具有抗皮肤老化作用的蚯蚓提取物及其制备方法和应用的制作方法【技术领域】，特别是涉及一种具有抗皮肤老化作用的蚯蚓提取物及其制备方法和应用。[0002]蚯蚓，是我国传统的一味中药，也称为地龙，具有清热定惊、通络、平喘等作用。目前蚯蚓临床上的用药主要是传统煎煮的提取物或蚯蚓粉，以及通过低温抽提的蚯蚓蛋白粗提物，用于溶栓和抗栓，以及预防和治疗心血管、高血压和高血脂等疾病。[0003]蚯蚓体内含有丰富的蛋白质类、脂肪类，以及蚯蚓素、人体必需的微量元素和维生素等活性成分。蚯蚓通过在一定温度下自溶或外加蛋白酶水解制备的小分子蚯蚓提取物，具有防治高血压、抗菌和抗病毒等作用。但是，还未见制备小分子蚯蚓提取物，用于抗皮肤老化产品的开发。在小分子蚯蚓提取物制备过程中，除了主要生成多肽类，还会产生氨基酸、水溶性小分子脂肪酸等活性成分。现有制备技术中，一方面往往忽视了这些活性成分，以及蚯蚓体内自身含有的维生素和微量元素等其他小分子物质；另一方面制备提取物腥味较重，影响产品的后续开发。
[0004]本发明主要解决的技术问题是提供一种具有抗皮肤老化作用的蚯蚓提取物及其制备方法和应用，该制备方法绿色简单，得到的蚯蚓提取物具有很强的抗氧化活性。[0005]为解决上述技术问题，本发明采用的一个技术方案是:提供一种具有抗皮肤老化作用的蚯蚓提取物，所述蚯蚓提取物中包括分子量小于等于3万道尔顿的多肽、氨基酸、蛋白质、蚯蚓素、维生素和微量元素`。[0006]提供一种具有抗皮肤老化作用的蚯蚓提取物的制备方法，包括步骤为:
[0007](I)将干净鲜蚯蚓搅碎得到蚯蚓样品液，或将蚯蚓干品捣碎并浸泡于水中得到蚯虫引样品液；
[0008](2)所述蚯蚓样品液利用所述蚯蚓样品液中自身含有的酶或加入的蛋白酶水解，得到蚯蚓水解液；
[0009](3)将所述蚯蚓水解液经截留分子量小于等于3万道尔顿的超滤膜超滤，得到的超滤液冷冻干燥，得到蚯蚓提取物。
[0010]在本发明一个较佳实施例中，步骤(1)中所述蚯蚓为钜蚓科动物参环毛蚓、通俗环毛蚓、威廉环毛蚓、栉盲环毛蝈、湖北环毛蚓、直隶环毛蚓、异毛环毛蚓、白颈环毛蚓、背暗异唇蚓或赤子爱胜蚓中的一种或多种。
[0011]在本发明一个较佳实施例中，步骤(1)中所述干净蚯蚓是将新鲜的蚯蚓洗净，置于水中1-48小时得到，所述捣碎的蚯蚓干品与水的比例为Ig: 0-20ml，所述浸泡时间为0-48h。
[0012]在本发明一个较佳实施例中，步骤(2)中所述蚯蚓样品液与所述水的体积比为1: 1-10，所述水解的条件为pH值为2-10、温度为20-70°C、水解时间为0.5-10h。
[0013]在本发明一个较佳实施例中，步骤(3)中所述蚯蚓水解液是通过小于等于3万道尔顿超滤膜超滤，截留去除了蚯蚓自身含有的腥味成分，得到蚯蚓提取物。
[0014]提供一种具有抗皮肤老化作用的蚯蚓提取物在抗皮肤老化化妆品或保健品中的用途。
[0015]本发明的有益效果是:本发明的蚯蚓提取物及其制备方法和应用，得到的蚯蚓提取物去除了蚯蚓原有的腥味，具有明显的抗氧化活性，可以有效促进人皮肤成纤维细胞的生长和增殖，促进胶原蛋白等基质的合成，最终达到抗老化作用，可应用于具有抗皮肤老化作用的化妆品和保健品的开发中。



[0016]为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图，其中:
[0017]图1是本发明的蚯蚓提取物的高效液相色谱图。

[0018]下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
[0019]实施例一:
[0020]提供一种具有抗皮肤老化作用的蚯蚓提取物的制备方法，包括步骤为:
[0021](1)将新鲜的蚯蚓洗净，置于去离子水或纯净水中24h，排尽体内的食物残渣，然后用高速捣碎机将洗净的蚯蚓捣碎,蚯蚓捣碎液即为鲜蚯蚓样品液；其中所述新鲜蚯蚓为矩虫引科动物参环毛蝴(P.aspergillum(E.Perrier))、通俗环毛蝴(P.vulgaris Chen)、威廉环毛虫引(P.guillelmi (Michaelsen))、木节盲环毛蝈(P.pectinifera(Michaelsen))、湖北环毛虫引(P.hupeiensis)、直隶环毛虫引(P.tschiliensis)、异毛环毛虫引(P.diffringens)、白颈环毛虫引(P.californica)、背暗异唇虫引(Allolobophora caliginosa trapezoides)或赤子爱胜蝴(Eisenia foetida)等中的一种或多种。
