专利名称：一种香蕉束顶病毒恒温基因扩增快速检测试剂盒及其使用方法香蕉为芭蕉科芭蕉属植物，是热带亚热带重要的经济作物和粮食作物。香蕉束顶病毒(Banana bunchy top virus, BBTV)是制约我国广东、云南、海南等香蕉主要种植地区产业健康发展的重要因素之一。感病植株生长早期发病病株明显矮缩，叶片狭小，直立状，叶缘黄化，叶质硬脆，易折断，主脉和叶柄表现长短不一，断断续续的深色条纹(俗称“起青筋”)。孕穗后发病，如叶片已出齐，则不现“束顶”，叶片也不狭小、黄化，但幼嫩 叶片主脉仍现“青筋”，抽出的花蕾直生，不结蕉或结蕉性能极差，把柄细长、弯曲，果小而少，果端细如指头，果肉脆、无香味。香蕉束顶病的病原为球状粒体病毒(BBTV)，由香蕉蕉脉蚜(Pentalonia nigronervosa)以持久性方式传播。香蕉束顶病主要是通过吸芽和组培苗带毒，以及香蕉交脉虫牙(Pentalonia nigroneryosa)来传播。香蕉主要通过无性组织培养工厂化生产，香蕉束顶病毒可随着组培中香蕉分化芽的繁殖，若种苗(或蕉头)携带香蕉束顶病毒又未经严格检疫，其病原就可能随组培苗以更快的速度传播，成为传播病毒的一个重要的初侵染源。因此，建立一套BBTV快速、稳定的检测方法是无毒种苗生产的重要保证。近年来，有大量的报道证实基于PCR的方法已经成功用于检测香蕉束顶病毒，PCR方法在操作时间上以及检测的特异性和灵敏度方面较常规方法有较大提高，但是，PCR方法必须有精密的温度循环装置，而且它的检测时间也还是比较长(2 3小时)，并且反应过程很容易受污染物的影响，从而使得这种方法不能满足实际检测的需要。因此，需要开发一种灵敏度高并且反应迅速的方法，在一定程度上可以取代PCR的检测方法。因此，将生物技术发展的最新成果应用于香蕉束顶病毒检测，具有重要意义。DNA 环介导恒温核酸扩增技术(loop-mediated isothermal amplification ofDNA, LAMP)克服以往基因扩增方法的不足，在等温条件下能够特异性、高效、快速地进行核酸的扩增，具有很多的优越性，见文献Notomi T, Okayama H, Masubuchi H, Yonekawa T,Watanabe K,Amino N，Hase T. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. NucleicAcids Res. 2000Jun 15 ；28(12) :E63.。该方法通常是按如下步骤进行步骤一、对被检标本进行预处理，快速提取被检标本的DNA或RNA ;步骤二、特异性引物的制备确定待测标本的靶基因后，取得特异性引物2对，内引物和外引物各一对；步骤三、进行环介导等温扩增技术(LAMP)反应将经前处理的样品、引物、反应缓冲液与Bst DNA聚合酶混合，在63 65°C保温0. 5至I. 5小时进行循环链置换反应；步骤四、分析判断反应产物结果
本发明的目的在于克服上述技术缺陷，提供一种香蕉束顶病毒恒温基因扩增快速检测试剂盒。本发明的目的还在于提供该香蕉束顶病毒恒温基因扩增快速检测试剂盒的使用方法。为了实现本发明的目的，本发明提供一种香蕉束顶病毒恒温基因扩增快速检测试剂盒，其试剂包括由两对引物构成的引物混合液，所述两对引物为外引物1-F3，其核苷酸序列如SEQ ID NO :l(5’-TGATGCGGGATGAGITTA-3’)所示，外引物 2-B3，其核苷酸序列如 SEQ ID NO:2(5’-CACGCATATCCTGTATGAC-3’)所示，内引物 1-FIP，其核苷酸序列如 SEQ ID N0:3(5’_CTITCGITTCTCAAGGTGTGCGTCGAGATGAAGAGAAGAAG-3’)所示，内引物 2-BIP，其核苷酸序列如 SEQID NO :4(5’ -GGGAGCCAAGAAGAAGCAGGACCTTCGAITCTTGTATC-3’ )所示，所述内引物 1-FIP 和所述内引物2-BIP的浓度均为40pmOl/iil，所述外引物1-F3和所述外引物2-B3的浓度分 别为 5pmol/ V- I ；浓度为8U/ U I的BstDNA聚合酶；DNA 提取液，所述DNA 提取液包含100mM Tris-HCl (pH7. 