物1 2cm2接入300ml三角瓶(内装60ml 种子培养基)在观 30°C，相对湿度40 60%，摇床上培养20 Mh，转速为300 320 转/分钟。6)种瓶接发酵瓶将上述种子液3ml移至300ml三角瓶中(内装已灭菌的发酵培养基30ml)内，培养温度30 33 °C，湿度40 60 %，摇床转速280 300转/分钟，培养时间为165 175小时后，放瓶并测定发酵单位。2甲磺酸乙酯化学诱变1)诱变方法取培养好的脱氮假单胞菌菌株新鲜斜面，用0. lmol/L、pH7. 0的磷酸缓冲液洗下菌体，装入带玻璃珠的三角瓶中振荡池，用磷酸缓冲液调节菌体数约为IO7 IO8个/ml (采用血球计数器)。将菌悬液分装于6只试管，每支IOml，分别加入0. 05mol/L甲磺酸乙酯0. anl，混勻后置于恒温振荡箱中，在^°C，分别振荡10min、20min、30min、40min、 50min、60min。待反应完成后，立即加入0. lmol/L硫代硫酸钠溶液0. 5ml终止反应；同时另取菌悬液10ml，不加甲磺酸乙酯作为对照；用0. 2mol/L、pH7. 0 7. 4磷酸盐缓冲液将对照及诱变后的菌悬液采用10倍倍比法分别稀释至10_4，然后分别吸取10_2、10_3、10_4的菌悬液 200ul加到制备好的平板培养基，涂布均勻后置于恒温培养箱中，32°C，培养5 6天，挑选菌落进行筛选。2)菌种筛选方法初筛从平板培养基上挑选抗性突变株至斜面培养基，培养7 后将菌株接至种子培养基，培养Mh，接至发酵培养，培养16 后测VB12的单位，选取VB12含量高于对照5 % 以上的高产菌株共9株菌株进行复筛。复筛将菌株从斜面接至种子培养基，24h后以将10%的种子液接至摇瓶培养基， 每株接3瓶，培养165 17 后测各菌株的维生素B12的发酵单位，以此确定高产菌株。3)效价检测方法采用高效液相色谱法。4)稳定性考察结果致死率与时间关系
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表1不同诱变时间菌落数致死率明细表


本发明涉及一种脱氮假单胞菌发酵生产维生素B12高产菌株的诱变筛选方法，其特征是以脱氮假单胞菌为出发菌株，将其菌悬液首先用甲磺酸乙酯进行化学诱变筛选后，再将选筛出来的菌株在低能离子注入机上再进行低能离子注入诱变筛选获得脱氮假单胞菌发酵生产维生素B12高产菌株。本发明采用以甲磺酸乙酯为诱变剂的化学诱变法和低能离子束诱变法相结合的方法，最终获得了遗传性状稳定、发酵条件优良的菌种。本发明诱变方法易行、操作安全，其诱变效果远高于传统的物理化学诱变方法，以此方法诱变得到的菌种同原始菌株相比，发酵单位提高8～12%。