用于诱导细胞外基质蛋白合成的肽片段的制作方法 本申请是国际申请日为2007年6月12日、国际申请号为PCT/US2007/013748、进入国家阶段的申请号为200780021825.X、发明名称为“用于诱导细胞外基质蛋白合成的肽片段”的PCT申请的分案申请。[0001]本申请请求2006年6月13日提交的申请号为60/813，284的美国临时申请的优先权，该文献内容在此全文引入作为参考。[0003]皮肤老化通常表现为皱纹的形成与伤口愈合能力的削弱。伤口定义为皮肤的上皮完整性的破坏。正常的伤口愈合过程包括复杂的、动态的、但是经过精确安排的一系列导致损伤组织修复的事件。普通皮肤中最多的组分是细胞外基质(ECM)，一种由其所包围的细胞产生的胶状基质。ECM由两种主要类别组成，包括纤维结构蛋白与蛋白多糖。目前已知ECM的成分和交联状态的改变与老化以及大量的获得性或遗传性皮肤失调都有关系。人们也已经证明ECM不仅具有结构支撑的作用，还能影响诸如分化和增殖的细胞行为。同样，越来越多的研究表明其基质的组分可能是细胞信号源，能够促进上皮细胞增殖和移动，从而加快伤口愈合。[0004]最多的一类纤维ECM分子是胶原蛋白家族，其包括至少16种不同类型的胶原蛋白。皮肤基质中的胶原蛋白主要由I型(80-85% )和III型(8-11% )胶原蛋白组成，二者均为纤维状或杆状的胶原蛋白。皮肤的拉伸强度主要由这些纤维状胶原蛋白分子决定，它们自我组装为头-尾连接的微原纤维，并互相交错地横向并列排布。胶原蛋白分子与相邻的胶原蛋白分子相互交联，进一步加强了胶原蛋白纤维的强度和稳定性。对胶原蛋白网络的损伤(例如，酶或物理损伤等)，或其整体性的破坏，导致了修复治愈的发生。[0005]在科技文献和专利中都报道了刺激产生ECM蛋白的各种具有生物活性的肽类。这些肽以前是从天然资源中分离得到的，最近则成为结构-功能关系学研究的目标。天然的肽类还被作为合成的肽类似物设计的出发点。[0006]ECM蛋白中特定的序列能够刺激皮肤中有用的成分，如I型、III型胶原蛋白，纤维结合蛋白等(Katayama et al.，].B10L.CHEM.288:9941-9944(1983))。Katayama 等人从 I型胶原蛋白前肽的羧端(残基197-241)中鉴定了五肽KTTKS (SEQ IDNO:17)。该前肽被切割于产生成熟的胶原蛋白的时候。切割后的前肽可能通过生物合成反馈机制参与调节胶原蛋白的生产，其中KTTKS肽段起激活作用。Maquart等人(J Soc B10L.193:423-28(1999))报道了肽GHK和CNYYSNS同样刺激ECM合成。这些序列能够在ECM周转的时候被释放，从而传递需要ECM修复的信号。通过上述任一种机制释放出来的短肽序列通常被称为“马曲金肽(matrikines) ” (Maquart et al.，J.Soc.BIOL.193:423-28(1999))。[0007]虽然已经有一定数量的天然或合成肽存在，但是人们仍然需要改进的生物活性肽及其使用方法。


[0008]本发明公开了特征为氨基酸序列基序GxxG或PxxP的四肽，其中G(甘氨酸)和P(脯氨酸)残基是保守的，X是可变的氨基酸。该四肽来源于ECM蛋白一级序列中多次出现的序列，该ECM为IV型胶原蛋白。所披露的序列诱导所有形式的胶原蛋白产生，其诱导能力高于早先已知的肽序列，包括SEDERMA SAS (法国)公司的商标为MATRIXYL?的KTTKS。更进一步，包含不同的多次重复序列组合的组合物引起了更强烈的胶原蛋白合成应答。可以预期肽类组合物对多种不同的ECM蛋白有额外的优点。
[0009]生产特定组合的用于ECM修复的四肽会使得成本过高，难以进行商业应用。公开了一种相对简单廉价的方法，即生产生物活性四肽的不同的混合物。通过生产基序GxxG和PxxP的四肽的组合库，我们可以在一次生产流程中得到不同的生物活性四肽(例如，GEPQ、GPEG、GPPG和GEEG)。四肽组合物相对于单一肽能够诱导更多的ECM蛋白合成。包含所公开的单一或混合形式的四肽的组合物能够被用于皮肤护理行业，包括但不限于针对皮肤褶皱、肤色调节、皮肤紧致或皮肤松弛等。所公开的四肽刺激合成胶原蛋白能够有效地改善受损皮肤和老化皮肤的健 康和形态。



