专利名称：一种拟穴青蟹etfb基因及其克隆、检测方法和应用的制作方法黄素蛋白是一类以黄素核苷酸作为辅酶或辅基、参与线粒体呼吸链的组成，通过辅酶或辅基可接受和提供两个质子和两个电子，起到氧化还原酶或电子传递体的作用。电子转移黄素蛋白(Electron Transfer Flavoprotein，ETF)是一类以黄素腺嘌呤二核苷酸 (flavin adenine dinucleotide，FAD)为辅酶的蛋白质。目前ETF已经成功地从哺乳动物如人、鼠和猪中，以及一些细菌中如脱氮副球菌、埃氏巨球形菌和食甲基嗜甲基菌中鉴定出来。在这些生物中，ETF是由30KDa的α亚基和28KDa的β亚基构成异源二聚体，每个亚基包含一个黄素腺嘌呤二核苷酸(flavin adenine dinucleotide，FAD)和一个腺苷一磷酸 (Adenosine Monophosphate，AMP)。ETF是线粒体和细菌异化途径及呼吸链中至少11种脱氢酶的重要电子传递体，典型途径为通过ETF-泛醌氧化还原酶将电子从最初的脱氢酶转移至泛醌，以保证电子传递链持续运转产生质子势能。蟹类生长所需的能量代谢受多种内外因素的调节，归根结底，它是受到相关基因的控制调节。在有关哺乳类研究中表明ETF为核基因组编码，在细胞质内合成后再转移至线粒体加工处理为成熟肽，通过ETF-泛醌氧化还原酶将电子转移至泛醌，使得多种一级脱氢酶和泛醌-细胞色素C发生联系，从而保证电子传递链的运转生成生命活动的所需能量。 在细菌中的研究也发现类似的机制。在蟹类中，目前还没有鉴定出电子传递黄素蛋白基因， 如能找到呼吸链中联系电子转移和脱氢酶中的基因，则可以通过多种研究手段，如RNA干扰(RNAi)，基因过表达，启动子分析，真核表达与具生物活性蛋白质分离纯化，体外生化功能分析，从而为阐明蟹类ETFB基因在电子传递机制和能量代谢的功能及其发生机制奠定理论基础。
本发明旨在提供一种通过5，-RACE和3，-RACE技术克隆得到拟穴青蟹ETFB基因， 还提供了所述ETFB基因的克隆方法、检测方法和应用。为实现本发明的发明目的，发明人提供如下技术方案 一种拟穴青蟹ETFB基因，具有如SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列。一种拟穴青蟹ETFB基因，它编码的蛋白质具有如SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列。本发明所述的拟穴青蟹电子转移黄素蛋白β亚基基因(即拟穴青蟹ETFB基因)是从拟穴青蟹的肝胰脏中鉴定出的一种电子转移黄素蛋白β亚基基因。所述的电子转移黄素蛋白β亚基基因是通过5’-RACE和3’-RACE技术克隆得到的一个基因，其cDNA核苷酸序列和编码的蛋白质序列如下。该基因cDNA全长1030bp，自18bp到782bp区段为其开放阅读框，编码254个氨基酸，5，端非编码区长17bp，3，端非编码区长248bp，包含1个mRNA 半衰调节基序(ATTTA)，多聚腺苷酸加尾信号AATAAA和多聚腺苷酸尾巴。在GenBank中进行Blast同源性测定，确定该cDNA编码电子转移黄素蛋白β亚基基因。拟穴青蟹电子转移黄素蛋白β亚基基因ETFB核苷酸序列如下(SEQ ID NO. 1) ggccattcaccgatacaATGTCTCTCCGGGTACTTGTTGGCGTCAAGAGAGTGATTGATTATGCCGTGAAGATTCGGGTCCGGCCAGACAAGCTTGGGGTGGTGACAGATGGCGTGAAACACTCCATGAACCCTTTCGATGAGATAGCC ATTGAGGAGGCCGTGCGGCTCAAGGAGAAGAAGATTGCAAAGGAGGTGGTGGCTGTGTCATGTGGCCCAACCCAGGC