专利名称：含有多聚乙酰的提取物，分馏物和混合物及它们的应用的制作方法番荔枝，也称为释迦，糖苹果或蕃荔枝，属于番荔枝科，原产热带美洲。番荔枝是一种灌木或小乔木，高达6米。释迦是一种有白浆的食用水果，其含有许多黑色有光泽的种子。它通常被发现在落叶阔叶林，并且也正在印度的许多地方培养。其果肉可以鲜吃，也可以转换成果汁或奶昔。水果通常是生吃。由于广泛种植，因此其确切的原生地未知，但被认为是在加勒比地区；其物种被描述为来自牙买加。有些番荔枝的植物化学如下。从水蒸汽蒸馏法获得的精油可以鉴定番荔枝科树皮中的挥发性成分。GC/MS研究确定了六种主要的组分，分别是IH-环丙烯甘菊环烃 (3. 46% )，吉玛烯D (II. 44% )，红没药烯(4. 48%),石竹烯氧化物(29. 38%),环氧红没药烯(3. 64% )和考尔-16-烯(19. 13% ) 番荔枝种乙醇提取物中11种番荔枝科多聚乙酰化合物被分离和鉴定为多鳞番蒸枝策林，安那特莫英-2 (annotemoyin-2),瑞替卡雷腾_2 (reticulatain-2),多鳞番蒸枝辛-I，多鳞番荔枝辛-B，多鳞番荔枝辛，莫垂林，多鳞番荔枝斯坦定-D，多鳞番荔枝斯坦定-E,毛叶番蒸枝素-I和毛叶番蒸枝素-2。番荔枝多聚乙酰是一种属于有效类的天然化合物，它是从番荔枝科的植物中分离出来的。四氢呋喃多聚乙酰是其中突出的一种[Feras，Q. A.，et. al.，J. Nat. Prod.， 1999,62:504-540]。据报道，这类化合物中的许多都表现出显著的生物活性。多聚乙酰是 C35-C39化合物，通常包含两个长烃链，其中一个连接一个末端2，4- 二取代-Y -多聚乙酰和数量不定的四氢呋喃(THF)环。所述的烃链包括一些含氧基，可以是羟基，乙酰氧基和/ 或酮。最近报道了含有双键的单环多聚乙酰，没有THF环的环氧化合物和没有环氧和THF 环的化合物。这些化合物支持番荔枝多聚乙酰是聚酮化合物源的学说。番荔枝叶片被发现有蚊虫杀虫剂属性，并用于治疗昏睡病。粉碎后的种子被发现对果蝇和虱有杀虫特性。果肉含维生素C，对牙齿，骨骼，皮肤和肌肉有益。花已被用于治疗眼睛发炎。种子糊粉用于治疗头虱，并在癌症治疗中使用。树皮提取物用于治疗皮肤疾病， 控制肠道螺虫。根提取物用于治疗癌肿瘤。[A. C. de Q. Pinto,Field Manual for extension workers and farmers,Practical manual no.5,2006]番荔枝的一些药理学活性总结如下从番荔枝种子中分离出的环多鳞番荔枝辛D显示出消炎活性，它能抑制前炎症细胞因子，脂多糖和Pam3Cys-激化的J774A. I巨噬细胞的产物。[Yang, Y. L. , et al.，J Agric Food Chem. 2008, 56 :386-92.]。番荔枝种中分离出来的一些活性化合物显示出抗头虱效果。[Junya Intaranongpai et al. , Southeast Asian J. Trop. Med. Public Health,2006, 37 :pages]。 番荔枝根公知可以用于控制便秘。还有报道称番荔枝具有保肝活性[Mohamed Saleem TS et al.，International Journal of Applied Research in Natural Products，2008，I : 1-7. ] o嗜中性粒细胞产生的活性氧粒子(ROS)和颗粒蛋白酶是炎症性疾病的发病机理。