专利名称：脑血管疾病的基因疗法的制作方法图10是显微照片，显示如下结果，其中通过双侧颈动脉的缺血刺激在海马CA-1区观察到延迟神经元死亡。在该图中，“Sham ope.第7天”代表对照(手术处理，仅未缺血刺激)第7天的结果，“Vehicle(第4天，第7天)”分别代表双侧颈动脉缺血后第4天和第7天的结果。图11是显示如下结果的显微照片，其中在双侧颈动脉的缺血刺激之前和之后导入HGF基因或重组HGF蛋白，抑制海马CA-1区的延迟神经元死亡。在该图中，“Post HGF基因(第4天，第7天)”代表第4天和第7天的结果，其中HGF基因在双侧颈动脉缺血后即刻导入，“Pre HGF基因第7天”代表第7天的结果，其中HGF基因在双侧颈动脉缺血前即刻导入，而“r-HGF第7天”代表第7天的结果，其中重组HGF蛋白在双侧颈动脉缺血后即刻导入。图12显示通过对活的神经细胞染色测量海马CA-1区中神经细胞的密度所获得的结果。在该图中，纵坐标代表细胞密度(活神经细胞计数/mm)。横坐标中“sham”代表对照的结果(未缺血刺激)，“vehicle”代表双侧颈动脉缺血的结果，“PostG”代表HGF基因在双侧颈动脉缺血后即刻导入的结果，“PreG”代表HGF基因在双侧颈动脉缺血前导入的结果，“PostR”代表重组HGF蛋白在双侧颈动脉缺血后导入的结果。相对于“vehicle”，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。图13显示在双侧颈动脉缺血后导入HGF基因然后用ELISA法测量7天后脑脊液中HGF的蛋白浓度所获得的结果。在该图中，纵坐标代表HGF的蛋白浓度(ng/ml)，横坐标上的“post HGF”代表导入HGF基因的结果，“sham”代表对照(未缺血刺激)的结果。“N.D.”代表结果未检测。图14是显微照片，显示通过免疫染色方法分析的C-Met在海马CA-1区的表达的结果。图15是显微照片，显示通过TUNEL方法对海马CA-1区发生细胞凋亡的神经细胞染色的结果。在该图中，“DND第7天”代表在双侧颈动脉缺血后第7天有延迟神经元死亡的神经细胞，“Post HGF基因第7天”代表双侧颈动脉缺血后即刻导入HGF基因之后第7天的结果，“Pre HGF基因第7天”代表双侧颈动脉缺血前即刻导入HGF基因之后第7天的结果。图16是显微照片，显示通过免疫染色方法分析Bcl-xL在海马CA-1区的表达的结果。在该图中，“sham.”代表对照(未缺血刺激)的结果，“post HGF(第4天，第7天)”代表双侧颈动脉缺血后即刻导入HGF基因之后第4天和第7天的结果。
图17是显示如下结果的显微照片，其中通过免疫染色方法分析了双侧颈动脉缺血后即刻导入HGF基因之后第7天HSP70在海马CA-1区的表达。
图18是显示如下结果的显微照片，其中通过免疫染色方法分析了HSP70在海马CA-1区的表达。在该图中，“sham.”代表对照(未缺血刺激)的结果，“Post HGF 7D”代表双侧颈动脉缺血后即刻导入HGF基因之后第7天的结果。
而且，本发明的HGF基因不限于上述那些基因，而是，只要所述基因表达的蛋白质实际上能以与HGF相同的方式起作用，则可使用任何基因作为本发明的HGF基因。因此，从1)在严格条件下与所述cDNA杂交的DNA和2)其编码蛋白质的氨基酸序列中相对所述cDNA编码的蛋白质的氨基酸序列有一或许多(优选几个)氨基酸替代、缺失和/或插入的DNA等，那些编码具有HGF作用的蛋白质的基因均包括在本发明HGF基因的范围内。上述1)和2)中的DNA可容易地通过定点诱变、PCR方法、或标准杂交方法等获得，具体地，它们可参考基本教科书如上面的分子克隆等来进行。
