专利名称：一种诱导菊花体细胞胚间接发生的方法菊花(Chrysanthemum morifolium Ramat.)原产中国，是深受人们喜爱的传统 十大名花之一，名列全世界花卉消费量的前列，约占花卉销售总量的23% (陈俊愉，2001 ； Anderson, 2005)。既可作为盆栽花卉(盆菊)、切花花卉(切菊)，也是城市园林绿化的地 被花卉(地被菊)、还是重要的保健饮用花卉(茶用菊)。植物再生方式主要为器官分化方式和体细胞胚发生方式 (somaticembryogenesis)，体细胞胚发生方式与器官分化方式相比，具有数量多、速度快、 结构完整、再生率高等优点(Ammirato，1983 ；Gupta 等，1993 ；Shinoyama 等，2004 ；Mandal 和Datta，2005))。同时体细胞胚的结构完整，一旦形成，一般可直接萌发形成小植株(李浚 明，1992)。植物的体细胞胚胎发生与器官发生是两个完全不同的生长、发育、分化过程。体细 胞胚胎发生培养的细胞经历类似合子胚发生的阶段，形成非合子胚，再发育成成熟胚，最后 萌发形成植株；而器官发生是由外植体或其形成的愈伤组织分化长出根、茎、叶等器官，再 逐步形成植株的再生方式，在培养物上能看到典型的芽或根的结构(HaCCiuS，1978 ；崔凯 荣和戴若兰，2000)。体细胞胚除了通过直接或间接方式诱导成苗和作为分子生物学研究的材料以外 (Shinoyama等，2004 ；Mandal和Datta，2005)，胚状体发育及其植株再生系统也是最理想 的基因转化受体系统。体细胞胚是由类似合子胚特性的胚性细胞发育而来，这些胚性细胞 具有很强的接受外源DNA的能力，是理想的基因转化感受态细胞；而且胚性细胞繁殖量大， 同步性好，转化后的胚性细胞可顺利发育成胚状体及完整的转基因植株。大量研究表明， 体胚发生多是单细胞起源，转化获得的转基因植株嵌合体少(Shinoyama等，2004 ；Mandal 和Datta，2005)，因此，植物体细胞胚发生可作为理想的遗传转化受体体系(洪波等，2006 ； Blanc 等，2006)。体细胞胚发生还可用于植物种质资源库的建立，利于保存优良的植物种质资源 和濒危植物资源(Laine和David, 1992 ；Gupta等，1993 ；裴新梧和王亚馥，2000)。利用体 细胞胚还可包装制作人工种子，进行植物离体快速繁殖、快速育苗和现代化的栽培、管理 (Piccioni 和 Standardi, 1995 ；Castillo 等，1998 ；Ara 等，1999 ；Saxena 和 Dhawan，1999 ； 肖颖和王刚，2006)。利用体细胞胚也可进行植物体细胞无性系变异筛选，能分离优良的体 细胞无性系变异变异，再通过体细胞胚发生形成完整的植株，得到植物新种质(品种)，从 而克服传统育种中的一些缺陷，缩短育种周期，进行非常规育种(裴新梧和王亚馥，2000)。在菊花的组织培养中，常见的再生方式是器官分化方式。但这种方式一方面需要 大量的母株获取外植体；另方面再生速度慢，导致无性系的繁殖率降低；同时易产生变异，3稳定性较差。因此对于大规模的菊花生产以及菊花的细胞工程和基因工程而言，利用器官 分化途径的再生方式已远远不能满足需要。因此建立菊花间接体细胞胚发生的技术体系具 有十分重要的意义。菊花体细胞胚发生的最早报道是1991年May等利用菊花品种‘Iridon’叶片，在 附加2，4-D 1. Omg/L+6-BA 0. 2mg/L+9% 18%蔗糖的改良MS基本培养基上，获得了直接 体细胞胚发生植株；并发现菊花体细胞胚的产生起源于单细胞；同时也发现菊花体细胞胚 发生有较强基因型依赖性，在23个品种中有12个产生了体细胞胚，但只有5个品种获得了 再生植株，且体细胞胚发生形成的再生植株的再生频率最大的只有9%。