从番蒸枝莖中分离出的一种对映-贝壳杉烧化合物16-β , 17- 二轻-对映-贝壳杉烷-19-酸表现出强效的白细胞的免疫调节作用和消炎活性，它能抑制超氧阴离子自由基的生成，ROS的形成，甲酸-L-甲二磺酰基-L-亮氨酰-L-苯丙氨酸(FMLP)-激活的人体中性粒细胞中弹性蛋白酶的释放。在另一个研究中，番荔枝中分离出来的石竹烯氧化物在12. 5和25mg/kg体重的剂量下表现出显著的中心及边缘止痛活性，以及消炎活性。[Chavan，M. J.，et al.， Phytomedicine. 2009]。之前的印度专利申请2756/DEL/2006已经报道了番荔枝的消炎活性。该申请公开了一种方法来制备一种番荔枝提取物，包括16-十八羟_9(Z or E)，12(Z or E)，14(Z or E)-三亚乙基四胺酸和13-羟-9Z-11E-15E-十八三亚乙基四胺酸，以及将其用于治疗癌症，糖尿病及相关并发症，包括炎症性疾病，如艾滋病，哮喘，关节炎，支气管炎，慢性阻塞性肺疾病(COPD)，银屑病，过敏性鼻炎，休克，过敏性皮炎，克罗恩病，成人呼吸窘迫综合症 (ARDS)，嗜酸性肉芽肿，过敏性结膜炎，关节炎或溃疡性结肠炎。三亚乙基四胺酸化合物被认为是形成这种活性的原因。中国专利申请CN1477102涉及具有抗糖尿病活性的糖苹果植物提取物，应用及制备方法。番荔枝植物的枝，叶，树干，树皮，根，种子和果皮中可以提取原料。多聚乙酰化合物可制成各种治疗糖尿病的剂型，其制备方法可以采用溶剂萃取法，树脂吸附法，超临界二氧化碳萃取工艺和常规干燥过程中的一种或多种。美国专利US6242483涉及分离出三种源自番荔枝皮的新型单四氢呋喃环多聚乙酰。这些化合物都在C-9位置上有一个羰基，并且都在四氢呋喃环的侧翼上有两个羟基。这些化合物对某些特定的人肿瘤细胞表现出选择性的杀伤活性。
本发明一个主要方面是提供了由番荔枝衍生的含有末端α，不饱和-Y -甲基-Y -内酯基团的多聚乙酰标准化提取物或分馏物，其用于预防、治疗、抑制或控制由细胞因子/趋化因子或其它生物标记介导的炎症和/或免疫相关的疾病。本发明另一个主要方面是提供了番荔枝衍生的含有末端α，不饱和-Y -甲基-Y -内酯基团的多聚乙酰标准化提取物或分馏物中选出的至少一种组分与植物/动物 /微生物衍生的生物活性组分；药用或食用活性组分，维生素，氨基酸，矿产品；药用或食用赋形剂，载色剂，载体和稀释剂或它们的混合物中选出的至少一种组分来预防、治疗、抑制或控制由细胞因子/趋化因子或其它诊断/生物标记介导的炎症和/或免疫相关的疾病。本发明另一方面提供了含有多聚乙酰化合物或混合物的番荔枝叶衍生的多聚乙酰化合物，提取物或分馏物用于预防、抑制或控制所需目标罹患的炎症和/或免疫相关的疾病。本发明另一方面提供了含有多聚乙酰化合物或混合物的番荔枝叶衍生的多聚乙酰化合物，提取物或分馏物用于预防、抑制或控制所需目标罹患的代谢性障碍。本发明另一个主要方面中，含有多聚乙酰化合物或其混合物的番荔枝叶衍生的多聚乙酰化合物，提取物或分馏物可以用于调节/调整一个或多个细胞因子/趋化因子/生物标记的表达或产物，其中所述的细胞因子/趋化因子/生物标记选自TNF-α、IL-I β、 IL-2、IL-4、IL-6、IL-13、MCP-1、调节活化正常T细胞表达与分泌的趋化因子(Rantes)、嗜酸粒细胞亲合素(Eotaxin)、I CAM, VCAM、aP2、FLAP、CRP, CD36、5_ 脂氧合酶和 MMPs。图I :图显示了导向分馏的生物鉴定来识别大多数活性化合物和活性片段的概述。图II :图中显示了番荔枝叶提取物中分离获得的多聚乙酰的化学结构。