重组猪细小病毒vp2蛋白、表达该蛋白的重组多角体病毒及其在疫苗制备和病毒诊断中的应用的制作方法[0002]猪细小病毒(Porcine parvovirus, PPV)是引起猪繁殖障碍的主要病原之一，PPV感染的主要对象是孕猪，特别是怀孕前的初产母猪，能够引起怀孕母猪流产、产死胎、胎儿木乃伊化等，而母体通常缺乏临诊症状，此外也会引起其他症状。自1966年Mayr和Mahnel发现和证实PPV存在及其致病性以来，国内外学者对其进行了广泛深入的研究。近年来，PPV感染呈扩大上升趋势，给全球养猪业造成了巨大的经济损失。在我国，潘雪珠于1983年首次分离到了 PPV。此后，在各地陆续分离到了数株PPV，目前，人们发现猪细小病毒经常与其他一些病毒，例如猪圆环病毒2型和猪繁殖与呼吸系统综合征病毒等混合感染，导致断奶仔猪多系统综合征、皮炎、呼吸道综合征等，给世界的养猪业造成很大的损失。虽然不同分离株均属于同一血清型，但可以引起多种临床症状，但都以造成繁殖障碍为主。目前，我国经产母猪及种公猪PPV阳性率高达80%以上。[0003]由于PPV在细胞中增殖困难，效价不高，而其主要免疫原为VP2蛋白，因此本发明的发明人在2005年从黑龙江省某猪场分离到一株猪细小病毒，经实验室鉴定为强毒株，驯化克隆后将该毒株命名为PPV BQ-C株。该病毒株已记载在申请号为“201210166453.2”，发明名称为“猪细小病毒BQ-C株及其在制备猪细小病毒灭活疫苗中的应用”的专利申请中。将PPV BQ-C株的VP2基因，克隆到重组多角体病毒表达载体中，制备获得了高效价的表达VP2的重组多角体病毒，并开展了猪细小病毒病VP2亚单位灭活疫苗的研制开发工作，筛选培育出免疫原性良好、效价稳定的表达VP2的重组多角体病毒AcMNPV (pFastBac-VP2)，命名为重组多角体病毒AcMNPV (pFastBac-VP2株)，并且选择了最适合制备疫苗的灭活剂、佐剂及其他条件。对制品的生产工艺、安全性、保护率、免疫程序、最小剂量、抗体持续期和保存期等都进行了试验测定，并获得了大量的试验数据，结果证明本疫苗安全有效。在此基础上，进行了中试生产，经抽样检验，全部符合拟定的质量标准，并对中试产品进行了安全试验和效力试验，其结果也证实本疫苗能有效地预防由猪细小病毒引起的母猪繁殖障碍，在实验室试验、中间试验的基础上，本发明研制出了猪细小病毒(BQ-C株)VP2亚单位灭活疫苗，其结果也证实本疫苗能有效地预防由猪细小病毒引起的母猪繁殖障碍性，进一步验证了本疫苗的各项质量标准。同时，利用表达的VP2蛋白，制备了疫苗对应的ELISA检测方法。该方法敏感性好、特异性高，阴阳性临界值为:0.181+3X0.030=0.271，最后确定判定范围0.25-0.3为可疑。当0D450nm > 0.3判为阳性；0D450nm < 0.25为阴性。与法国LSI试剂盒的比较符合率为96.7%。
[0004]本发明的目的之一是提供一种改造后的重组猪细小病毒VP2蛋白，该蛋白具有效价高，免疫原性好等优点；[0005]本发明的目的之二是提供一种稳定表达上述重组猪细小病毒VP2蛋白的重组多角体病毒AcMNPV ；[0006]本发明的目的之三是提供所述改造后的重组猪细小病毒VP2蛋白在制备预防猪细小病药物以及在制备检测或诊断猪细小病毒抗体试剂，特别是ELISA检测试剂中的应用。[0007]本发明的目的之四是提供所述稳定表达重组猪细小病毒VP2蛋白的重组多角体病毒AcMNPV在制备预防猪细小病药物中的应用。
[0008]为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段:
[0009]本发明的发明人在利用已有发明的专利毒株PPV BQ-C株基因组为模板的基础上，对vp2基因序列用软件进行分析后发现，vp2基因序列在sf9细胞中表达效率较低，分析原因可能是这个序列来源于病毒，由于种属差异而无法在昆虫细胞中很好表
[0010]达。因此，为了获得能够在细胞中闻表达的天然蛋白序列，同时提闻抗原有效含量，本发明发明人对VP2无效抗原区域进行了分析改造，通过软件分析并结合具体实验验证，最终确定了改造后的vp2的基因序列(SEQ ID N0.2所示)及其编码蛋白序列(SEQ IDN0.1所示)，将改造后的序列进行了重新合成，然后将改造后合成的vp2基因转入重组多角体病毒转移载体PFastBacI中，构建重组质粒pFastPVP2，再将该重组质粒转入DHlOBac感受态细胞中，通过蓝白斑筛选挑取白色菌斑并用PCR的方法鉴定阳性菌落，提取基因组，SP为重组多角体病毒基因-杆粒。使用转染试剂Cellfectin(Invitrogen)将重组杆粒转入sf9细胞中，从而得到重组多角体病毒。将得到的重组多角体病毒接种sf9细胞，96小时后收获细胞，-20°C反复冻融后通过进行western blot、IPMA鉴定,发现VP2蛋白得到成功的表达，并且，通过以上改造，使得同样条件下表达的改造后的VP2蛋白HA效价由改造前的213提高到218。表达该VP2蛋白的重组多角体病毒AcMNPV，命名为pFastBac_VP2。
[0011]因此，本发明提出了一种改造后的重组猪细小病毒VP2蛋白，所述重组猪细小病毒VP2蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示。及
[0012]编码所述的重组猪细小病毒VP2蛋白的核苷酸序列，优选的，所述的核苷酸序列如 SEQ ID N0.2 所示。
[0013]含有所述的核苷酸序列的表达载体以及含有所述表达载体的宿主细胞也在本发明的保护范围之内。
[0014]进一步的，本发明还提出了所述的重组猪细小病毒VP2蛋白在制备猪细小病毒VP2亚单位疫苗以及在制备诊断或检测猪细小病毒感染的试剂中的应用。
[0015]本发明一种猪细小病毒VP2亚单位灭活疫苗，其特征在于含有所述的重组猪细小病毒VP2蛋白。
[0016] 在本发明所述的猪细小病毒VP2亚单位灭活疫苗中，优选的，所述的猪细小病毒(BQ-C株)VP2亚蛋白采用以下方法进行灭活:[0017]所述的猪细小病毒VP2亚单位灭活疫苗是由0.2% (w/w)的二乙烯亚胺(BEI)在32°C条件下灭活96小时后，加入0.02% (w/w)硫代硫酸钠终止灭活后，采用15% (v/v)的法国赛比克公司的商品化MontanideTM ISA11R佐剂经乳化后得到。
[0018]在本发明中，乳化工艺是采用法国赛比克公司的商品化MontanideTM ISAllR佐剂，除菌后可直接用于疫苗乳化制备；乳化前将灭活的同批病毒液解冻混合，在无菌室内用匀浆机以200r/min搅拌均匀，然后按照水相抗原与油相佐剂按照体积比8.5:1.5配比混合；乳化程序为先将水相放入乳化器中进行搅拌，然后缓缓加入油相佐剂，以800r/min连续搅拌30分钟；生产得到的疫苗属水包油剂型，为了稳定界面和消除气泡，获得最佳乳化效果，需要静止30分钟后分装。
[0019]本发明一种用于诊断或检测猪细小病毒感染的ELISA诊断试剂盒，其特征在于含有所述的重组猪细小病毒VP2蛋白。
[0020]本发明利用表达的VP2蛋白，制备了对应的ELISA检测方法。该方法敏感、特异，阴阳性临界值为:0.181+3X0.030=0.271，最后确定判定范围0.25-0.3为可疑。当0D450nm> 0.3判为阳性；0D450nm < 0.25为阴性。与法国LSI试剂盒的比较符合率为96.7%。