ACAGGAGACCATCCGCACTGCCCTGGCCATGGGGGCTGACAGAGGTATCCACGTAGAGATTCCAGCCGAGGAGGTTG AGAAACTAGAACCATTGCATGTAGCCAAGATTATGGCCAAGCTGGTGGAGCAGGAGAAGGCTGACTTAGTTGTGCTT GGCAAACAGGCTATTGATGATGACTCCAATGCCACTGCCCAGATGACAGCTTCCATCCTTGACTGGCCTCAGGCAAC CTTTGCTTCCAAGATTGAGAAGACTGATGGTGAGCTGCAGGTGACAAGAGAGGTGGATGGAGGTCTGGAGACAATCA AAGTGAAGTTGCCAGCTGTGGTCTCAGCTGATCTCCGCCTCAATGAGCCCCGATATGCCACCCTGCCCAACATCATG AAAGCTAAGAAGAAGAAAATTGCTAAGATGAAGGCTGCTGACCTTGGAGTAGATACAACTTCTCACTTTGAAGTTTT GGAGGTGGCTGATCCACCTGTGAGGGAGGCTGGCATCAAAGTGGAGGATGTGGACACTCTTATTACAAAGTTGAAGG AGACTGGGCGCATTTAGcacagttaatcggggacgtacagtgtgactgtggttggaggaattgcaccatacctgtac acctgccaccaatcaatgcaatatacctattttctttgtgggcaagctatccttaatgaatgtgctacttttcagag atttctttaatacacaatctgtatttatattttcttgtacaaaacattctatagaaacaggtttaataaaatatata拟穴青蟹电子转移黄素蛋白β亚基基因ETFB编码的氨基酸序列如下(SEQ ID NO. 2)MSLRVLVGVKRVIDYAVKIRVRPDKLGVVTDGVKHSMNPFDEIAIEEAVRLKEKKIAKEWAVSCGPTQAQE TIRTALAMGADRGIHVEIPAEEVEKLEPLHVAKIMAKLVEQEKADLVVLGKQAIDDDSNATAQMTASILDWPQATFA SKIEKTDGELQVTREVDGGLETIKVKLPAVVSADLRLNEPRYATLPNIMKAKKKKIAKMKAADLGVDTTSHFEVLEV ADPPVREAGIKVEDVDTLITKLKETGRI。本发明还提供了一种拟穴青蟹ETFB基因的克隆方法，所述的克隆方法为利用 5’-RACE和3’-RACE技术克隆拟穴青蟹电子转移黄素蛋白β亚基基因cDNA全长，包括以拟穴青蟹肝胰脏反转录产物为模板，利用3-GP1和3-GP2引物进行3’ -RACE反应，扩增得到拟穴青蟹ETFB的3，端序列；以5-GP1和5-GP2引物进行5，-RACE反应，扩增得到ETFB 的5’序列，其中所述的3-GP1引物具有如SEQ ID No. 3所示的核苷酸序列，3-GP2引物具有如SEQ ID No. 4所示的核苷酸序列；5-GP1引物具有如SEQ ID No. 5所示的核苷酸序列， 5-GP2引物具有如SEQ ID No. 6所示的核苷酸序列。本发明还提供了一种拟穴青蟹ETFB基因的检测方法，所述的检测方法至少包括使用一对半定量PCR引物，所述的一对半定量PCR引物由上游引物和下游引物组成，其中， 所述的半定量PCR上游引物(ETFB-RT-F)具有如SEQ ID NO. 7所示的核苷酸序列；半定量 PCR下游引物(ETFB-RT-R)具有如SEQ ID NO. 8所示的核苷酸序列。本发明还提供了所述的一种拟穴青蟹ETFB基因在拟穴青蟹线粒体电子传递链运转中的应用。