本文所用“VEGF基因”是指能表达VEGF(VEGF蛋白)的基因。因此，按下文所述整合进适合表达载体(非病毒载体，病毒载体)的基因可作为说明的例子。已报道通过在人体内转录时VEGF基因的选择性剪接，存在4种亚型(VEGF121，VEGF165，VEGF189，VEGF206)(科学219983(1983)；J.Clin.Invest.841470(1989)；Biochem.Biophys.Res.Commun.161851(1989))。根据本发明，可使用任何这些VEGF基因，但从生物学上最有效的观点看，最优选VEGF165基因。而且，象上述HGF的情况一样，只要编码的蛋白质具有VEGF活性，这些VEGF基因的修饰版本均包括在本发明的VEGF基因的范围内。
象HGF基因的情况一样，基于先前描述的序列(如科学2461306(1989))和数据库中登记的序列信息，本领域技术人员可容易地克隆所述VEGF基因，也可容易地进行它们的修饰。
根据本发明，首次证明脑血管疾病可用HGF基因或VEGF基因治疗或预防。因此，本发明首次揭示，(a)转染HGF基因或VEGF基因后，在一个延长的时期内在脑中检测到这些蛋白质，(b)通过用HGF基因或VEGF基因转染治疗，可在缺血脑的表面诱导血管生成，(c)HGF基因或VEGF基因的转染可有效治疗血管阻塞引起的脑中血流量减少，和(d)该治疗方法在阻塞之前进行时也有效。因此，HGF基因或VEGF基因可有效地用作各种脑血管疾病如脑缺血造成的疾病、与脑中血流量减少有关的疾病、期望通过促进脑中血管生成改善的疾病等的治疗或预防剂。
具体地，它们可有效地用作脑血管梗阻、脑梗死、脑血栓形成、脑栓塞、中风(包括蛛网膜下出血、短暂脑缺血、脑动脉粥样硬化)、脑出血、烟雾阴影疾病、脑血管性痴呆、阿尔茨海默痴呆和脑出血或脑梗死的后遗症等的治疗剂或预防剂(下文中，本发明的治疗或预防剂简称为基因治疗剂)。
而且，本发明人已发现，HGF基因的导入抑制海马CA-1区中由于缺血引起的延迟神经元死亡，也就是说，HGF有抑制脑中神经元死亡的作用。我们还证明，该作用基于c-Met介导的抑制神经细胞凋亡的效应。
本文所用海马CA-1区是一个密集了神经并对脑缺血引起的神经元死亡敏感的区域。已发现所述HGF基因能基于血管生成作用(抑制血流量减少)和神经细胞保护作用治疗和预防脑血管疾病。
因为HGF基因具有上述c-Met介导的神经细胞保护作用，所以它可有效地用作神经变性疾病如阿尔茨海默疾病、阿尔茨海默老年性痴呆、肌萎缩性脊髓侧索硬化或帕金森病的治疗或预防剂。
根据本发明，HGF基因和VEGF基因可单独使用或彼此联合使用。它们还可联合其它血管内皮生长因子基因使用。而且，HGF基因和/或VEGF基因可与HGF蛋白和/或VEGF蛋白联合使用。优选HGF基因和HGF蛋白联合或VEGF基因和VEGF蛋白联合，更优选HGF基因和HGF蛋白联合。详情见下面实施例4。
本文所用HGF蛋白可通过任何方法获得，只要它纯化至可用作药学药品的程度。也可使用商业上可获得的产品(例如Toyoboseki k.k.编号为HGF-101的产品等)。通过上文提到的克隆获得的HGF cDNA插入任何适合的表达载体，将后者导入宿主细胞获得转化体，从该转化体的培养物上清液中可获得目的重组HGF蛋白(见例如，自然342440(1989)；专利公开文本2777678)。VEGF蛋白也可以以类似方式获得。
然后，阐述用于本发明基因治疗的基因导入方法、导入形式、导入的量等。
