专利名称：一种提取扩增单克隆间充质干细胞的方法及所用培养液的制作方法间充质干细胞(MSC，Mesenchymal Stem Cell)来源于发育早期的中胚层和外胚层，因其具有多向分化潜能、造血支持和促进干细胞植入、免疫调控和自我复制等特点而日益受到人们的关注。间充质干细胞在体内或体外特定的诱导条件下，可分化为脂肪、骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、肝、心肌、内皮等多种组织细胞，连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能，可用于生命科学研究、药物筛选测试、组织器官修复研究等多种用途。间充质干细胞最初在骨髓中发现，随后还发现存在于人体发生、发育过程的许多种组织中，如骨髓、脂肪、滑膜、骨骼、肌肉、肺、肝、胰腺等组织以及羊水、脐带血、胎盘等。与其他组织来源相比，从胎盘和脐带组织中分离出的间充质干细胞具备如下优点①细胞更原始，有更强的增殖分化能力；②免疫细胞较为幼稚，功能活性低，不会触发免疫反应及引起移植物抗宿主病；③潜伏性病毒和病原微生物的感染及传播几率比较低；④采集时对提供者无任何危害及损伤；⑤伦理学争议少。其中与脐带血相比，由于胎盘组织体积大，胎盘中储藏的间充质干细胞数量更加丰富，是间充质干细胞的理想来源。目前的间充质干细胞提取扩增的方法一般是将供体组织消化，采用密度梯度离心法、流式细胞仪分选法、贴壁培养法等一种或多种方法提取带有特定特征(如密度1.073g/ ml、贴壁生长特性、带有特定蛋白标志物)的细胞在有血清条件下进行培养扩增，扩增到一定规模后对获得的细胞培养物进行鉴定，绝大部分符合间充质干细胞特征即认定为间充质干细胞，然后将细胞培养物继续有血清培养或转入无血清培养液继续培养，或直接使用。采用此类方法获得的间充质干细胞是供体组织中众多细胞培养扩增产生的后代，不免掺杂有许多性状类似的非间充质干细胞，细胞纯度一般只有70%左右；并且由于血清质量的不稳定性，可能会影响到细胞质量的稳定性。为了提高间充质干细胞制品的纯度，我们发明了一种无血清条件下提取扩增单克隆间充质干细胞的方法及所用培养液，并对接种密度、挑选单克隆细胞群落的条件、鉴定时机、培养液成分等条件进行了优化。通过该方法能够在8周的时间内无血清条件下完成单克隆间充质干细胞的筛选、规模化扩增和鉴定，挑选的单克隆细胞的鉴定符合率在85%以上，最终获得的单克隆间充质干细胞制品纯度可达95%以上，制品中的细胞是原始组织中单个细胞的后代，性状高度均一，从而使间充质干细胞制品使用效果更显著、产品质量更稳定，并减少血清、杂质细胞对研究结果、受试动物或受试人体可能产生的额外影响。该方法不需要使用价格极其昂贵的流式细胞仪和抗体进行分选，因而还具有投入低、易推广的优点ο发明内容为了克服现有技术提取扩增间充质干细胞存在的细胞纯度低的问题，本发明提供了一种提取扩增单克隆间充质干细胞的方法及所用培养液，通过该方法能够在8周内无血清条件下完成单克隆间充质干细胞的筛选、规模化扩增和鉴定，获得的细胞是原始组织中单个细胞的后代，性状高度均一，细胞纯度可达95%以上。本发明的技术方案依次包括以下步骤(1)单个核细胞接种从供体组织中分离出单个核细胞，根据培养容器的底部表面积，以0. 5 5X 10~6 细胞/cm2的密度接种于间充质干细胞无血清培养液，进行培养，培养期间每隔2-3天更换一次新鲜无血清培养液；(2)挑选单克隆培养至接种后3周，选取贴壁生长的由100-150个梭形细胞组成的旋涡状单克隆细胞群落(图1)，将其挑下并接种于含有无血清培养液的培养容器中，进行培养，培养期间每隔2-3天更换一次新鲜无血清培养液，细胞长满瓶壁后消化传代；(3)细胞鉴定当一个单克隆培养的细胞总数达5X10~6个细胞以上时，鉴定其是否符合间充质干细胞特征，不符合的废弃，符合的继续培养扩增或用于其他用途；通过以上步骤最终获得高纯度的单克隆间充质干细胞。