Pavingerova等 (1994)以叶片(品种为‘WhiteSnowdon，)外植体通过液体和固体培养获得了体细胞胚，但 体细胞胚发生形成的再生植株的再生频率最大的只有47%，同时体细胞胚发生也有较强的 基因型依赖性；Tanaka等(2000)从菊花的管状花中诱导出了胚性愈伤，但体细胞胚发生频 率最高只有56% ；Mandal和Datta等(2005)也发现了菊花体细胞胚发生的基因型依赖和 诱导频率较低的问题。综上所述，菊花体细胞胚诱导中存在的问题主要问题有较强基因型 依赖性，胚性愈伤组织分化率较低、体细胞胚发生形成的再生植株的再生频率较低，再生植 株的稳定性较差等。
本发明的目的在于提供一种诱导菊花体细胞胚间接发生的方法，包括如下步骤(1)获得菊花无菌苗将表面灭菌的菊花带腋芽茎段接种到以MS为基本培养基， 添加了 6-苄氨基嘌呤6-BA1. Omg/L、萘乙酸NAAO. lmg/L、质量分数为0. 75%的琼脂、质量分 数为3%的蔗糖，pH6.0的培养基上，诱导丛生芽。其中所述的表面灭菌方法为将露体栽培 的菊花带腋芽茎段先在70%酒精浸泡30s后，用无菌水冲洗至少一次，再用0. 升汞消毒 1 2次，每次升汞消毒后无菌水冲洗至少一次。(2)诱导胚性愈伤组织从步骤1)中获得的丛生芽中切取节间或者叶片，接种到 以MS为基本培养基，添加了激动素KT 1.0 2.011^/1、2，4-二氯苯氧乙酸2，4-0 2. Omg/L、 萘乙酸NAA 0.5 1. 0mg/L，质量分数为0. 75%的琼脂、质量分数为3%的蔗糖，pH 6. 0的 胚性愈伤组织诱导培养基上诱导胚性愈伤组织。优选的胚性愈伤组织诱导培养基为以MS 为基本培养基，添加了激动素KT 2.011^/1、2，4-二氯苯氧乙酸2，4-0 2. 0mg/L、萘乙酸NAA 0. 5mg/L，质量分数为0. 75%的琼脂、质量分数为3%的蔗糖，pH 6. 0的培养基。(3)诱导胚性愈伤组织的分化通过步骤2)获得的黄绿色致密颗粒状胚性愈伤 组织后转入以MS为基本培养基，添加了激动素KT 1. 0 2. 0mg/L,2,4- 二氯苯氧乙酸2， 4-D 1. 0mg/L、萘乙酸ΝΑΑ0. 5 1. 0mg/L，质量分数为0. 75%的琼脂、质量分数为3%的蔗 糖，pH6. 0的胚性愈伤组织分化培养基一中培养15d，再转接入以MS为基本培养基，添加了 激动素KT 1. 0 2. 0mg/L、萘乙酸NAA 0. 5 1. 0mg/L、质量分数为0. 75%的琼脂、质量分 数为3%的蔗糖，pH 6. 0的胚性愈伤组织分化培养基二上培养20d，诱导菊花间接体细胞胚 分化和由之再生成小植株。优选的胚性愈伤组织分化培养基一为以MS为基本培养基，添 加了激动素KT2.0mg/L、2，4-二氯苯氧乙酸2，4-D 1. 0mg/L、萘乙酸NAA 0. 5mg/L，质量分数 为0.75%的琼脂、质量分数为3%的蔗糖，pH 6.0的培养基。优选的胚性愈伤组织分化培 养基二为以MS为基本培养基，添加了激动素KT2. 0mg/L、萘乙酸NAA 0. 5mg/L，质量分数为0. 75%的琼脂、质量分数为3%的蔗糖，pH 6. 0的培养基。(4)移栽间接体细胞胚再生植株将步骤3)获得的再生植株接种到添加了 0. Img/ L的萘乙酸NAA、质量分数为0.75%的琼脂、质量分数为3%的蔗糖，pH 6.0的1/2MS基本培 养基上，进行生根培养，待不定根长至1. Ocm 2. Ocm时，进行试管苗的炼苗和移栽。