当给患者施用包含上述基因作为活性成分的基因治疗剂时，剂量方案大致分为两类一种情况是使用非病毒载体，一种情况是使用病毒载体。其制备和施用方法在实验手册中有详细解释(基因治疗基本技术，实验医学分卷(Separate volume of Experimental Medicine，Basic Technology in gene therapy)，Yodosha(1996)；基因导入和表达分析实验方法，实验医学分卷(Separate volume of ExperimentalMedicine，Experimental Methods in Gene Introduction andExpression Analysis)，Yodosha(1997)；基因治疗的开发和研究手册(Handbook for Development and Research of Gene Therapy)，日本基因治疗学会(Japan Society of Gene Therapy)编，NTS(1999))。这将在下文中具体解释。
A.当使用非病毒载体时使用已将目的基因整合进常用基因表达载体产生的重组表达载体，可通过下列方法等将目的基因导入细胞或组织。
作为将基因导入细胞的方法，可提及脂转染法、磷酸钙共沉淀法、DEAE葡聚糖法、采用微玻璃管的直接DNA导入法等。
作为将基因导入组织的方法，重组表达载体可通过任何如下方法掺入细胞用内部型(internal type)脂质体导入基因的方法，用静电型(electrostatic type)脂质体导入基因的方法，HVJ-脂质体法，改进的HVJ-脂质体法(HVJ-AVE脂质体法)，受体介导的基因导入法，通过基因枪将DNA分子和载体(金属颗粒)一起导入的方法，直接导入裸DNA的方法，用带正电荷的聚合物导入的方法，等等。
其中，HVJ-脂质体是通过将DNA封入由脂双层组成的脂质体制备的融合产物，所述脂质体已与灭活仙台病毒(Sendai virus)(日本血凝病毒HVJ)融合。和传统脂质体方法相比，HVJ-脂质体法的特征在于，与细胞膜具有非常高的的融合活性，因而是优选的导入方式。关于制备HVJ-脂质体的方法，详情请见文献(基因治疗基本技术，实验医学分卷(Separate volume of Experimental Medicine，BasicTechnology in gene therapy)，Yodosha(1996)；基因导入和表达分析实验方法(Experimental Methods in Gene Introduction andExpression Analysis)，Yodosha(1997)；J.Clin.Invest.931458-1464(1994)；Am.J.Physiol.271R1212-1220(1996)等)和下文描述的实验实施例。对于HVJ，优选Z株(可从ATCC获得)，但也可使用其它HVJ株(例如，ATCC VR-907和ATCC VR-105)。
此外，直接导入裸DNA的方法是上述方法中最简单的方法，因而在这一点上是优选的导入方法。
本文所用表达载体可是任何表达载体，只要它们允许目的基因在体内表达，它们包括例如表达载体如pCAGGS(基因(Gene)108193-200(1991))、pBK-CMV、pcDNA3.1、pZeoSV(Invitrogen，Stratagene)等。
B.当使用病毒载体时对于病毒载体，代表性方法使用例如重组腺病毒、逆转录病毒等。更具体地，目的基因可导入DNA病毒或RNA病毒如去毒逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒、痘苗病毒、痘病毒、脊髓灰质炎病毒、新培斯病毒(Sindbis virus)、仙台病毒、SV40、人免疫缺陷病毒(HIV)等，然后将其感染细胞，以将该基因导入该细胞。
在上面的病毒载体中，已知使用腺病毒比使用其它病毒载体具有更高的感染效率。在这一点上，优选使用腺病毒载体系统。