[0021]更进一步的，本发明提出了一种表达猪细小病毒VP2蛋白的重组多角体病毒AcMNPV，本发明的重组多角体病毒AcMNPV，为在sf9细胞上传代后的第10代病毒株，该病毒株命名为pFastBac-VP2，分类命名为表达猪细小病毒VP2蛋白的重组多角体病毒，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址在北京市朝阳区北辰西路I号院中科院微生物研究所，其菌种保藏编号为=CGMCC N0.9004，保藏日期为2014年3月26日。其中，由该病毒株表达的猪细小病毒VP2蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示。
[0022]本发明还提供了所 述的病毒在Sf9细胞中高效表达VP2的关键参数。通过改变病毒的高效感染复数(Μ0Ι)、血清浓度，进而改变了病毒复制的生长动力学曲线，使得病毒的后代的质量、细胞外环境，重组蛋白产量都有所改变。VP2的HA效价由213提高到218。
[0023]本发明的一种利用所述重组多角体病毒AcMNPV (pFastBac_VP2)表达猪细小病毒VP2蛋白的方法，其特征在于包括以下步骤:
[0024](I)悬浮培养Sf9细胞，待细胞密度达到5-10 X IO5个细胞/毫升时，停止培养，准
备接毒；
[0025](2)保持摇床转速在120rpm的条件下，将所述的重组多角体病毒AcMNPV(pFastBac-VP2)以感染复数MOI为10PFU/细胞接入经步骤(1)培养得到的Sf9细胞，120rpm培养24-48小时后收获病毒；
[0026](3)纯化VP2蛋白，即得。
[0027]再进一步的，本发明还提供了所述的病毒在制备猪细小病毒VP2亚单位灭活疫苗中的应用。
[0028]再进一步的，本发明还提供了所述的VP2亚单位灭活疫苗在制备预防由猪细小病毒引起的疾病的生物制品中的用途。特别地，所述的疾病为初产健康阴性母猪发生的母猪
繁殖障碍。



[0029]图1为抗原区改造前后有效和无效抗原区对比图；其中图1A为改造前；图1B为改造后;
[0030]图2为表达VP2的重组多角体病毒AcMNPV (pFastBac_VP2株)在sf细胞上培养后的IPMA检测结果；
[0031]图2A为接种未表达VP2的野生型重组多角体病毒在sf细胞上培养后的IPMA检测结果；图2B为接种表达VP2的重组多角体病毒AcMNPV (pFastBac_VP2株)在sf细胞上培养后的IPMA检测结果；
[0032]图3为VP2蛋白检测及纯化结果。
[0033]图3A为蛋白初步纯化结果；图3B为第一批蛋白样品经Ni2+填料亲和层析后的电泳结果蛋白纯度在20%，总蛋白量很高；图3C为第二批蛋白样品经Ni2+填料亲和层析后的电泳结果；图3D为经Ni2+填料亲和层析后的蛋白再经30kD超滤离心后的蛋白电泳结果，蛋白纯度在30%，总蛋白量很高。

[0035]实施例1:VP2[Porcine parvovirus]GenBank:ACF39501.1 表达基因的改造
[0036]为了提高抗原有效含量，本发明根据基因软件分析，对VP2无效抗原区域进行了分析改造，提高了抗原有效区域。具体分析改造过程如下:
[0037]I)改造前蛋白序列:
[0038]GenBank 登录号=ACF395Ol.1
[0039]2)改造前有效抗原区(线轴上面区域)和无效抗原区(线轴下面区域)分析结果如附图1A所示，改造前I以及改造前2分别为改造前序列的部位I和部位2的分析结果。
[0040]3)本发明针对无效区域进行改造，改造后有效抗原区(线轴上面区域)和无效抗原区(线轴下面区域)结果如附图1B所示，改造后I以及改造后2分别为改造后序列的部位I和部位2。从图1结果可以看出改造后的有效抗原区域扩大了 2倍以上。