[0022](2)向蚯蚓样品液中加入2倍体积的去离子水，利用自身酶进行水解，酶解条件为:pH值为6.5、温度为40°C、水解3h，即得蚯蚓水解液。
[0023](3)蚯蚓水解液经截留分子量为3万道尔顿超滤膜过滤，去除水解液中的腥味物质，超滤液冷冻干燥，得到蚯蚓提取物，为淡黄色粉末，无腥味。
[0024]在步骤(1)中也可以采用干蚯蚓作为原料时，蚯蚓粉碎后进行水提，水提样液可以和鲜蚯蚓样液混合，通过鲜样液中自身酶进行水解；也可以通过外加蛋白酶进行水解，制备得到的蚯蚓提取物与鲜蚯蚓自溶制备得到的提取物性状相同。
[0025]实施例二:[0026]蚯蚓提取物中成分的分析实验:
[0027](I)蚯蚓提取物中多肽和蛋白的分子量分布情况:
[0028]实验步骤:按照大豆肽粉的国标GB / T22492-2008方法，对蚯蚓自溶获得的多肽分子量的分布情况进行分析。采用Agilentl200系列高效液相色谱仪、TOSOHTSK-Gel-2000SWXL(300X7.8mm)的色谱柱、检测波长220nm，流动相乙腈:水:三氟乙酸的体积比为20: 80: 0.1，流速为0.5ml / min，柱温为25°C，进样量为20 μ I。采用溶菌酶、胰岛素、杆菌肽和谷胱甘肽为参照，绘制标准曲线。
[0029]实验结果:请参阅图1，HPLC检测结果如图所示，经对照标准蛋白出峰时间，蚯蚓提取物主要含有多肽和氨基酸的混合物，只含有少量的相对分子质量在I万以上(保留时间为15.48min之前的峰)的蛋白质。
[0030](2)双缩脲试剂法测定多肽和蛋白的浓度:
[0031]双缩脲试剂的配制:a) 4g无水Na2CO3溶解于200ml的0.1mol / I的NaOH溶液中，即为试剂A ；b)0.5g CuSO4.5H20溶解于IOml的1%酸钾钠溶液中，即为试剂B ；c)将试剂A与试剂B以5:1的比例进行混合摇匀，即为双缩脲试剂。
[0032]测定步骤:用去离子水配制蚯蚓提取物溶液，2ml样品液添加至4ml双缩脲试剂中混匀，于室温下放置30min，540nm处检测OD值。以杆菌肽为参照品，绘制标准曲线。参照标准曲线的回归方程，计算多肽和蛋白的总含量。
[0033]实验结果:地龙蚯蚓提取物中多肽和蛋白的总含量为41.02%。
[0034](3)氨基酸浓度测定`:
[0035]实验步骤:采用凯氏定氮法，对蚯蚓提取物中氮的总量进行检测；氮的总含量减去多肽和蛋白质的总量即为氨基酸含量。
[0036]实验结果:地龙蚯蚓提取物中总氮的含量为83.23%，氨基酸含量为42.21%。
[0037](4)通过以上测定数据可知，蚯蚓提取物中富含多肽和氨基酸，少量的蛋白质，以及蚯蚓体中自身含有的蚯蚓素、维生素和微量元素等。因此，制备获得的蚯蚓提取物中含有的物质种类丰富。
[0038]实施例三:
[0039]蚯蚓提取物的体外抗氧化活性实验
[0040](I)样品溶液配制:实施例一中的蚯蚓提取物采用500道尔顿纳滤膜过滤，去除氨基酸和微量元素等小分子物质，制备分子量为500至3万道尔顿的提取物作为对照；未进行纳滤的蚯蚓提取物作为实验组，分别配制成不同浓度的样液。
[0041](2) DPPH溶液的配制:将DPPH溶于无水乙醇，配制浓度为lmmol / L的母液，于4°C中避光存放，使用前稀释为IOOymol / L的DPPH无水乙醇溶液。
[0042](3)分别取样品液2mL和浓度为100 μ mol / L的DPPH溶液lmL，先后加入同一试管中，摇匀，室温下静置30分钟，于517nm波长下测定样品吸光度。
[0043]清除率:k%=[l-(A1-Aj)/ Ac] X 100%,A1:1ml DPPH溶和 2ml 样品液的吸光度，Aj:2ml样品液和Iml溶剂的吸光度，Ac:1ml DPPH溶液和2ml溶剂的吸光度。
[0044](4)实验结果:如下表所示，蚯蚓提取物进一步去除氨基酸和微量元素等小分子物质后，对DPPH自由基的清除率反而降低，因此，保留氨基酸和微量元素等小分子物质的蚯蚓(地龙)提取物，具有更好的抗氧化活性。