作为将基因治疗剂导入患者的方法，有允许基因治疗剂直接导入体内的体内法，和离体法，在离体法中，从人体内取出一些细胞，并将基因治疗剂导入所述细胞，然后将所述细胞返回体内(NikkeiScience，1994年4月期第20-24页；Monthly Yakuji，36(1)23-48(1994)；实验医学增刊(Supplement to Experimental Medicine)12(15)(1994)；基因治疗的开发和研究手册(Handbook for Development andResearch of Gene Therapy)，日本基因治疗学会(Japan Society ofGene Therapy)编，NTS(1999))。根据本发明，优选体内方法。
给患者施用的部位基于待治疗的疾病、疾病状态等来选择。例如，除了直接给颅骨打洞并由此导入基因外，还有向侧脑室施用或向蛛网膜下隙施用。其中，向蛛网膜下隙施用是本发明公开的一种新的有效施用方法。当旨在根据原来的目的治疗疾病，即通过血管生成和/或抑制脑中神经元死亡治疗脑中血流量减少时，向蛛网膜下隙施用是期望的。
根据上述各种施用方案，剂量形式可采用多种形式(如液体)。例如，当要使用含有所述基因作为活性成分的注射液时，所述注射液可根据标准方法制备。例如，在适当溶剂(缓冲液如PBS，生理盐水，无菌水等)中溶解后，如果需要则用滤器过滤除菌，然后装入无菌容器中。可向注射液中加入常用载体等。对于脂质体如HVJ-脂质体，它们可采用悬浮液、冷冻制剂、离心浓缩的冷冻制剂等形式。
为了利于基因递送至损伤部位周围，可制备持续释放制剂(小粒制剂(minipellet formulation)等)，并植入损伤区域附近，或者它可用渗透泵等持续和逐渐地向损伤区域施用。
制剂中DNA含量可根据待治疗的疾病、患者的年龄和体重等适当控制，而且通常其范围是，本发明DNA为0.0001-100mg，优选0.001-10mg，优选每几天到几个月给一次。
现在，将参考下列实施例对本发明做具体解释。但是，应当注意，本发明不以任何方式被这些实施例限制。实验I.
用HGF基因和VEGF基因进行血管生成及其改善脑中血流量的效果的研究材料和实验方法1)双侧颈动脉的结扎用戊巴比妥钠(50mg/kg，腹膜内)麻醉雄性Sprague Dawley大鼠(350-400g；Charles River Japan，Atsugi city，Japan)，并使其在手术中能自发呼吸。通过颈正中切开，暴露双侧颈动脉，并用2-0丝紧紧结扎。
2)HVJ-脂质体复合物的制备用于制备HVJ-脂质体复合物的方法先前已有描述(J.Clin.Invest.931458-1464(1994)；Am.J.Physiol.271R1212-1220(1996))。简单地说，以重量比1∶4.8∶2混合磷脂酰丝氨酸、磷脂酰胆碱和胆固醇。用旋转蒸发器除去四氢呋喃以使脂质混合物(10mg)沉淀在烧瓶的侧壁上。干燥的脂质在200μl含有已插入了目标基因的表达载体的平衡盐溶液(BSS133μM NaCl，5.4μM KCl，10μM Tris-HCl，pH7.6)中水化。对照组中的脂质体含有无目的基因的表达载体(BSS 200μl)。脂质体通过振荡和超声处理制备。
临用前用紫外线照射(每秒110erg/mm2)3分钟灭活纯化的HVJ(Z株)。将脂质体混合物(0.5ml，含10mg脂质)与HVJ(在4ml总体积中含10,000血细胞凝集单位)混合。混合物在4℃孵育5分钟，然后在37℃轻轻振荡孵育30分钟。通过蔗糖密度梯度离心从HVJ-脂质体中除去游离HVJ。收集和使用蔗糖梯度的最上层。当按先前的报道(J.Clin.Invest.931458-1464(1994)；Am.J.Physiol.271R1212-1220(1996))计算时，质粒DNA的终浓度等于20μg/ml。制备的方法已被优化，以便获得最大转染效率。
3)体内基因导入为了建立有效的体内基因导入方法，我们测试了3种递送与HVJ-脂质体形成了复合物的质粒的不同方法1)直接导入颈内动脉，2)注射至侧脑室，和3)注射至所述池(蛛网膜下隙)。