图III :图中显示了番荔枝叶中的乙酸乙酯提取物(LI 12101，100mg/kg)和脱氢皮质醇(10mg/kg)对SD大鼠进行弗氏完全佐剂诱导爪子水肿后爪体积的柱形图。柱a、b和 c分别表示经对照，LI12101和脱氢皮质醇处理后的组中的爪体积。每个柱是指平均土SD， N = 6. **p < O. 005 (与对照对比)。图IV :图中显示了不同组中动物的血清TNFa浓度的柱形图。FCA检验14天后， 用酶免疫检测试剂盒(R&D Systems，USA)定量地检测血清TNF a。柱a、b和c分别表示补充了对照、LI12101 (100mg/kg)和脱氢皮质醇(10mg/kg)的组中细胞因子的水平。每个柱表示平均土 SD，N = 6. *p < O. 05和< O. 005 (与对照对比)。图V :图中显示了番荔枝叶中的甲醇提取物(LI12101，50mg/kg或100mg/kg体重) 和脱氢皮质醇(10mg/kg)对SD大鼠进行弗氏完全佐剂诱导爪子水肿后爪子体积的柱形图。 柱分别表示对照组，分别经50mg/kg体重的LI 12101，100mg/kg体重的LI 12101和脱氢皮质醇处理组中的爪子体积。每个柱表示平均土SD，N = 6。图VI :图中显示了不同组中动物的血清TNFa浓度的柱形图。FCA检验14天后， 用酶免疫检测试剂盒(R&D Systems, USA)定量地检测血清TNF a。柱分别表示补充了对照、 LI12101 (50mg/kg) >LI12101 (100mg/kg)和脱氢皮质醇(10mg/kg)的组中细胞因子的水平。 每个柱表示平均土SD, N = 6.图VII :图中显示了番荔枝叶中的甲醇提取物(LI12100)对3T3-L1脂肪细胞中脂代谢标记和脂解过程进行的调节。所示的代表如PPAR Y，ADRP, CEBP a，CEBP β，aP2，CD36 和围脂滴蛋白等各种标记蛋白的免疫印迹描绘下调。3T3-L1小鼠前成脂肪细胞有不同地不含有或含有10 μ g/ml或25 μ g/ml LI12100。空白对照培养基仅接受相似浓度的DMS0。在每一个印迹上评估肌动蛋白的表达作为内部对照。每个蛋白的表达进行光密度测量并利用肌动蛋白的表达进行规范化。任意单位中表达水平的对比如柱形图所示(侧面)。柱a、b 和c分别表示用空白对照、10μ g/mlLI12100和25 μ g/ml LI12100处理后的细胞产生的表达
炎症是血管组织对刺激，如病原体,受损细胞或过敏药物进入人体后产生的一种反应。它是人体的一种保护机制，用于清除有害的病原体或试剂，保护组织。促炎性细胞因子，如 TNFa ,IL-Ιβ、IL_6、GM_CSF 和 CD4+、Th2 集衍生的 IL_4、IL_5 和 IL-13 淋巴因子被认为是炎症疾病的免疫发病机理的关键因素。5-脂氧合酶在炎症过程中的关键一步，即白三烯合成花生四烯酸中是一种关键的酶。白三烯是炎症疾病的关键中介。5-脂氧合酶(5-L0X)的激活和基因表达反应了病情。5_脂氧合酶激活蛋白(FLAP) 是一种ISkDa整合膜蛋白，它通过与花生四烯酸进行特异性结合，将其转移给酶来激活 5-脂氧合酶。因此FLAP负责产生白三烯。因此，阻断或下调5-L0X和FLAP是一种适用于治疗和/或控制炎症状态的有效治疗方法。肿瘤坏死因子-a (TNF)是一种重要的多效性炎性细胞因子。它提供多种功能，其表达和产物对大多数人体的器官具有效果。它主要由巨噬细胞产生。TNFa是一种急性期蛋白和趋化因子，它启动细胞因子的级联并增加血管通透性，从而将巨噬细胞和中性粒细胞吸引到感染位点。