[0041]4)需要优化和改造的序列:根据以上分析结果，我们确定需要改造和优化的区域序列是:GVSTGSFNNQTEFQXEINLVSFEQXSATSPPTKIYNNDLTXETLGFYPWLPTKPTQ YRYYLSCTRXETLGFYPWLPTKPTQYRYYLSCTRXVGYNTPYMNFXYQHGQLTT SSQELERYTFXMNTLNTYGPLTALNNTAPVFPNGQIffDKELDTDLKPRLHVTAPF VCKNNPPGQLFVKIAXFNADSPQQPRIITYSNFWWKXAENIGNYIPTNIGGIKMFPEYSQLIPRKLY，其中X代表可以在不同载体中进一步优化的序列。
[0042]5 )序列的优化及合成
[0043]通过软件分析并结合具体实验验证，最终确定了改造后的vp2基因序列(SEQ IDN0.2所示)及其编码蛋白序列(SEQ ID N0.1所示)。
[0044]通过以上改造，同样条件下表达的VP2蛋白HA效价由213提高到218，由此可见改造后的VP2蛋白HA效价得到明显提高。
[0045]实施例2:表达VP2的重组多角体病毒AcMNPV (pFastBac_VP2株)的制备及鉴定
[0046]I毒种来源及标准
[0047]根据新生物制品申报要求，结合本发明获得的大量的试验数据，参照《中国兽药典》(2005年版)，对制苗用毒种进行了鉴定，现将试行规程(草案)中毒种标准进行以下说明。
[0048]1.1毒种来源及培养方法
[0049]本发明所述的毒种为表达VP2的重组多角体病毒AcMNPV (pFastBac_VP2株)，是本发明人利用PPV BQ-C株基因组为模板，将VP2基因进行改造以后，将VP2基因(SEQID N0.2所示)转入重组多角体病毒转移载体pFastBacI中构建重组的质粒pFastPVP2，再将该重组质粒转入DHlOBac感受态细胞中，通过蓝白斑筛选挑取白色菌斑并用PCR的方法鉴定阳性菌落，提取基因组，即为重组多角体病毒基因-杆粒。使用转染试剂Cellfectin(Invitrogen)将重组杆粒转入sf9细胞中，从而得到重组多角体病毒。将得到的重组多角体病毒接种sf9细胞，96h后收获细胞，-20°C反复冻融后通过进行westernblot、IPMA鉴定，发现VP2蛋白得到成功的表达，表达VP2的重组多角体病毒AcMNPV(pFastBac-VP2)在sf细胞上培养后的IPMA检测结果如图2所示。该表达VP2的重组多角体病毒，为在sf细胞上传代后的第10代病毒株,命名为pFastBac-VP2,分类命名为表达猪细小病毒VP2蛋白的重组多角体病毒，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址在北京市朝阳区北辰西路I号院中科院微生物研究所，其菌种保藏编号为:CGMCC N0.9004，保藏日期为2014年3月26日。其中，由该病毒株表达的猪细小病毒VP2蛋白的氨基酸序列如SEQ IDN0.1所示。
[0050]培养:sf细胞密度为5-10X105个细胞/毫升，感染的MOI为10PFU/细胞，并确保在250mL摇瓶同步感染(转速120RPM)。42小时以后收获病毒，此时细胞感染量为90%以上，VP2的HA效价为218，比一般文献报道的213高32倍。
[0051]1.2 毒种(pFastBac_VP2 株)标准
[0052]1.2.1红细胞凝集价
[0053]取96孔U型微量反应板，每孔加入25 μ I PBS (0.01mol/L，pH值7.0~7.4)，第一列各孔中加入25 μ I抗原，然后将抗原进行2倍系列稀释，直至第11孔弃去25 μ I。每孔加入25 μ I PBS,再加入0.6%豚鼠红细胞悬液25 μ 1，用微量振荡器混合均匀，置室温下作用I小时。判定结果时，以50%红细胞凝集的抗原最高稀释倍数作为判定终点。