在一个实施方案中，所述的供体组织是胎盘小叶。在一个实施方案中，所述的无血清培养液由DMEM_LG(Low Glucose，低糖)培养液和F12培养液以1 1体积比混合而成，并添加1XB27添加液、0. 001 0. 01umol/ml维生素 C、0. 5 5ug/ml 纤粘连蛋白(Fibronectin)、1 20ng/mlbFGF(basic Fibroblast Growth Factor，碱性成纤维细胞生长因子)、1 20ng/ml LIF(Leukemia Inhibitory Factor,白血病抑制因子)。在一个具体实施方案中，所述的无血清培养液由DMEM-LG培养液和F12培养液以 1 1体积比混合而成，并添加IXB27添加液、0. 004umol/ml维生素C、lug/ml纤粘连蛋白、 10ng/ml bFGFU0ng/ml LIF。DMEM-LG是配方公知的细胞培养液，可购自hvitrogen公司(货号11885-076)， 包含甘氨酸，0. 4mM ；精氨酸，0. 398mM ；胱氨酸，0. 201mM ；谷氨酰胺，4mM ；组氨酸，0. 2mM ； 异亮氨酸，0. 802mM ；亮氨酸，0. 802mM ；赖氨酸，0. 798mM ；甲硫氨酸，0. 201mM ；苯丙氨酸， 0. 4mM ；丝氨酸，0. 4mM ；苏氨酸，0. 798mM ；色氨酸，0. 0784mM ；酪氨酸，0. 398mM ；缬氨酸，0.803mM ；氯化胆碱，0. 0286mM ；泛酸钙，0. 00839mM ；叶酸，0. 00907mM ；烟酰胺，0. 0328mM ；盐酸吡哆醇，0. 0196mM ；核黄素，0. 00106mM ；盐酸硫胺素，0. 0119mM ；i_肌醇，0. 04mM ；氯化钙，1.8mM ；硝酸铁，0. 000248mM ；硫酸镁，0. 814mM ；氯化钾，5. 33mM ；碳酸氢钠，44. 05mM ；氯化钠，110. 34mM ；磷酸二氢钠，0. 906mM ；葡萄糖，5. 56mM ；丙酮酸钠，ImM。F12是配方公知的细胞培养液(添加剂)，可购自^witrogen公司(货号 11765-054)，包含甘氨酸，0. ImM;丙氨酸，0. ImM ；精氨酸，ImM ；天冬酰胺，0. ImM ；天冬氨酸，0. ImM;半胱氨酸，0. 2mM;谷氨酸，0. ImM ；谷氨酰胺，ImM ；组氨酸，0. ImM;异亮氨酸， 0. 0305mM ；亮氨酸，0. ImM ；赖氨酸，0. 199mM ；甲硫氨酸，0. 0302mM ；苯丙氨酸，0. 0303mM ；脯氨酸，0. 3mM ；丝氨酸，0. ImM ；苏氨酸，0. ImM ；色氨酸，0. OlmM ；酪氨酸，0. 0347mM ；缬氨酸，0. ImM ；生物素，0. 000(^99mM ；氯化胆碱，0. ImM ；泛酸钙，0. 00105mM ；叶酸，0. 0(^95mM ；烟酰胺，0. 000295mM ；盐酸吡哆醇，0. 000291mM ；核黄素，0. 0000984mM ；盐酸硫胺，0. 00089mM ； 维生素B12，0. 00103mM ；i-肌醇，0. ImM ；氯化钙，0. 299mM ；硫酸铜，0. OOOOlmM ；硫酸亚铁， 0. 003mM ；氯化镁，0. 602mM ；氯化钾，2. 