[0010]图1是SEQ ID NO:45，为IV型胶原蛋白氨基酸序列，表明GxxG四肽的存在。所有粗体序列标有单下划线，重叠序列标有双下划线。
[0011]图2是SEQ ID NO:46，为III型胶原蛋白氨基酸序列，表明移码(frame shift)活性PGPR和GAGP的存在。所有移码活性序列标记为粗体，加单下划线，发生一个移码(onefrmae shift away)的GxxG序列标有双下划线。
[0012]图3同样是SEQ IDNO:45，为IV型胶原蛋白氨基酸序列，表明PGPP四肽的存在。
[0013]本发明主要针对刺激ECM蛋白产生并调节伤口愈合的四肽，以及它们的应用。
肽
[0014]本发明的一个实施方式是一种分离的四肽，包括基序GxxG或PxxP。在这个实施方式中，G(甘氨酸)或P(脯氨酸)是保守的，X是可变的氨基酸。一般地，所述的肽可以是落入上述范围的任何一种肽，更加优选的是SEQ IDNO:USEQ IDNO:2、SEQ IDNO:3、SEQ IDNO:5, SEQ ID NQ:7、SEQ IDNO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NQ: 10、SEQ IDNO: 11、SEQ ID NQ:12、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NQ: 14、SEQ ID NO: 15 或 SEQ ID NO: 16。
[0015]本发明的另一个实施方式是一种分离的四肽，包括基序GxPG，其中在两个可变位点之一或两者上，X是P。在这个实施方式中，G(甘氨酸)和P(脯氨酸)是保守的，X是可变的氨基酸。一般地，所述的肽可以是落入上述范围的任何一种肽，更加优选的是SEQ IDNO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5 或 SEQ ID NO -J0
[0016]本发明的另一个实施方式是一种分离的四肽，包括基序GExG。在这个实施方式中，G (甘氨酸)和E (谷氨酸)是保守的，X是可变的氨基酸。一般地，所述的肽可以是落入上述范围的任何一种肽，更加优选的是SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:8。
[0017]本发明的另一个实施方式是一种分离的四肽，包括基序PGxP。在这个实施方式中，P(脯氨酸)和G(甘氨酸)是保守的，X是可变的氨基酸。一般地，本发明所述的肽可以是落入上述范围的任何一种肽，更加优选的是SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO: 14或SEQ ID NO:16o
[0018]本发明的另一个实施方式是一种分离的四肽，包括基序ΡΕχΡ。在这个实施方式中，P (脯氨酸)和E (谷氨酸)是保守的，X是可变的氨基酸。一般地，所述的肽可以是落入上述范围的任何一种肽，更加优选的是SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:9。
[0019]本发明的另一个实施方式是一种移码活性四肽。在这个实施方式中，所述四肽在ECM蛋白中GxxG或PxxP四肽的基础上发生一个移码。一般地，所述的肽可以是落入上述范围的任何一种肽，更加优选的是SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6。
[0020]上述一种肽可以含有D型或L型氨基酸。所述肽可以含有所有的D型或L型氨基酸。这些肽可以具有酸性的C末端(-CO2H)或者，优选的，具有氨基的C末端(-CONH2,-CONHR或者-CQNR2)。这些肽也可以被进一步增加或修饰，不论是采用化学法还是酶法。例如，这些肽可以被C末端酰胺化(-NH2)，与游离的酸性形式相比，使其对蛋白酶降解更加不敏感并提高它们的溶解度。这些肽也可以被脂化，其可以提供增强的皮肤渗透力。
[0021]上述肽可以含有以下氨基酸:R(精氨酸)、L(亮氨酸)、P(脯氨酸)、F(苯丙氨酸)、Q(谷氨酰胺)、E(谷氨酸)、1(异亮氨酸)、K(赖氨酸)、S(丝氨酸)、V(缬氨酸)、A(丙氨酸)、N(天冬酰胺)、D(天冬氨酸)、T(苏氨酸)、Y(酪氨酸)以及G(甘氨酸)。上述肽不包含下列的M(甲硫氨酸)、C(半胱氨酸)、H(组氨酸)或者W(色氨酸)。因此，在一个实施方式中，X不是选自(甲硫氨酸)、C (半胱氨酸)、H(组氨酸)或W(色氨酸)。