[0054]结果:毒种对豚鼠红细胞凝集价应不低于1:512。
[0055]1.2.2病毒含量
[0056]以培养液将毒种作连续10倍系列稀释，每个稀释度取100 μ I加入96孔细胞培养板中，每个稀释度作8个重复，随后加入消化分散的sf9细胞悬浮，每孔100 μ I (细胞含量以3父105/1^)，并设正常细胞培养对照，置221:、含5%的CO2培养箱中培养，逐日观察细胞病变(CPE)，细胞固缩，聚集，颗粒增多，有的细胞融合、脱落、出现较多空隙则判为CPE。观察7日，记录细胞病变的孔数，按照Reed-Muench法计算病毒的TCID5(I。
[0057]结果:每毫升病毒液不低于106_°TCID5。。
[0058]1.2.3免疫原性
[0059] 将毒种接种sf9细胞进行增殖，收获病毒液，纯化获取VP2蛋白，用BEI灭活后，加MontanideTMISA15AVG佐剂混合乳化制成水包油型灭活疫苗，用健康易感初产母猪(PPVHI抗体效价不高于1:8) 5头，配种前肌肉注射上述制备得到的灭活疫苗2ml，在妊娠后35~40日，连同条件相同的对照猪5头，滴鼻并经肌肉注射猪细小病毒BQ-C株各2ml(106_°TCID5Q)，攻毒后40日剖杀所有猪。对照组应至少4头出现死胎、木乃伊胎或胎儿重吸收等繁殖障碍症状，免疫组应至少4头保护。
[0060]1.2.4纯净检验
[0061]对建立的表达VP2的重组多角体病毒AcMNPV (pFastBac_VP2株)的原始种子批第10~11代、基础种子批第12~21代和生产种子批第22~25代进行了细菌、霉菌、支原体检验，并对第11、12和24代次毒种进行了外源病毒的检验，结果表明，本发明建立的原始种子批、基础种子批、生产种子批均无细菌、霉菌、支原体和外源病毒污染，均纯净。 [0062]1.2.5毒种使用代次
[0063]将原始得到的表达VP2的重组多角体病毒AcMNPV (pFastBac_VP2株)，在sf9细胞上连续传40代(即在菌种保藏编号为XX的菌株基础上连续传代30代)，测定了每一代病毒的TCID5tl,选择第15、20、25、30、35、40代病毒表达的VP2用BEI灭活后，分别加Montanide?ISA15AVG佐剂混合乳化制成水包油型灭活疫苗，接种5月龄后备猪，妊娠35天时进行攻毒。
[0064]结果表明，病毒在sf9细胞上传代，第10代以后(包括第10代病毒，即菌种保藏编号为CGMCC N0.9004的病毒株)各代次病毒含量稳定，均不低于106_ciTCID5tl，且表达蛋白HA效价均在29以上，已经达到了做疫苗的标准。
[0065]攻毒试验表明，第10、15、20、25、30代病毒制备的疫苗免疫猪在对BQ-C株攻击的保护性无显著差异，胎儿均健康存活。根据以上结果，为保证生产毒种良好的免疫原性和安全性，本发明确定了病毒的传代最高次数在30代，原始毒种为10~13代，基础毒种为第14~25代，生产用毒种最高传代次数限制在3代(第25~27代)以内。
[0066]1.2.6毒种保存期的确定
[0067]将表达VP2的重组多角体病毒AcMNPV (pFastBac_VP2株)株湿毒保存在_20°C和_70°C下，于保存后不同时间取样进行HA效价和TCID5tl测定，结果显示湿毒于-20°C冻存18个月、于-70°C保存30个月时毒价开始明显下降；冻干毒保存在-20°C和_70°C下，于保存后每年取样进行HA效价和TCID5tl测定。结果在-20°C下保存36个月的病毒的效价略有下降，保存48个月病毒的HA效价和TCID5tl值明显下降，而在-70 V下保存48个月病毒的HA效价和TCID5tl没有明显的变化，保存60个月下降明显。考虑到在病毒保存时存在的其他不利因素，保证病毒保存期可靠性，所以将表达VP2的重组多角体病毒AcMNPV(pFaStBac-VP2株)湿毒在_20°C的保存期定为12个月，在-70°C的保存期定为24个月。