98mM ；碳酸氢钠，14mM ；氯化钠，131. 02mM ；磷酸氢二钠，ImM ；硫酸锌，0. 003mM ；葡萄糖，10. OlmM ；次黄嘌呤，0. 03mM ；亚油酸，0. 0003mM ；硫辛酸，0.00102mM ；腐胺，0. OOlmM ；丙酮酸钠，ImM ；胸苷，0. 00289oB27添加液可购自hvitrogen公司(货号12587-010)，成分包含生物素，维生素 E，乙酸维生素E，牛血清白蛋白(无脂肪酸)，过氧化氢酶，人重组胰岛素，人转铁蛋白，过氧化物歧化酶，肾上腺皮质酮，D-半乳糖，盐酸乙醇胺，还原谷胱甘肽，盐酸肉碱，亚油酸，亚麻酸，孕酮，盐酸腐胺，三碘甲腺原氨酸，亚硒酸钠。维生素C (Vitamin C，Ascorbic Acid)又叫L-抗坏血酸，是一种水溶性维生素，具有参与胶原蛋白合成、抗氧化、治疗坏血病、提高机体免疫力等功效。纤粘连蛋白(Fibronectin)是细胞外基质的粘着糖蛋白，能使细胞和细胞外基质互相粘连、铆钉细胞，同时又介导细胞运动迁移，是一多功能分子，在细胞培养中有促进细胞贴壁的功能，可购自hvitrogen公司(货号PHE0023)bFGF(basic Fibroblast Growth Factor，碱性成纤维细胞生长因子)是本领域已知的一种细胞因子，其对成纤维细胞、血管内皮细胞、神经元和神经胶质细胞等多种细胞具有很强的促细胞分裂增殖活性，可购自^witrogen公司(货号CTP(^61)。LIF(Leukemia Inhibitory Factor，白血病抑制因子)是本领域已知的一种细胞因子，属于IL-6家族细胞因子家族，能调节细胞增殖、分化和表型等，可购自hvitrogen公司(货号 PHC9461)。本发明步骤(1)中所述的从供体组织中分离出单个核细胞，当供体组织是胎盘小叶时，可以通过以下方法实现使用剪刀或其他机械破碎方法将胎盘小叶剪成Icm3以下的小块，加入胰蛋白酶等试剂对组织进行消化，加入PBS溶液(磷酸盐缓冲液)处理成单细胞悬液，用密度梯度离心法收集单个核细胞。其中密度梯度离心的方法如下首先配置比重为1.073g/ml的Percoll溶液(购自GE公司)加入离心管中，然后将单细胞悬液缓缓加入离心管中，将离心管放入离心机中1500rpm离心20分钟，离心管内液体分为上中下三层，小心移除最上层液体，再用移液管吸取位于中间的单个核细胞层，即完成单个核细胞的收集。本发明步骤O)中所述的挑下瓶壁上的单克隆细胞群落，可以采用吸管将瓶壁上的细胞群落刮下并吸出，也可以采用接种环等工具将瓶壁上的细胞群落刮下再挑出。本发明步骤O)中所述的消化传代，可以通过以下步骤实现移除细胞培养液，用 PBS洗细胞一遍，加入0. 05%胰酶静置2-3分钟，加入FBS(胎牛血清)终止消化，1200rpm 离心、弃上清，用无血清培养液重悬细胞，继续培养。本发明步骤(3)中所述的鉴定培养物是否符合间充质干细胞特征，可以通过结合以下方法实现利用显微镜观测细胞形状，是否呈梭形；免疫法检测细胞表面抗原表达情况，是否符合间充质干细胞⑶14-、⑶;34_、⑶45_、⑶73+、⑶90+、⑶105+特征(参考资料《干细胞原理、技术与临床》，赵春华主编，化学工业出版社，2006年5月第1版)；使用条件诱导培养基对细胞进行脂肪诱导、成骨诱导等，检测是否具有间充质干细胞的分化潜能。根据我们实验的结果，在本发明步骤O)中挑选的单克隆细胞群落在步骤(3)中鉴定时通常有85%以上符合间充质干细胞特征，挑选准确率很高。从步骤(1)中的单个核细胞接种到步骤O)中的单克隆细胞群落达到100-150 个细胞，所需的时间一般是3周左右(18-21天)；从步骤O)中的挑选并接种单克隆到步骤(3)中的一个单克隆培养的细胞总数达5X10~6个细胞，所需的时间一般是5周左右 (30-35天)；因此本技术方案一个周期大约需8周。