使用方法
[0022]本发明的另一个实施方式是关于使用上述肽类的方法。使用方法可以包括使用单一的肽，或者可以包括组合地使用两种或两种以上的肽。
[0023] 本发明的一个实施方式是一种使用刺激ECM蛋白产生的四肽来促进皮肤损伤修复和保持皮肤健康的方法。一般地，该方法涉及用含有所述肽的组合物接触上皮(皮肤)细胞。该组合物可以是气雾剂、乳剂、液体(liquid)、洗液、霜剂、糊剂、软膏剂、泡沫或其他药物学上可接受的制剂。通常，药物学上可接受的制剂包括任何适用于人体皮肤上的可接受的载体，例如，化妆上可接受的载体和皮肤治疗上可接受的载体。该组合物可以含有其他生物活性试剂，例如视黄醇类或其他肽类。该组合物可以含有药学上可接受的载体或辅剂。上述接触的步骤可以在体内、原位、体外进行，或采用本领域技术人员已知的任何方法。最优选的，该接触步骤是在体表以足够引发刺激响应的浓度来进行的。组合物中肽的浓度可以是约 0.01yg / mL 到约 100 μ g / mL,约 0.1 μ g / mL 到约 50 μ g / mL,以及约 0.1 μ g /mL到约Iyg / mL。接触步骤可以对哺乳动物，如猫、狗、牛、马、猪或人进行。优选的促进ECM蛋白产生的组合物包括SEQ ID NO:8 ;更加优选的，该组合物包含处在与至少一种其他四肽的异质混合物中的SEQ ID NO:8。在最优选的实施方式中，组合物中的单独的四肽能够使得胶原蛋白持续产生超过至少48小时。
[0024]本发明另外的一个实施方式涉及一种促进皮肤创口愈合的方法，该皮肤损伤是由正常的衰老、疾病、伤害、外伤、或者经过手术或其他医疗过程所引起的。该方法可以包括对动物的伤口施用一种组合物，其中该组合物包括上述任何一种肽，单一组分的或混合的。该组合物可以是液体、洗液、霜剂、糊剂、软膏剂、泡沫或其他药物学上可接受的制剂。该组合物可以含有药物学上可接受的载体或辅剂。该组合物可以含有其他生物活性试剂，例如抗微生物剂或生长因子。该组合物还可以与其他治疗剂合用，如组织移植物、组织培养产物、氧气或敷料等。组合物中肽的浓度可以是约0.01 μ g / mL到约100 μ g / mL,约0.1 μ g /mL到约50 μ g / mL,约0.1 μ g / mL到约lyg/ mL。该组合物可用于体表伤口给药。所述的动物通常可以是任何种类的动物，优选哺乳动物，更加优选的是人类、牛、马、猫、狗、猪、山羊或绵羊。优选的，能够促进ECM蛋白合成的、用于伤口愈合的组合物包括SEQ IDNO:8 ；更加优选的，该组合物包含处在与至少一种其他四肽的异质混合物中的SEQ ID NO:8。在最优选的实施方式中，组合物中的单独的四肽能够使得胶原蛋白持续产生超过至少48小时。
[0025]本发明另外的一个实施方式涉及一种缩小皮肤上的疤痕的方法，该皮肤损伤是由正常的衰老、疾病、伤害、外伤、或者经过手术或其他医疗过程所引起的。该方法可以包括对动物的伤口施用一种组合物，其中该组合物包括上述任何一种肽，单一组分的或混合的。该组合物可以是液体、洗液、霜剂、糊剂、软膏剂、泡沫或其他药物学上可接受的制剂。该组合物可以含有药物学上可接受的载体或辅剂。该组合物可以含有其他生物活性试剂，例如抗微生物剂或生长因子。该组合物还可以与其他治疗剂合用，如组织移植物、组织培养产物、氧气或敷料等。组合物中肽的浓度可以是约0.01 μ g / mL到约100 μ g / mL,约0.1 μ g /mL到约50μ g / mL,约0.1 μ g / mL到约I μ g/mL。该组合物可用于体表伤口给药。所述的动物通常可以是任何种类的动物，优选哺乳动物，更加优选的是人、牛、马、猫、狗、猪、山羊或绵羊。优选的，能 够促进ECM蛋白合成的、用于伤口愈合的组合物包括SEQ IDNO:8 ;更加优选的，该组合物包含处在与至少一种其他四肽的异质混合物中的SEQ ID NO:8。在最优选的实施方式中，组合物中的单独的四肽能够使得胶原蛋白持续产生超过至少48小时。