[0068]2表达重组猪细小病毒VP2蛋白
[0069]利用所述重组多角体病毒AcMNPV (pFastBac_VP2株)表达猪细小病毒VP2蛋白的方法，包括以下步骤:
[0070](I)悬浮培养Sf9细胞，待细胞密度达到5-10 X IO5个细胞/毫升时，停止培养，准
备接毒；
[0071](2)保持摇床转速在120rpm的条件下，将所述的重组多角体病毒AcMNPV以感染复数MOI为10PFU/细胞接入经步骤(1)培养得到的Sf9细胞，120rpm培养42小时后收获病毒，此时细胞感染量为90%以上，VP2的HA效价为218，比一般文献报道的213高32倍；
[0072](3)纯化VP2蛋白，采用His标签蛋白纯化试剂盒(北京天恩泽(http://www.tiandz.com)—站式His标记蛋白质微量纯化套装)制备蛋白，具体方法参考说明书。纯化后进行蛋白浓度测定。即得。[0073]实施例3VP2亚单位灭活疫苗的制备
[0074]猪细小病毒VP2亚单位灭活疫苗的制备工艺流程是按照目前已经成熟的商品化疫苗制备工艺制备。从实验室制备的3批疫苗和中间试制的5批疫苗质检结果来看，用该工艺流程制备的疫苗产品质量稳定，效检结果完全符合所制定的质量标准。
[0075]1VP2亚单位液的制备
[0076]取制备好的重组多角体病毒AcMNPV第10代病毒pFastBac_VP2株(菌种保藏编号为:CGMCC N0.9004)，按照感染复数为10PFU/细胞接种Sf9无蛋白培养基，加3%小牛血清，细胞密度为10X IO5个细胞/毫升，培养42h收毒，此时细胞感染量为90%以上。采用His标签蛋白纯化试剂盒(北京天恩泽(http://www.tiandz.com) 一站式His标记蛋白质微量纯化套装)制备蛋白，具体方法参考说明书。纯化后进行蛋白浓度测定。
[0077]2灭活工艺
[0078]选择终浓度为0.1%、0.2%、0.3%、0.4%的甲醛溶液或终浓度为0.1%、0.2%、0.3%、
0.4%的二乙烯亚胺(BEI)对VP2亚单位液分别进行灭活比较试验，试验结果表明，0.2% (w/w)的BEI在32°C条件下96小时后可将VP2及其他残余微生物完全灭活，而且，试验结果表明BEI对细胞的损伤较小；抗原加入0.3%的甲醛溶液，经37°C灭活48小时亦可达到完全灭活病毒的目的；但甲醛具有强刺激性，如果疫苗中残留游离的甲醛进入动物机体，会产生不良反应。因而最终确定用0.2% (w/w)的BEI在32°C条件下灭活96小时后，加入0.02%(w/w)硫代硫酸钠终止灭活。
[0079]3乳化工艺
[0080]采用法国赛比克公司的商品化Montanide? ISAllR佐剂，除菌后可直接用于疫苗乳化制备；乳化前将灭活的同批VP2亚单位液液解冻混合，在无菌室内用匀浆机以200r/min搅拌均匀，然后按照水相抗原与油相佐剂按照体积比8.5:1.5的配比混合；乳化程序为先将水相放入乳化器中进行搅拌，然后缓缓加入油相佐剂，以800r/min连续搅拌30分钟；生产得到的疫苗属水包油剂型，为了稳定界面和消除气泡，获得最佳乳化效果，需要静止30分钟后分装。
[0081]4半成品检验质量标准
[0082]4.1无菌检验
[0083]按现行《中国兽药典》附录进行检验，应无菌生长。
[0084]4.2VP2含量测定
[0085]采用HA测定法。每毫升VP2液不低于29HA。
[0086]4.3灭活检验
[0087]取灭活后的病毒液，按病毒液与生长液1: 10的比例接种于sf9细胞3瓶(细胞含量以2X106/ml)，22°C培养观察5日，对无病变者再盲传3代，同时设病毒对照。结果无细胞病变，即为灭活完全。实验室生产的3批半成品均合格，即猪细小病毒VP2亚单位灭活疫苗 1201,1202 和 1203。