TNFa既有生长刺激特性又有生长抑制过程，它还显示出自我调节特性。TNFa的有益功能包括其用于对细菌、某些真菌、病毒和寄生虫的入侵进行免疫反应， 并用于特定肿瘤的坏死。但是高水平的TNFa会有不利影响，它导致许多疾病条件的形成。 高水平的TNF α会增加死亡的风险。因此TNF a是一个重要的目标以开发新的对广泛炎症性疾病的治疗。动脉粥样硬化是一种炎症性疾病，其特点是会于几十年期间内在内皮细胞功能障碍点上形成血管病变。炎症在动脉粥样硬化斑块发展的许多阶段起着重要的作用。因此， 确定具有新型消炎性能的化合物是针对动脉粥样硬化的一种最好策略。基质金属蛋白酶(MMPs)是锌依赖性内肽酶，它能打破所有种类的外细胞基质蛋白质，如胶原蛋白，这通常会在组织细胞之间的空隙中发现。MMPs主要分为三个主要群体， 胶原酶形成的成纤维细胞胶原酶-I(MMP-I),包括明胶酶A的明胶酶(MMP-2)和明胶酶 B(MMP-9)，而基质降解酶包括基质降解酶-I (MMP-3)和基质溶解因子(MMP-7)。过量的基质金属蛋白酶会使生物分子，如胶原蛋白、蛋白多糖和明胶等发生降解，它会对表皮产生致命的后果，还会形成软骨病，炎症等疾病。这不断地增加各种炎症性疾病和代谢紊乱的患病率。这就与控制炎症性疾病和代谢性疾病的迫切需要相结合，世界各地的许多科学家已经优选关注这些领域的研究活动。 这就形成了特殊的兴趣来寻找替代方案，尤其是那些基于植物源性的产品。植物衍生产品与合成来源的商业药物相比，被认为是天然而安全的。发明人已就此进行了详细的调查，涉及对几种植物提取物，分馏物及纯化合物进行几个在体外和体内实验，意外地发现番荔枝提取物(S)或活性分馏物或活性化合物或它们的混合物根据研究以一种有效治疗量向细胞给药，能在炎症和/或代谢/免疫功能紊乱的表达中有效地改善某些细胞因子/趋化因子/生物标记的水平。在说明书及权利要求书中用于描述实施例的番荔枝提取物/分馏物的各种代码如下LI12100-番荔枝叶的甲醇提取物LI12100A-番荔枝叶进行循序提取获得的己烷提取物LI12100B-番荔枝叶进行循序提取获得的甲醇提取物
LI12100C-番荔枝叶的乙酸乙酯提取物LI12100D-番荔枝叶的乙醇提取物LI12100E-番荔枝叶的水醇提取物LI12100F-分层法获得的番荔枝叶的乙酸乙酯提取物LI12100G-番荔枝种的己烷提取物LI12100H-番荔枝种的乙酸乙酯提取物LI 121001-番荔枝叶甲醇提取物和水提取物的混合物LI12100J-番荔枝叶和番荔枝种的甲醇提取物混合物LI 12101-分割番荔枝叶获得的乙酸乙酯提取物LI 189/159G+H-色谱分析番荔枝叶的甲醇提取物获得的一种活性分馏物 (LI12100)。各种植物提取物通过在THP-I人单核细胞中对促炎性细胞因子TNF α的抑制潜力进行了筛选。番荔枝提取物在提取物测试中令人意外地显示出最强效的TNFa抑制。番荔枝叶衍生的甲醇提取物(LI12100)在20. 06ng/mL的半抑制浓度(IC5tl)时有效地抑制了 TNFa。对番荔枝叶进行选择性处理获得的乙酸乙酯提取物(LI12101)也在8. 34ng/mL的 IC50)时显示出最强效的TNFa抑制。番荔枝叶的其它提取物(LI12100A to LI12100J)也显示出强效的TNFa抑制,如表I所示。番荔枝的甲醇提取物(LI12100)经过导向分离的生物鉴定，以确定该化合物是否引起TNF a抑制并产生活性改进的分馏物。LI12100经二氧化硅快速柱色谱分析，其中使用乙酸乙酯/正己烷混合物作为洗提液。