[0026]本发明的进一步的实施方式是关于组合地产生所公开的四肽的方法。所述肽可以采用本领域技术人员已知的任何方法进行合成，例如采用下列文献中披露的方法:Merrifield, R.B.，Solid Phase Peptide Synthesis 1.，].AM.CHEM.SOC.85:2149-2154 (1963) ；Carpino, L.A.et al., [(9-Fluorenylmethyl)Oxy]Carbonyl (Fmoc)Amino Acid Chlorides:Synthesis, Characterization, And Application To The RapidSynthesis Of Short Peptides, J.0RG CHEM.37:51:3732-3734 ；Merrifield, R.B.et al.，Instrument For Automated Synthesis Of Peptides, ANAL.CHEM.38:1905-1914 (1966);或者Kent, S.B.H.et al., High Yield Chemical Synthesis Of Biologically Active PeptidesOn An Automated Peptide Synthesizer Of Novel Design, IN:PEPTIDES1984 (RagnarssonU.，ed.) Almqvist and Wiksell Int.，Stockholm(Sweden), pp.185-188,所有上述文献在此被全文引入作为参考。优选的，通过能够按顺序将氨基酸添加到生长的肽链上的机制来生产所述肽。然而，这些肽也可以采用标准的液相制备方法进行合成。
[0027]人们已经观察到在肽链合成的过程中添加游离氨基酸的混合物而不是同源的肽的混合物，引起了游离氨基酸的可变的掺合，从而合成反应产生了肽的组合。在合成期间添加的两种或更多种氨基酸的混合物中所包括的特定氨基酸的相对掺合频率可以被调节。调节是通过改变合成过程中可用的游离氨基酸相对于其他氨基酸在混合物(称为等动力混合物(isokinetic mixture))中的比例来实现的。
[0028]提供了以下实施例来说明本发明的优选的实施方式。本领域技术人员应当理解，下述实施例中公开的技术方案表明发明人所发现的技术方案在本发明的实践中良好地实施，因而可以被认为构成了本发明的实践的优选方式。然而，本领域技术人员根据当前的公开内容应当理解，对于所公开的特定实施方式可以进行很多修改，并且仍然能够得到相似或类似的结果，而不背离 本发明的精神及范围。
实施例
实施例1:胶原蛋白中重复的四肽序列的鉴定
[0029]IV型胶原蛋白中比例相对较高的四肽重复序列含有基序GxxG (其中X是任何氨基酸)。其中的一些作为附图1中SEQ ID NO:45所示全长IV型胶原蛋白的部分来原位地示出。首先选择IV型胶原蛋白进行研究是考虑到它与其它专门化的ECM组分的相互作用(参见Gregory Schultz et al., 2005)。IV型胶原蛋白中有11个重复出现了 10次以上的具有 GxxG 基序的序列(GxxG 中的 XX 有 vp、ek、fp、lp、pp、sp、ep、ip、pk、qp 和 tp)。在这些四肽序列中，11个序列中的8个在其第3位上含有脯氨酸，2个在第2位上含有P，I个在第2、3位上含有脯氨酸，还有I个序列中没有脯氨酸。所公开的序列称为REPLIKINES?。“REPLIKINE”被定义为ECM蛋白中多次出现的短序列(即，是重复的)。该序列可以是在一个ECM蛋白中出现(例如，IV型胶原蛋白)。优选的，该序列在多种ECM蛋白质中出现(例如，所有的胶原蛋白，弹性蛋白，层粘连蛋白，等等)。该序列在多种ECM蛋白中的存在增加了该片段能够促进ECM蛋白合成或修复的可能性。
[0030]以上列出的IV型胶原蛋白中的11个GxxG序列在图1所示的人IV型胶原蛋白中被重点标明。在该图中，所有粗体序列标有单下划线，重叠序列标有双下划线。除了一个序列以外，这些序列还出现于1、I1、II1、V型胶原蛋白中。这一事实促进了所公开的肽刺激所有类型胶原蛋白产生的能力，尤其是当这些肽被组合使用的时候。表1给出了几个四肽重复在ECM蛋白中的频率。表1中的粗体序列是在IV型胶原蛋白中出现10次或以上的。
表1:ECM蛋白中四肽的频率