[0088]5关于成品检验质量标准
[0089]5.1安全检验标准
[0090] 为了保证疫苗的安全性，本发明对实验室制备的5批疫苗先后进行了 “对小白鼠的安全性试验”、“对仔猪单剂量接种、单剂量重复接种、一次性超剂量(2倍剂量)接种的安全性试验”、“对后备母猪单剂量接种、单剂量重复接种、一次性超剂量(2倍剂量)接种的安全性试验”。试验结果表明:各免疫动物单剂量接种、单剂量重复接种、一次性大剂量接种后，猪只状态均良好，采食饮水正常，无异常反应；疫苗接种后对妊娠母猪的繁殖功能也无明显影响。以上试验均证明疫苗是安全的。通过试验观察本发明总结出只要接种疫苗后21日内不出现局部红肿、溃疡、糜烂以及神经萎缩、采食减少等现象，以后就不会出现因为疫苗接种而引起的不良反应，就可以证明疫苗的安全性。因此，在试行规程(草案)中规定:用10~20kg健康易感仔猪(HI抗体效价不高1:8) 2头，各深部肌肉注射疫苗4ml，另取条件相同的2头猪不接种作为对照，连续观察21日。在观察期内应不出现由疫苗注射引起的任何局部或全身不良反应。
[0091]5.2效力检验标准的制定
[0092]5.2.1抗体效价与免疫攻毒保护相关性试验
[0093]将安全性试验合格的I批猪细小病毒VP2亚单位灭活疫苗1201，按照不同剂量0.5ml/头份、lml/头份、2ml/头份、4ml/头份分别免疫3~5月龄的健康后备母猪(PPVHI抗体不高于8)，并以106_°TCID5Q/ml PPV BQ-C株第10代强毒4ml攻击，以确定HI抗体滴度与免疫攻毒保护的相关性。试验结果表明，当血清HI抗体效价在不低于1:64时，母猪产仔成活率达97.5%，其中一组中有一头猪仔流产，但PCR检测仔猪病毒分离率为0，也无其他引起母猪流产的病原感染。以上结果表明在试验条件下，当血清HI抗体效价在不低于1:64时，能有效阻止病毒经母体垂直传给胎儿。因而确定疫苗效力检验时，检验标准为免疫28日后，其血清HI抗体效价不低于1:64。
[0094]5.2.2最小免疫剂量试验
[0095]将安全性试验合格的3批猪细小病毒VP2亚单位灭活疫苗1201、1202和1203，按照不同剂量0.5ml/头份、lml/头份、1.5ml/头份、2ml/头份分别免疫3~5月龄的健康后备母猪(PPV HI抗体不高于8)，于免疫后28日采血进行HI抗体检测。结果显示，以lml/头份剂量免疫猪28日后HI抗体效价平均值不低于1:64，而1.5ml/头份以上剂量免疫猪28日后HI抗体效价均不低于1:64。根据HI抗体效价与攻毒保护相关性试验结果，确定在免疫后28天猪细小病毒HI抗体效价达到1:64以上时，可以完全保护怀孕母猪抵抗猪细小病毒强毒的攻击。本发明将猪细小病毒VP2亚单位液灭活疫苗的最小免疫剂量确定为1.5ml/头份。
[0096]6抗体消长规律与免疫持续期试验
[0097]将安全性试验合格的3批猪细小病毒VP2亚单位灭活疫苗1201、1202和1203分别免疫健康后备母猪、经产猪和公猪。为进一步掌握免疫效力及免疫持续期，制定合理的免疫程序，保证免疫猪群保持高而持久的抗体水平，对免疫猪不同时间进行抗体检测，以掌握其抗体消长规律。
[0098]试验结果表明，3~5月龄初产母猪免疫1.5ml/头份，2~3周后加强免疫一次，经产母猪于配种前一个月免疫1.5ml/头份，28日后其血清HI抗体不低于1:64，免疫后抗体高峰在2~6个月内，其后抗体水平逐渐下降，至9个月仍达1:64，为保证疫苗的免疫保护效果，确定其免疫持续期为7个月。
[0099]7免疫程序的确定
