专利名称：一种从牡蛎提取物酶解产生多肽的方法有“海洋牛奶”之称的牡蛎，占我国海洋水产养殖总产量的三分之一，有着价格低廉、产量丰富，蛋白质含量高等优点。长久以来，人们就认识到牡蛎的利用价值，对其进行了大力开发，出现了一系列的牡蛎制品，如冻干牡蛎肉，牡蛎超微粉，牡蛎牛磺酸，牡蛎壳活性钙，牡蛎肽等。随着工业生产技术的发展，新产品的不断出现，牡蛎的应用也越来越广泛，但对牡蛎的应用最好莫过于利用其高蛋白质含量生产多肽。人体很多活性物质都是以肽的形式存在的，没有肽，就没有活性，就没有生命。肽涉及人体的激素、神经、细胞生长和生殖各领域，其重要性在于调节体内各个系统和细胞的生理功能，激活体内有关酶系，促进中间代谢膜的通透性，或通过控制DNA转录或影响特异的蛋白合成，最终产生特定的生理效应。肽是涉及人体内多种细胞功能的重要物质。肽可以合成细胞，并调节细胞的功能活动。肽在人体作为神经递质，传递信息。肽可在人体作为运输工具，将人体所食的各种营养物质与各种维生素、生物素、钙及对人体有益的微量元素输送到人体各细胞、器官和组织。肽是人体重要的生理调节物，它可全面调节人体生理功能， 增强和发挥人体生理活性，它具有重要的生物学功能。肽对人的细胞活性、功能活动、生命存在非常重要。然而用传统的方式生产多肽，其分子量无法控制，功能性难以体现，分子量无法控制，生产的多肽有苦味，这种多肽不但没有保健作用，而且有副作用。在科技飞速发展的今天，用传统的方式合成肽已经落后了，已不适应现代科技对生产多肽的要求，引领多肽生成的方法是酶法。利用酶法水解制备的蛋白水解产物富含具有多种生理活性的多肽和氨基酸。这些肽具有优良的持水性、凝胶性、乳化性、溶解性、渗透性及抗氧化性，已在世界范围内引起关注，成为科技界、医学界、营养学界、食品界、企业界研究、开发、生产的热点，酶法多肽产业是跨世纪的一种新的朝阳产业，发展前景非常可观。国内针对牡蛎的应用开发已开展了很多研究工作，如陈骞、杨瑞金、顾聆琳“牡蛎糖原的研究(I)——牡蛎糖原的分离提取和化学组成”《食品科学》，2005，26 (6) :99-101。 又如汪秋宽、何云海、徐玲等“牡蛎糖蛋白的纯化分离研究”，《沈阳农业大学学报》，2007， 38(2) :211-214。再如刘亚南、张志胜、佟海菊等“响应面法优化中性蛋白酶提取牡蛎牛磺酸酶解工艺条件”，《食品科学》，2011，7 :25。但是，这些研究工作及牡蛎产品大多只关注牡蛎中牛磺酸的生理功能及营养价值或牡蛎的全营养功能方面，而且在生产过程中采用的是传统繁杂的分离技术及工艺方法，产品中的活性成分含量相对较低。又如王一兵、柯珂、何碧娟等“广西近江牡蛎酶解工艺研究”《食品研究与开发》，2011,32 :16，其采用胰蛋白酶制备的方法是超声波方法，还需要特殊的设备。又如汪秋宽、宋琳琳、徐玲等“牡蛎抗氧化活性肽的酶解工艺研究”《大连水产学院学报》，2009，24( 95)中的工艺研究目的在于 “以木瓜蛋白酶和中性蛋白酶为工具酶，寻找最佳的抗氧化活性产物”，结果表明当时间为150min、酶用量为6%、温度为45°C、pH为7. 0时，木瓜蛋白酶酶解液的抗氧化活性最强。这些文献公开的技术，主要针对生牡蛎，且其操作步骤复杂、烦琐；所得产物分子量范围与本发明的产物特征均不同。
本发明的目的在于克服传统方式生成的多肽所产生的缺陷，进而对酶催化水解进行较为系统的研究，从而提供一种简单、有效、安全且产率较高的从牡蛎提取物酶解产生多肽的方法。本发明的目的是通过如下技术方案实现的一种牡蛎提取物酶解产生多肽的方法，具体包括如下步骤1)溶酶称取一定量牡蛎提取物粉末，加入一定量的适合温度的水完全溶解。称取木瓜蛋白酶加入牡蛎溶液中，搅拌均勻，用酸度计测定PH值，并用醋酸调节pH值至弱酸性；所述溶酶所用水加入倍数为牡蛎提取物的重量的8 12倍，优选10倍；所述木瓜蛋白酶加入量为牡蛎提取物的重量比优选7% 20%，最佳用量为 12% ；所述调节混合溶液的pH值至5. 6 6. 4，优选5. 8 6. 0。2)酶解将上述溶液放于一定温度的水浴锅中加热，恒温酶解，而后升温，恒温灭酶 30min。所述恒温酶解温度为45 V 65°C，优选55°C 65°C .最佳60 V。所述恒温酶解时间为60min 120min，优选90min 120min。最佳为90min。所述恒温灭酶温度为90°C 100°C。