在另一个方面，本发明提供了一种间充质干细胞无血清培养液，由DMEM-LG(低糖)培养液和F12培养液以1 1体积比混合而成，并添加1XB27添加液、0.001 0. 01umol/ml 维生素 C、0. 5 5ug/ml 纤粘连蛋白(Fibronectin)、1 20ng/ml bFGF (basic Fibroblast Growth Factor,碱性成纤维细胞生长因子)、1 20ng/ml LIF (Leukemia Inhibitory Factor,白血病抑制因子)。在一个具体实施方案中，上述的间充质干细胞无血清培养液由DMEM-LG培养液和 F12培养液以1 1体积比混合而成，并添加1XB27添加液、0. 004umol/ml维生素CUug/ ml 纤粘连蛋白、10ng/ml bFGFU0ng/ml LIF。通过本技术方案获得的间充质干细胞培养物是供体组织中单一细胞的后代，即单克隆细胞，细胞性状高度均一，细胞纯度可达95%以上，筛选、培养体系无血清，从而使间充质干细胞制品使用效果更显著、产品质量更稳定，并减少血清、杂质细胞对研究结果、受试动物或受试人体可能产生的额外影响。该方法不需要使用价格极其昂贵的流式细胞仪和抗体进行分选，因而还具有投入低、易推广的优点。

图1 由100-150个梭形细胞组成的旋涡状单克隆细胞群落；图2 倒置光学显微镜下间充质干细胞的形状；图3 荧光标记抗体结合流式细胞仪检测细胞表面标记的结果，图3(a)表明 97. 91% 的细胞为 CD34—、CD73+，图 3 (b)表明 97. 12% 的细胞为 CD14—、CD90+，图 3 (c)表明 99. 56%的细胞为⑶45_、⑶105+，图3 (d)是空白对照，表明细胞对用于抗体标记的荧光素 PE(藻红蛋白)和FITC(异硫氰酸荧光素)的本底吸附极低，小于0.31%。图4 细胞成骨诱导后碱性磷酸酶-磷酸萘酚染色结果，表明90%以上细胞染色呈阳性，具有成骨分化倾向。图5 细胞成脂肪诱导后油红染色结果，表明90%以上细胞染色呈阳性，具有成脂肪分化倾向。

成骨诱导培养液=StemPro牌成骨分化试剂盒(StemPro Osteogenesis Differentiation Kit)；脂肪诱导培养液=StemPro牌成脂肪分化试剂盒(StemPro Adipogenesis Differentiation Kit)。上述试剂及成分均购自hvitrogen公司。II.实施步骤(1)单个核细胞接种将人体胎盘小叶(由上海复旦大学附属中山医院产科病人捐献)用剪刀剪成体积不超过Icm3的小块，加入消化液，37°C处理15分钟，加入胎牛血清终止消化，用金属滤网过滤，收集过滤后的液体，IOOOrpm离心5分钟，去除上清，收集沉淀并用PBS溶液重悬；在离心管中加入密度为1. 073g/ml的Percoll应用液(购自GE公司)，然后缓缓加入上一步获得的单细胞悬液，1500rpm离心20分钟。离心结束后将上层液体吸出废弃，然后用移液管吸取位于中间的单个核细胞层，用PBS溶液洗涤2遍，用无血清培养液重悬细胞，获得单个核细胞悬液。根据培养容器的底部表面积，将上面获得的单个核细胞以1. OX 10~6细胞/cm2的密度接种于六孔板中，37°C、5% CO2条件下培养3周。