4)、IM KClUOmM EDTA和2% (w/v)PVPP ；反应缓冲液，所述反应缓冲液包含10mM dNTP、10 X ThermoPol反应缓冲液、150mMMgS04、5mM 甜菜碱=8 5 2 10 ；核酸染料；阳性对照香蕉束顶病毒基因组DNA ；阴性对照IOOmMTris-HCl (pH 8. 0)和 50mM EDTA。优选地，所述核酸染料为1000XSYBR Green I。如本文使用的，在反应缓冲液中，“反应缓冲液包含IOmMdNTPUOXThermoPol反应缓冲液、150mM MgS04、5mM甜菜碱=8 :5:2: 10”是指反应缓冲液中IOmM dNTP、10 X ThermoPol反应缓冲液、150mM MgSO4的水溶液、5mM甜菜碱的水溶液的体积比为8 : 5 : 2 : 10。本发明还提供一种香蕉束顶病毒恒温基因扩增快速检测试剂盒的使用方法，该方法包括下列步骤I)被检样品的DNA核酸提取向0. 5mg待检测样品中加入30 u IDNA提取液，研磨成糊状后，在95°C IOmin, IOOOOrpm下离心2分钟，取上清作为检测模板DNA ；2)环介导等温扩增反应在25iU PCR管中配置反应溶液1 y I的外引物1_F3，其核苷酸序列如SEQ ID NO :1所示；I Ul的外引物2-B3，其核苷酸序列如SEQ ID NO : 2所示；Iu I的内引物1-FIP，其核苷酸序列如SEQ ID勵3所示；1111的内引物2-81 ，其核苷酸序列如SEQ ID NO :4所示；12. 5iU的反应缓冲液；Iyl的Bst DNA聚合酶；2iil的模板DNA ;然后加水至25 Ul ;设置阳性对照反应时，用香蕉束顶病毒基因组DNA代替I)中得到的检测模板DNA，设置阴性对照反应时，用IOOmM Tris-HCl (pH 8.0)和5OmM EDTA代替I)中得到的检测模板DNA，将含有配制好的反应溶液的PCR管于63°C恒温反应90min ；3)分析判断反应产物结果在2)中所得反应产物中加入I U I的核酸染料，如反应液颜色为橙色，表示结果为阴性，如反应液颜色为绿色，表示结果为阳性。优选地，所述核酸染料为1000XSYBR Green I。本发明所述的香蕉束顶病毒恒温基因扩增快速检测试剂盒具有以下有益效果I、高特异性本发明根据香蕉束顶病毒基因保守区设计了四条特异性引物，引物序列为SEQ ID NO USEQ ID NO :2、SEQ ID NO :3和SEQ ID NO :4。应用上述四条引物，根据是否扩增就能判断靶标物质的存在与否，阳性率大于95%，假阳性率小于3% ；2、无需高纯度模板DNA :简单快速的DNA提取方法，不需要离心机、液氮、酚、氯仿仪器和试剂；3、实现样品现场检测在野外或田间现场，直接对样本中的条斑病毒进行现场基因扩增检测；4、快速、高效扩增扩增在不到I小时即可完成，且产率高；5、灵敏度高在复杂体系中可检测到单个细胞的靶目标，最低检测极限达到2pg DNA，标本的检出率达到95%以上；6、鉴定简便通过肉眼观察颜色变化判定结果，无需电泳等其他任何分析步骤。本发明涉及一种香蕉束顶病毒(Banana bunchy top virus，BBTV)恒温基因扩增快速检测试剂盒，其试剂包括由两对引物构成的引物混合液；浓度为8U/μl的Bst DNA聚合酶；DNA提取液，所述DNA提取液包含100mM Tris-HCl(pH7.4)、1M KC1、10mM EDTA和2%(w/v)PVPP；反应缓冲液，所述反应缓冲液包含10mM dNTP、10×ThermoPol反应缓冲液、150mM MgSO4、5mM甜菜碱＝8∶5∶2∶10；核酸染料；阳性对照为蕉条斑病毒基因组DNA；阴性对照100mMTris-HCl(pH 8.0)和50mM EDTA。本发明还涉及该试剂盒的使用方法。该试剂盒通过对样品中香蕉束顶病毒的核酸提取、恒温基因扩增反应、最后通过对反应液颜色的肉眼判断来实现对香蕉束顶病毒高特异性、快速、高效、高灵敏度、简便的分子检测。