用60%和80%乙酸乙酯/正己烷混合物和乙酸乙酯洗提后的分馏物显示出强效的活性。但是用乙酸乙酯洗提后的分馏物(LI189/159G+H) 显示具有卓越的TNF a抑制(IC5tl 0.82ng/mL)。该活性分馏物再次经二氧化硅快速柱，使用丙酮/氯仿混合物进行进一步的纯化，然后将该活性分馏物经菲罗门月神柱(Phenomenex Luna柱)(10μ，C18，250_ x 21. 2)，首先使用95 5乙腈/水混合物，最后用90 10 乙腈/水混合物进行预HPLC纯化，获得一种纯化合物(LI 12103)，其IC5tl值为24. 9pg/mL。 通过其1H NMR713C NMR和质谱相关数据的决定性分析并将获得的值与文献中报道的值进行比较，出人意料地发现它的化学结构是一个多聚乙酰化合物，即多鳞番荔枝辛C(LI12103 ； I)。一种小化合物在100pg/mL时具有63% TNFa抑制，其是从相同的分馏物中分离出来， 其结构被识别为异多鳞番荔枝辛(LI12132;2)。所述的导向分离的生物鉴定如图I所示。通过选择性方法获得的叶的乙酸乙酯提取物(LI12101)也经过更详细的导向分离的生物鉴定和/或纯化分离，以确定其它多聚乙酰化合物是否形成抗TNF a活性，重复地使用快速柱色谱分析，过二氧化硅凝胶，使用有机溶剂混合物进行预HPLC纯化。这繁琐而费力的纯化过程产生近15种多聚乙酰化合物，包括末端a，β-不饱和-Y-甲基-Y-内酉旨基团，其在烷链上至少具有一个功能团，该功能团选自一个或多个四氢呋喃基，一个或多个环氧基，一个或多个羟氢氧基，以及一个或多个烯键(双键)。所述的化合物包括多鳞番荔枝辛C(l)、异多鳞番荔枝辛(LI12132 ;2)、戴俄婆萨德林(dieposabadelin) (LI12109 ;4)、 多鳞番荔枝斯坦定D (LI 12106 ;5)、多鳞番荔枝辛L (LI 12107 ;6)、多鳞番荔枝辛J (LI 12111 ； 7)、多鳞番荔枝辛G(LI12105 ;10)和10-氢氧巴婆(双呋)内酯(LI12110 ;11)。化合物 LI 12104 (3)、化合物LI 12114 (8)、化合物LI 12115 (9)的结构暂定。那些公知化合物的结构和那些暂定的结构如图II所示。剩下的化合物，化合物LI12112、化合物LI12113、化合物LI 12116和化合物 LI12117在实施例13的实验部分公开的每个光谱信息证实是具有特有的末端α，β -不饱和-Y -甲基-Y-内酯的番爺枝多聚乙酰，LI 12112是一种具有末端α，β -不饱和-Y -甲基-Y -内酯并在烷链上具有一个四氢呋喃基、三个羟氢氧基和一个双取代双键的多聚乙酰。其分子量(MW)为606质量单位。这种化合物的光谱信息总结如下LI12112 =1H 匪R (CDCl3, 400ΜΗζ) δ 6. 98 (1Η, d, J = I. 2Hz)，5· 36 (2H，m)，
4.99 (1Η, qd, J=L 6,6. 8Hz)，3. 87 (4Η, m)，3. 41 (2Η, m)，2. 36-2. 24 (4Η, m)，2. 06-1. 90 (5Η, m)，I. 68-1. 50 (8Η, m)，I. 41 (3Η, d, J = 6. 8Hz)，I. 25 (s)，O. 88 (3Η, t, J = 6. 8Hz) ；LCMS 629 (M+Na) ++ve 离子模式。LI 12113是一种多聚乙酰，其分子量(MW)为588质量单位，具有特有的末端α， β-不饱和-Y -甲基-Y -内酯并在烷链上具有三个环氧基。