培养期间按如下方法换液接种2天后废弃原有培养液，直接添加新鲜无血清培养液，37°C继续培养；此后每隔3天更换一次新鲜无血清培养液，换液时废弃原有培养液， 用与培养液等体积的PBS缓冲液冲洗瓶壁1-2次，然后添加新鲜无血清培养液，37°C继续培养；(2)挑选单克隆细胞株培养3周后，将六孔板放于解剖镜下观察，选取贴壁的由100-150个梭形细胞组成的旋涡状单克隆细胞群落，用吸管挑下后直接接种于含有2ml无血清培养液的六孔板中， 每孔中接种1个细胞群落，本次挑选50个细胞群落，37°C培养5周，培养期间每隔3天更换一次培养液，换液时废弃原有培养液，用与培养液等体积的PBS缓冲液冲洗瓶壁1-2次， 然后添加新鲜无血清培养液，37°C继续培养；细胞长满瓶壁后传代，传代时移去培养液，用 PBS溶液洗一遍，然后加入消化液静置2-3分钟，加入FBS (胎牛血清)终止消化，1200rpm 离心、弃上清，用无血清培养液重悬细胞，继续培养；(3)细胞鉴定培养5周后，每个单克隆培养的细胞总数达5X 10~6个细胞以上，对其进行鉴定， 看是否符合间充质干细胞的特征，结果表明本次挑选的50个细胞群落中有46个符合间充质干细胞的特征，符合率92%，每个细胞群落发展而成的单克隆间充质干细胞株的纯度达 97%以上。鉴定方法如下A.显微镜检测细胞外观使用倒置光学显微镜观察贴壁细胞的形状，看是否呈梭形(图2)。B.流式细胞仪结合荧光标记抗体检测细胞表面标记①取待测细胞，0. 25%胰酶消化，用PBS重悬，分装到4支离心管中。②分组，其中一管为空白对照，一管加入CD73-PE(PhyCOerythrin，藻红蛋白)抗体 10 μ 1 和 CD34-FITC (Fluorescein Isothiocyanate，异硫氰酸荧光素)抗体 10μ 1，一管加入CD105-PE抗体10β 1和CD45-FITC抗体10 μ 1，一管加入CD90-PE抗体10 μ 1禾口 CD14-FITC 抗体 10 μ 1。③将离心管室温下避光孵育30分钟。④孵育结束，用PBS洗涤2遍，加入0. 5%多聚甲醛溶液，混勻，放置于于4°C环境下。⑤流式细胞仪上机进行检测，出具流式检测报告，记录实验结果(图3)。C.成骨诱导检测①将待测细胞置于六孔板中培养2周，其中1孔为对照组，添加前述的无血清培养液；2孔为实验组，添加成骨诱导培养液。②吸去培养液，添加固定液(40ul柠檬酸、3ml丙酮酸、2ml水混合而成)，反应 30s。③吸去固定液，添加染色液(62. 5 μ 1混合液、125 μ 1磷酸萘酚AS_MX、3ml水混合而成)，避光反应30分钟。④吸去染色液，加水重悬细胞，显微镜观察细胞成骨分化情况，结果表明90 %以上细胞染色呈阳性，具有成骨分化倾向(图4)。D.成脂肪诱导检测①将待测细胞置于六孔板中培养2周，其中1孔为对照组，添加前述的无血清培养液；2孔为实验组，添加脂肪诱导培养液。②吸去培养液，用PBS洗涤细胞一遍，加12%中性甲醛固定5分钟。③吸去固定液，添加油红染色液(0. 5g油红干粉溶于IOOnL异丙醇中，使用前加去离子水以3 2体积稀释并过滤)，反应30分钟。④吸去染色液，加水重悬细胞，显微镜观察细胞脂肪分化情况，结果表明90 %以上细胞染色呈阳性，具有成脂肪分化倾向(图5)。


本发明公开了一种提取扩增单克隆间充质干细胞的方法及所用培养液，涉及细胞提取及培养、扩增领域，包括单个核细胞接种、挑选单克隆、细胞鉴定等步骤，还提供了相关的无血清间充质干细胞培养液的配方。本发明能够在8周的时间内无血清条件下完成单克隆间充质干细胞的筛选、规模化扩增和鉴定，最终获得的单克隆间充质干细胞制品中的细胞是原始组织中单个细胞的后代，性状高度均一，从而使间充质干细胞制品使用效果更显著、产品质量更稳定，并减少血清、杂质细胞对研究结果、受试动物或受试人体可能产生的额外影响，此外还具有投入低、易推广等优点。