所述 移栽包括取出试管苗，用清水洗净试管苗的根系后，移栽入由消毒泥炭与珍珠岩混合1 1 的基质中培养，即得到菊花通过间接体细胞胚发生途径形成的再生植株。本发明还提供一种诱导菊花体细胞胚间接发生的方法在菊花良种繁育和基因工 程培育新品种中的应用。本发明菊花间接体细胞胚发生的方法体系稳定，操作较易，胚性愈伤组织诱导率 胚性愈伤组织诱导率达83.0%以上，胚性愈伤组织分化率和形成的再生植株的再生频率达 90%以上，平均每外植体分化的芽数达17个以上，增殖系数达10倍以上。同时通过在7个 地被菊品种、2个切花菊品种、3个茶用菊品种的试验验证，本发明菊花间接体细胞胚发生 的方法较有效地克服了基因型依赖的弊端。1节间外植体诱导的体细胞胚数最高的为24 个，1个叶盘外植体诱导的体细胞胚数最高的为13个。同时菊花间接体细胞胚发生过程中 可清晰地观察到球形胚、鱼雷形胚、心形胚、子叶胚阶段。获得的再生苗生根容易，健壮抗 逆，抗病虫能力强，成本比常规低50%以上，且开花整齐，花质量提高1 2个等级，栽培管 理较容易。另外，经过间接体细胞胚发生途径获得的再生植株的稳定性为99%以上，与菊花 扦插繁殖的幼苗相比，在株高、冠幅、叶片长度上显著优于菊花扦插繁殖苗，而在花期、开花 直径上则无差异，说明经过间接体细胞胚发生途径获得的再生植株的稳定性强。通过间接 体细胞胚发生途径获得的再生植株，与传统的菊花生产中采用分株、扦插等无性繁殖方法 相比，具有抗病虫性强、生长势旺、提纯复壮等优点；与菊花的器官发生途径形成的植株相 比，繁殖速度快，降低了成本，且稳定性好。因此，在现代化的菊花生产中，该方法及由该方 法获得的再生植株提高了菊花生产的科技含量，降低了生产成本，保持了优良品种的遗传 稳定性，因此，具有较强的竞争力，对实现菊花的规范化种植，为菊花的现代化生产得到高 产、优质、稳定的菊花产品起到关键性的作用，具有较好的市场应用前景，将取得较好的经 济效益和社会效益。、r -刖。实施例5同实施例4，不同之处在于所使用的胚性愈伤组织分化培养基一为MS+蔗糖3% + 琼脂 0. 75% +KTl. Omg/L+2,4-D 1. 0mg/L+NAAl. 0mg/L, pH 6. 0 ；胚性愈伤组织组织分化培 养基二为MS+蔗糖3% +琼脂0. 75% +KTl. Omg/L+NAAl. 0mg/L, pH 6. 0，获得的胚性愈伤 组织分化率为91%，体细胞胚发生形成的再生植株的频率为90. 5，平均每外植体的芽数为 17. 4个，节间或叶片外植体经过50天培养后，通过间接体细胞胚途径获得的这三个品种的 再生植株的增殖系数达15倍。培养条件同前。实施例6当培养50d后获得的通过间接体细胞胚途径获得的再生植株达1 2cm长时移至 生根培养基上进行生根培养，生根培养基是1/2MS+蔗糖3% +琼脂0. 75% +ΝΑΑ0. lmg/L(pH 6.0)。培养条件同前。大约1周后下部形成根，2周后生根率达100%，且生根数量多，根 系粗壮。3周后当再生苗长至6 8cm，具有4 5片叶，5 6条根，且生长健壮，茎粗、叶 大、色绿时，即可将试管苗进行适当炼苗，即将培养瓶拿出培养室，去掉封口膜，置于常温下 炼苗3d。再从培养瓶中取出再生苗，用清水洗净粘附在根系上的琼脂，即可移栽入由消毒泥 炭与珍珠岩混合(1 1)的基质。基质先用水淋透，每天用喷雾器喷雾3 5次保证基质 潮湿和较高空气湿度。2周左右移栽成活，移栽成活率为95%以上。
本发明公开一种诱导菊花体细胞胚间接发生的方法，包括先从外植体中诱导出胚性愈伤组织，再将获得的胚性愈伤组织连续转接到两个不同的培养基中诱导体细胞胚的间接分化，得到菊花稳定的再生植株，从而实现菊花的再生和快速繁殖，并以之为栽培材料，进行菊花的规范化、规模化生产。