[0100]根据仔猪母源抗体的持续时间，初次免疫应在5~6月龄，因为这时母源抗体已下降到较低水平(HI抗体效价低于1:64)。而且后备母猪配种时间一般为6月龄，这样在5~6月龄时免疫也正好可以避免母猪在妊娠时遭受强毒攻击。对于经产母猪由于其体内抗体的持续存在，猪细小病毒对其往往不构成威胁，所以在以前一般不进行免疫，但近几年由于临床发病的复杂性，如猪细小病毒往往会加重猪圆环病毒的感染等，所以本发明主张对经产母猪在妊娠前进行免疫，这样可以保护妊娠母猪在整个妊娠期避免猪细小病毒强毒的攻击。
[0101]根据后备母猪的配种时间、后备母猪免疫后的抗体消长规律、免疫期，同时结合临床上猪细小病毒感染的实际情况，本发明确定了猪细小病毒VP2亚单位灭活疫苗的免疫程序为:初产母猪5~6月龄免疫I次，2~4周后加强免疫I次；经产母猪于配种前3~4周免疫I次；公猪每年免疫两次。每次免疫均为1.5ml/头。
[0102]8疫苗的保存期
[0103]本发明对实验室制备的3批VP2亚单位灭活疫苗1201、1202和1203保存期进行了试验研究，将3批疫苗在2~8°C条件下保存9、12、15、18个月，在各个时间段分别取样对其性状、安全性及免疫效力检测。结果显示，3批疫苗在2~8°C条件下保存18个月性状不发生明显变化，无菌检验和安全性都符合质量标准的要求。效力检验中1201批疫苗保存18个月样品免疫豚鼠后有一只豚鼠HI抗体效价为1:32 ；1201和1202批疫苗保存18个月样品免疫猪后均有一头猪HI抗体效价为1:32，但免疫猪平均HI抗体水平为1:64，考虑到疫苗在运输和使用过程中造成的效价损耗，本发明将疫苗的保存期定为2~8°C条件下保存15个月。
[0104]9与全病毒灭活商品苗的免疫效力比较
[0105]将实验室试制的VP2亚单位灭活疫苗1201、1202和1203与全病毒灭活商品苗，分别免疫350g~400g健康豚鼠及5~6月龄健康后备猪，28日后其血清HI抗体效价均不小于1:64，达到攻毒保护要求，实验室制备的疫苗HI抗体平均值均略高于市售全病毒灭活商品苗。
[0106]实施例4rVP2_ELISA试剂盒的制备
[0107]1、利用纯化后的重组VP2蛋白(氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示)作为包被抗原，初步建立了检测PPV抗体的间接ELISA方法，VP2蛋白检测及纯化结果如图3所示，同时对反应条件进行了优化:包被液和封闭液分别为2mM pH8.0TrisHcl和5%脱脂乳，抗原的最佳包被浓度为2ug/mL ;血清最佳的稀释倍数为1:200，酶标二抗的工作浓度为1:6000，一抗、二抗工作时间均为60min,显色时间为15min。
[0108]试验结果表明:所建立的ELISA方法的阴阳性临界值为:0.181+3X0.030=0.271，最后确定当0D450nm > 0.3判为阳性；0D450nm < 0.25为阴性，判定范围在0.25-0.3时为可疑。
[0109]应用该检测方法对黑龙江、山东、天津等地区的596份临床血清进行检测，阳性检出率为83.5%~91.1%，平均阳性检出率为87.03%，选取92份临床样品与法国LSI试剂盒比对，两者符合率是96.7%。
[0110]2、结论
[0111] 以上实验结果表明本发明所建立的检测PPV抗体的间接ELISA方法特异性、敏感性和可重复性均比较理想。[0112]因此，本发明建立的一种检测PPV抗体的间接ELISA方法，为PPV抗体检测提供了有效的方法，为猪细小病毒检测试剂盒的研制提供了物质基础。 [0113]以上所述仅为本发明的优选实例，对本发明而言仅是说明性的，而非限制性的；本领域普通技术人员理解，在本发明权利要求所限定的精神和范围内可对其进行许多改变，修改，甚至等效变更，但都将落入本发明的保护范围内。