为导入颈内动脉，用戊巴比妥钠(50mg/kg，腹膜内)麻醉雄性Sprague Dawley大鼠(350-400g)，并切开左侧颈总动脉，向其中引入聚乙烯导管(PE-50，Clay Adams，Parsippany，NJ)(Rakugi等)。通过暂时用结扎关闭，短时间隔离颈外动脉的远侧区。将HVJ-脂质体复合物(1ml)注射至该颈外动脉区。注射后，除去注射插管，松开结扎以恢复血流进入颈总动脉。
为注射至侧脑室，将麻醉大鼠放置在立体定位仪(NarishigeScientific Instrument Laboratory，Tokyo，Japan)上以暴露颅骨。按先前描述的方法(Am.J.Physio.271R1212-1220(1996))将带有特别设计的特氟隆(Teflon)连接器(FEP管，Bioanalytical Systems，WestLafayette，IN)的不锈钢插管(30号针头；Becton Dickinson，FranklinLakes，NJ)插入左侧脑室。立体定位坐标如下前卤点后，1.3mm；中线一侧，2.1mm；颅表面以下，3.6mm。将HVJ脂质体复合物注射至侧脑室(20μl)。注射HVJ-脂质体复合物后，除去注射导管。在所有接受注射的动物中均未观察到行为变化如四肢痉挛和异常运动。
为注射至蛛网膜下隙，将各动物的头在水平位置固定，通过枕骨正中切开，暴露寰枕膜。将不锈钢导管(27号针头；Becton Dickinson，Franklin Lakes，NJ)插入蛛网膜下隙。确认导管的位置，为了避免颅内压增加，取出100μl脑脊液。然后在一分钟以上的时间内小心注射HVJ-脂质体溶液(100μl100μg/ml)至所述池(蛛网膜下隙)内。然后将动物头朝下放置30分钟。施用预防性剂量的抗生素(30,000 U青霉素)以完成无菌过程。
4)激光多普勒成像使用激光多普勒图像仪(LDI)，在手术后连续记录血流量两周。为了产生持续扫描600μm深度的12×12cm组织表面的光束，LDI系统(Moore Instruments Ltd.，Devon，UK)具有2W的内置氦-氖激光器。根据多普勒原理(Doppler principle)，在扫描过程中，在血液系统中移动的血细胞改变入射光的频率。光二极管在相反方向收集散射光，并由此将初始光强度的变化转换成0-10V范围内的电压变化。0V灌流输出值标度为0％灌流量，而10V标度为100％灌流量。在扫描结束而且从所有测量点收集反方向的散射光后，显示血流量的色彩标记图像显示在电视监视器上。灌流信号分为六个不同的部分，每一个均以不同的颜色显示。血流量降低或无灌流用深蓝色表示，而最大灌流量显示为红色。
使用LDI，在阻塞之前、之后即刻、之后第7和14天记录脑表面的灌流量。沿着头皮上的正中切口，用电钻制作12×12cm的骨窗口。在该骨窗口上，获得连续的测量值。记录色彩标记的图像，并通过计算每只大鼠的平均灌流量进行分析。为了考虑包括周围环境光线和温度的变量，将灌流量的计算值表示为之后(缺血)与之前(未处理)脑的比值。
5)组织病理学检查在3％低聚甲醛/20％蔗糖溶液中固定一天后，每100μm冠板制备25μm冷冻切片用于X-gal染色。该切片用X-gal染色以鉴定表达β-半乳糖苷酶的染色神经元。每100μm冠板制备25μm冷冻切片用于碱性磷酸酶(ALP)染色。这些切片与含0.3％过氧化氢的PBS一起孵育，以降低内源性的过氧化物酶活性，然后在室温下与用含10％马血清的PBS稀释的第一抗体或凝集素孵育60分钟。在含2％马血清的Tris缓冲盐溶液中洗3次后，与该物种相适宜的、生物素标记的第二抗体孵育，然后与抗生物素蛋白-生物素过氧化物酶复合物(VectastainABC试剂盒，PK6100，Vector laboratories，Burlingame，CA)孵育。用二氨基联苯胺显现抗体结合。为了用作每一个抗体的阴性对照，略去第一抗体并用与该类型和种类相适宜的无关免疫球蛋白染色。