本发明通过基于5’ -RACE和3’ -RACE技术的同源克隆策略，PCR扩增测序以及Blast比对，克隆到拟穴青蟹电子转移黄素蛋白β亚基基因ETFB的全长序列；通过对拟穴青蟹电子转移黄素蛋白β亚基基因ETFB设计有效的表达引物，从而利用半定量PCR技术分析所述基因在正常组织中的表达图谱。发明人运用半定量RT-PCR技术检测了 ETFB基因在拟穴青蟹中四个主要器官(肝胰脏、卵巢、心脏和肌肉)中的表达谱，结果显示在所检测的四个器官中均具有较高水平的ETFB基因表达。与现有技术相比，本发明具有如下优点本发明基因的获得可以为后续通过RNAi，基因表达实验研究基因功能以及通过真核表达纯化获得具有生物活性的蛋白质，从结构生物学角度研究所述基因转录表达的蛋白产物提供前提条件，并最终为阐明蟹类ETFB基因及其表达的蛋白产物在线粒体电子传递链和能量代谢的功能及其发生机制奠定基础。
图1为半定量RT-PCR检测拟穴青蟹电子转移黄素蛋白β亚基基因ETFB在四个组织中的分布表达。

1.利用Trnzol-A+总RNA提取试剂盒(TIANGEN)提取拟穴青蟹肝胰脏总RNA。取健康的拟穴青蟹(体重约为500g)在充氧水箱养殖7日后，解剖蟹体取出肝胰脏、卵巢、心脏和肌肉，液氮速冻放入-80°C冰箱备用。分别取备用的肝胰脏组织约IOOmg用液氮研磨后加入Iml的Trnzol-A+试剂勻浆(TIANGEN)，按照该试剂盒操作手册所示实验方法提取总RNA。取2 μ 1提取的总RNA，分别用分光光度计和电泳检测总RNA浓度和质量。2.利用5’ -RACE和3’ -RACE技术克隆拟穴青蟹电子转移黄素蛋白β亚基基因 cDNA全长序列。通过比对其他物种电子转移黄素蛋白β亚基基因ETFB的核苷酸序列，找到保守区段，作为模板设计5-GP1/5-GP2引物和3-GP1/3-GP2引物。5’ -RACE和3’ -RACE实验使用 5，-Full RACE Kit (TaKaRa)和 3，-Full RACE Core Set Ver. 2. O (TaKaRa)试剂盒。 具体操作方法见试剂盒说明书，简要如下
以拟穴青蟹肝胰脏反转录产物为模板，利用3-GP1 ATGGGBGCffGACMGAGGYATCCACGT (SEQ ID No. 3)和 3-GP2 TGCCCAACATCATGAAAGCYAAGAAGA (SEQ ID No. 4)进行 3，-RACE 反应，扩增得到 ETFB 的 3，端序列；以 5-GPl:CCTTTGATGCCAGCCTCCCTCACAGGT (SEQ ID No. 5) 禾口 5-GP2 :GGAGATCAGCTGAGACCACAGCTGGC (SEQ ID No. 6)进行 5，-RACE 反应，扩增得到 ETFB的5’序列。3.对扩增得到RACE-PCR产物克隆测序并拼接获得ETFB基因cDNA全长序列。以1. %的琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物并利用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒 (TIANGEN)纯化回收PCR产物。将纯化回收的PCR产物同pGEM_T载体(Promega)在4°C条件下连接过夜，连接体系按说明书配制。将过夜连接产物转化入DH5 α感受态细胞中。涂平板(内含氯霉素、异丙基硫代- β -D-半乳糖苷(IPTG)及5-溴-4-氯-3-吲哚- β -D-半乳糖苷(X_gal)，37°C恒温培养箱中培养过夜。通过蓝白斑筛选含cDNA插入片段的阳性重组子，将挑取的每个单克隆子分别接种到Iml氯霉素抗性的LB培养液中，37°C摇菌2个小时，菌液PCR确认阳性克隆子，剔除假阳性克隆子。