这种化合物的光谱信息总结如下LI 12113: IH NMR(CDC13，400ΜΗζ) δ 6. 98 (1Η, d, J = I. 6Hz), 4. 99 (1H, qd, J = I. 6,6. 8Hz)，3. 03-2. 92 (6H, m)，2. 26 (2H, t, J = 7. 6Hz)，2. 04-1. 95 (2H, m)，I. 84 (2H, m)， I. 78(2H，m)，I. 66-1. 47(10H，m)，I. 40(3H，d，J = 6. 8Hz)，I. 26 (s) ,0. 88(3H，t，J = 6. 8Hz)； 13C NMR(CDC13,100MHz) δ 173. 7,148. 7,138. 4,57. 3,56. 8,56. 6,31. 9,29. 7,29. 5,29. 5,
29.3,29. 2,27. 8, 27. 4，26. 6,25. 3,25. 2, 25. 2,22. 6,19. 2,14. I ；LCMS :611 (M+Na) ++ve 离子模式。LI12116(MW 604)是一种具有特有的末端α，β -不饱和I -甲基I -内酉旨并在烷链上具有二个环氧基和一个羟氢氧基的多聚乙酰。这种化合物的光谱信息总结如下LI 12116 1H NMR(CDC13，400ΜΗζ) δ 6. 98 (1Η, s)，4· 99 (1Η, qd, J = 6· 4，I. 6Ηζ)，
4.29 (1Η, m) 2. 98 (4Η, m)，2. 27 (2Η, t, J = 8. OHz)，2. 07 (2Η, m)，I. 77 (6Η, m)，I. 55 (10Η, m)，
1.41(3H，d，J = 6. 8Ηζ)，I. 26(s)，0· 88(3H，t，J = 6. 8Hz) ；LCMS 627 (M+Na) ++ve 离子模式。LI12117是一种具有特有的末端α，β -不饱和-Y -甲基-Y -内酉旨并在烧链上具有二个四氢呋喃基和三个羟氢氧基的多聚乙酰。这种化合物的光谱信息总结如下LI12117 1H NMR (CDC13, 400ΜΗζ) δ 6. 98 (1Η, d, J = I. 2Hz) , 5. 35 (2H, m) 4. 98 (1H, qd, J = 6. 8,1. 6Hz)，4. 16 (1H, m)，3. 93-3. 82 (4H, m)，3. 56 (1H, m)，3. 40 (1H, m)，
2.29 (3H, m)，2. 06 (4H, m)，I. 67-1. 50 (16H, m)，I. 40 (3H, d, J = 6. 8Hz)，I. 26 (s)，0. 88 (3H, t, J = 6. 8Hz) ；LCMS 643 (M+Na) ++ve 离子模式。本发明所述的具有生物活性的多聚乙酰化合物具有特有的结构特征，其中每种所述的多聚乙酰具有一个末端α，β-不饱和-Υ-甲基-Υ-内酯基团(a)。此外所述的多聚乙酰在烷链上具有如下所示的一个或多个四氢呋喃(b)基或一个或多个环氧(C)基，还选择性地具有一个或多个羟氢氧基和/或一个或多个烯键(双键)。


本发明涉及多聚乙酰，由番荔枝衍生的标准化为具有末端a,b-不饱和-g-甲基-g-内酯基团的多聚乙酰的提取物/分馏物或它们的混合物，其用于预防、治疗、抑制或控制由细胞因子/趋化因子或其它生物标记介导的炎症和/或免疫相关的疾病。本发明还涉及用于预防、治疗、抑制或控制代谢性疾病/障碍的番荔枝衍生的多聚乙酰，提取物/分馏物或它们的混合物。