6)针对脑脊液(CSF)中的HGF和VEGF的ELISA法在该实验中，使用双侧颈动脉阻塞之前、之后第7天和之后第14天从大鼠获得的CSF(100μl)。用ELISA试剂盒(免疫学研究所(Institute of Immunology)，Tokyo)测定大鼠和人的HGF，而且人的VEGF也用ELISA试剂盒(R&D systems，Minneapolis，MN)测定。
7)实验材料用标准方法克隆人HGF的cDNA(专利2777678)，将其插入表达载体pcDNA(Invitrogen产)并用作人HGF基因。
用标准方法克隆人VEGF165的cDNA(科学2461306(1989))，将其插入表达载体pUC-CAGGS(Invetrogen产)并用作人VEGF基因。
使用人HGF cDNA(专利2777678)插入表达载体pcDNA(Invitrogen产)产生的重组表达载体，转染中国仓鼠卵巢细胞(ATCC)或C-127细胞(ATCC)，并用标准方法从其培养基中纯化人重组HGF，并使用该重组HGF。
基于上述材料和实验方法，实施下列实施例1-4。
首先，将HVJ-脂质体复合物直接注射颈内动脉，使其到达脑。然而，在上述颈动脉进行动脉内注射，注射后第3天和第7天在脑或微血管内皮细胞中几乎没有产生表达(数据未显示)。因此，将HVJ-脂质体注射至侧脑室和蛛网膜下隙。用HVJ-脂质体法注射β-半乳糖苷酶基因在注射后第3天和第7天产生β-gal的显著表达(图1和图2)。当注射至侧脑(lateral brain)时，主要在侧脑室和脉络膜丛(perichoroidal plexus)中观察到β-gal表达。相反，当注射至蛛网膜下隙时，在脑表面观察到到β-gal表达。前面的结果揭示，当要通过血管生成治疗脑中血流量减少时，注射至蛛网膜下隙更佳。
然后，测定HGF基因(HVJ-脂质体中的浓度20μg/ml)在颈动脉阻塞之后即刻导入蛛网膜下隙的大鼠的CSF中人HGF蛋白的浓度。转染后第7天，检测到人HGF，但没有大鼠HGF(图3)。在颈动脉阻塞的大鼠(1.63±0.16ng/ml)和未阻塞颈动脉的大鼠(1.67±0.29ng/ml)之间没有观察到显著差别。甚至在转染后第14天，还检测到人HGF(0.40±0.04ng/ml)(图3)。
以类似上述HGF基因的程序，将VEGF基因(HVJ-脂质体中的浓度20μg/ml)导入蛛网膜下隙，结果CSF中人VEGF浓度比HGF低得多(图4)(第7天；颈动脉未阻塞的大鼠为18.9±2.9pg/ml，颈动脉阻塞的大鼠为16.8±5.8pg/ml，第14天；颈动脉未阻塞的大鼠为11.7±1.6pg/ml，颈动脉阻塞的大鼠为9.9±1.5pg/ml)。这些差别的原因尚未知，但为了治疗血流量慢性减少，通过应用HGF引起血管生成看来是优选的。
然后，测定用重组HGF(200μg)、HGF基因(HVJ-脂质体中的浓度20μg/ml)和重组HGF与HGF基因的组合处理的大鼠。以实施例2和3类似的方式向蛛网膜下隙注射HGF基因和重组HGF。每种处理在颈动脉阻塞后10分钟时进行。在用重组HGF处理的大鼠中，与对照相比，没有观察到CBF显著增加(对照886.1±99.6，重组HGF985.5±142.4)(图7)。但是，在用HGF基因导入进行的处理中，在阻塞后第7天CBF显示显著增加(1214.5±145.1)。而且，出乎意料地，在用重组HGF和HGF基因联合导入处理的大鼠中，在第7天CBF比仅导入HGF基因高得多(1490.3±197.9)。这些结果说明，通过导入HGF基因产生的血管生成改善了脑血流量的慢性减少，而且，当在动脉阻塞后治疗时，HGF基因和重组HGF的联合是最有效的。