将经过菌液PCR鉴定的阳性克隆子寄送华大基因公司测序，测序在ABI 3730测序仪上进行。将所得的5’端序列和3’端序列在 MEGA4. 1软件(生物软件网，http://www. bio-soft, net/)中进行拼接得到ETFB基因cDNA 全长序列。结果如SEQ ID NO. 1和SEQ ID N0. 2所示。将测序所得序列在GenBank中进行Blast同源性测定，鉴定出拟穴青蟹电子转移黄素蛋白β亚基基因，该基因cDNA全长1030bp，自18bp到782bp区段为其开放阅读框，编码254个氨基酸，5’端非编码区长17bp，3’端非编码区长248bp，包含1个mRNA半衰调节基序(ATTTA)，多聚腺苷酸加尾信号AATAAA和多聚腺苷酸尾巴。4.正常组织中ETFB基因的半定量表达图谱。为检测ETFB基因在正常拟穴青蟹主要代谢器官中的分布情况，分别取出保存的四个组织(肝胰脏、卵巢、心脏和肌肉)各约lOOmg，使用Trnzol-A+总RNA提取试剂盒(TIANGEN)抽提总RNA。取1 μ g总RNA用Quant cDNA第一链合成试剂盒合成 cDNA第一链，作为半定量RT-PCR的模板。根据拟穴青蟹电子转移黄素蛋白β亚基基因ETFB设计一对特异引物，半定量PCR上游引物(ETFB-RT-F) TTCCAGCCGAGGAGGTTGA G (SEQ ID No. 7)；半定量 PCR 下游引物(ETFB-RT-R) TGTTGGGCAGGGTGGCATAT (SEQ ID No. 8)，对ETFB基因的cDNA进行扩增；根据已报道的拟穴青蟹β -actin基因作为内参基因(该序列收录于GenBank数据，登录号为HM217821)，设计一对特异引物(上游引物 (β -actin-RT-F) TCACCAACTGGGACGACATG (SEQ ID No. 9)；下游引物(β -actin-RT-R) ATAGCGTGAGGAAGGGCATA (SEQ ID No. 10)。半定量 RT-PCR 反应体系为:ddH20 17. 3 μ 1， 10XPCR Buffer (TIAGEN) 2. 5 μ 1，dNTP (2. 5mM，TIANGEN) 2 μ 1，上下游引物各 1 μ 1，cDNA 模板1μ l，Taq酶(5U/y 1，TIANGEN)0. 2μ 1，反应总体积为25μ 1。反应条件设置为:95°C, 3分钟；95 V，30秒，55 0C，30秒，72 °C，30秒，共30个循环；72 °C，5分钟。反应结束后，取 5μ 1 PCR产物用1. 5%的琼脂糖凝胶电泳检测并拍照保存。发明人运用半定量RT-PCR技术检测了 ETFB基因在拟穴青蟹中四个主要器官中的表达谱，结果如图1所示，在所检测的四个器官中具有较高水平的ETFB基因表达，这提示克隆到的ETFB基因确在拟穴青蟹四个主要器官中发挥持续作用，因而具备较高的转录活性和转录水平。尽管发明人已经对本发明的技术方案做了较为详细的阐述和列举，应当理解，对于本领域一个熟练的技术人员来说，对上述实施例作出修改和/或变通或者采用等同的替代方案是显然的，都不能脱离本发明精神的实质，本发明中出现的术语用于对本发明技术方案的阐述和理解，并不能构成对本发明的限制。


本发明涉及蟹类主要代谢器官中表达的基因序列，具体是一种拟穴青蟹ETFB基因及其克隆、检测方法和应用。本发明通过5’-RACE和3’-RACE技术克隆得到拟穴青蟹ETFB基因的cDNA全长序列，本发明基因的获得可以为后续通过RNAi，基因表达实验研究基因功能以及通过真核表达纯化获得具有生物活性的蛋白质，从结构生物学角度研究所述基因转录表达的蛋白产物提供前提条件，并最终为阐明蟹类ETFB基因及其表达的蛋白产物在线粒体电子传递链和能量代谢的功能及其发生机制奠定基础。