本发明提供的牡蛎提取物酶解方法能有效地提取牡蛎中的多肽，该方法与现有技术的提取方法相比，其优点在于1)操作简单，成本低廉；2)安全可靠，不会造成环境污染；3)不减蛋白质营养价值，可保持多肽营养纯天然绿色属性，不含任何化学物质；4)酶解出来的多肽，没有任何苦味和异味，不会引起过敏。改善原食品蛋白质的一些过敏原，可增加原食品蛋白质没有的重要的生物学功能。5)产率稳定，适合工业化生产，具有很高的应用价值。6)本发明制备工艺所得到的酶解产物的特征氨基酸主要为精氨酸，其次是组氨酸和谷氨酸。其多肽分子量主要集中在SOOODa以下，其中以1400Da以下的居多，在85%左右，且各种肽的分子量比较集中，主要为小分子多肽，营养价值很高。可见其分子量容易控制，有很大的潜在价值。图1是木瓜蛋白酶温度-多肽产量曲线图。图2是木瓜蛋白酶pH-多肽产量曲线图。图3是木瓜蛋白酶时间_多肽产量曲线图。图4是木瓜蛋白酶加酶量-多肽产量曲线图。图5是木瓜蛋白酶加水倍数-多肽产量曲线图。图6、7、8、9、10是正交实验的直观分析图。图11是牡蛎提取物酶解产生多肽的相对分子量大小分布图。
1、酸溶蛋白质的测定方法(凯式定氮法):量取样品10. 0ml，加入10. Oml 30%的三氯乙酸溶液，混合均勻，静置5min。用移液管取10. Oml于离心管中，在4000r/min下离心10分钟，取全部上清液，加入消化管中，往消化管中滴加催化剂(硫酸钾硒粉=99 1)适量，摇勻，再加入浓硫酸20ml，消化2小时。取出定容，取20ml消化液于蒸馏管中蒸馏，用2%硼酸溶液吸收，吸收液用0. lmol/L的盐酸滴定。空白对照实验不加样品消化，其他操作与样品相同。计算公式式=(^2)??.0140χ625χ100
1Μ/100Xl-酸溶蛋白质含量g/100gVl-样液定氮所耗盐酸标准溶液的量，ml ；V2-空白对照定氮所耗盐酸标准溶液的量，ml ；C-盐酸标准溶液的浓度，mol/L ；M-酶解时所称样品的质量，g。2、游离性氨基酸态氮含量测定方法(甲醛法)于200ml烧杯中吸取20. Oml酶解液，加60ml蒸馏水，开启磁力搅拌器，待搅拌稳定后把酸度计的复合电极小心放入烧杯中，用0. lmol/L的氢氧化钠溶液滴定到酸度计指示PH值为8. 2，准确加入10. OOml的甲醛溶液，混勻，再用0. lmol/L的氢氧化钠标准溶液滴定至PH值为9. 2，记录消耗氢氧化钠标准溶液的体积。同样量取80ml蒸馏水，先用0. 05mol/L的氢氧化钠标准溶液调节pH值至8. 2，再加入100. lmol/L的甲醛溶液，用0. lmol/L氢氧化钠标准溶液滴定至pH值至9. 2，作为试剂空白对照。计算公式式JA=-X100
M15Xl-游离性氨基酸态氮g/100gVl-样液定氮所耗氢氧化钠标准溶液的量，ml ；V2-空白对照定氮所耗氢氧化钠标准溶液的量，ml ；C-氢氧化钠标准溶液的浓度，mol/L ；M-酶解时所称样品的质量，g。3、粗多肽含量计算X = Xl-X2*6. 254、测定结果实施例一、二、三、四、五中制备的牡蛎提取物酶解液中多肽的测定结果见图1、图 2、图3、图4及图5所示。从图1 图5可以看出，牡蛎提取物酶解最佳的适合条件是1)最佳酶解温度优选55°C 65°C ；最佳60°C。2)最佳酶解时间优选90min 120min，最佳为90min。3)最佳酶解pH值5. 6 6. 4 ；优选5. 8 6. 04)最佳加酶量优选7% 20%，最佳用量为12%5)最佳加水倍数优选8 12倍，优选10倍。
实施例七正交试验分析结果通过单因素分析，我们知道牡蛎提取物酶解生产多肽的酶选用木瓜蛋白酶，酶解温度，时间，PH值，加酶量，加水倍数等，但各因素的相互作用仍然不是很明确，为了确定酶解的最适条件，设计5因素4水平的正交试验，以多肽产量作为评价指标。选择温度、时间，加酶量、pH、加水倍数5个主要的工艺参数，酶解工艺的正交实验结果如表1。表1酶解工艺正交实验的设计及结果


本发明涉公开了一种牡蛎提取物的酶解提取方法，通过木瓜蛋白酶对牡蛎提取物进行酶解产生多肽，制备方法依次包括溶酶、调节pH值、酶解、灭酶等几个步骤。该方法优点在于1)产物特征为氨基酸主要为精氨酸，其次是组氨酸和谷氨酸。其多肽分子量主要集中在8000Da以下，其中以1400Da以下的居多，在85％左右，且各种肽的分子量比较集中，主要为小分子多肽，营养价值很高。2)操作简单，成本低廉；3)安全可靠，不会造成环境污染；4)产率稳定，合工业化生产，具有很高的应用价值。