另一方面，因为VEGF基因也增加CBF(1122.8±265.3)(图7)，所以VEGF基因也显示可有效改善脑中血流量减少。
其次，研究了在动脉阻塞之前实施时所述处理的有效性。有趣的是，在动脉阻塞之前用HGF基因或VEGF基因处理预防了由于颈动脉阻塞引起的CBF减少(对照459.4±97.4，HGF796.4±204，VEGF737.6±211.5)(图8)。这些结果说明，当在缺血前递送时，HGF基因和VEGF基因的导入可有效预防由动脉阻塞引起的血流量减少。实验II关于HGF基因对脑中神经元死亡的抑制性作用的研究实验方法按上述实验I相同的方式制备本实验中使用的含有人HGF基因和人重组HGF的HVJ-脂质体复合物。
在本实验中，使用雄性蒙古沙土鼠(Mongolian gerbils)(体重50-70g)。将动物饲养在如下室内，其中温度维持在24℃，水和食物无限制供给。蒙古沙土鼠分为5组。“sham”对照组(未缺血刺激的组)，“vehicle”双侧颈动脉缺血5分钟组，“post G”双侧颈动脉缺血5分钟后导入HGF基因的组，“pre G”双侧颈动脉5分钟缺血前导入HGF基因的组，“post R”双侧颈动脉5分钟缺血后施用一次重组HGF基因的组。戴上面罩，进行3％卤烷的麻醉，并维持在1.5％卤烷、20％氧气和80％氮气的混合气体中。不断检测体温(直肠温度)以用热垫板维持在37℃左右。暴露双侧颈动脉后，用血管夹完全阻断血流5分钟。然后释放夹子以恢复血流。手术处理之前即刻或之后即刻，用HVJ-脂质体法从蛛网膜下隙导入人HGF基因(20μg)至脑脊髓腔(cerebrospinal cavity)。手术处理之后立即从蛛网膜下隙给予重组HGF(30μg)至脑脊髓腔。手术后，将笼子维持在37℃等待出现康复。对照组以与其它组相同的方式处理，只是不阻断血流。缺血后第4天和第7天，取出脑，并对切片进行HE染色、TUNEL染色和免疫染色，然后进行组织病理学分析。通过人HGF ELISA分析测定脑脊液中HGF的浓度。
基于上述实验方法，进行下面的实施例5。
通过在双侧颈动脉缺血5分钟，在脑的海马CA-1区观察到延迟神经元死亡(图10，vehicle组)。相反，施用HGF基因(PreG组和PostG组)或重组HGF(PostR组)显著抑制神延迟经元死亡(图11和图12)。当用ELISA法测定PostG组的脑脊液中HGF浓度时，甚至在7天后还观察到HGF表达(图13)。因此，说明HGF可有效抑制由脑缺血引起的延迟神经元死亡。
当用免疫染色方法研究HGF受体c-Met的表达部位时，在CA-1区观察到表达，说明HGF信号通过c-Met传递(图14)。
而且，当用TUNEL法对CA-1区中发生细胞凋亡的神经细胞染色时，在vehicle组观察到大量神经细胞的细胞凋亡(图15)。相反，在HGF基因施用组(PreG组和PostG组)中检测到只有少许细胞凋亡(图15)。因此，HGF基因的施用被认为抑制神经细胞的凋亡。为了探索抑制机制，通过免疫染色检查CA-1区中具有细胞凋亡抑制作用的Bcl-xl和HSP70的表达。Bcl-xL的表达显示在图16中，HSP70的表达显示在图17和图18中。通过施用HGF基因证实了在神经细胞中两种蛋白质的表达。上文揭示，HGF基因的施用诱导了Bcl-xL和HSP70的表达，并抑制神经细胞的凋亡。工业实用性根据本发明，可提供用于脑血管疾病的新的治疗或预防剂，其包含HGF基因和/或VEGF基因作为活性成分。本发明还提供新的施用方法，其包括向蛛网膜下隙施用所述治疗或预防剂。


通过向人蛛网膜下隙导入肝细胞生长因子(HGF)基因和/或血管内皮生长因子(VEGF)基因可有效治疗或防止脑血管疾病,如脑血管梗阻、脑梗死、脑血栓形成、脑栓塞、中风、脑出血、烟雾阴影疾病、脑血管性痴呆、阿尔茨海默痴呆等。