专利名称：：基于b7-1-pe40kdel外毒素融合基因的dna疫苗及其用途的制作方法：异基因造血干细胞移植(allo-HSCT)和实体器官移植已广泛应用于恶性血液病、某些遗传性疾病、急性重度放射病、各种实体器官功能衰竭以及脏器恶性肿瘤等多种疾病的治疗上。由于供-受者间组织相容性抗原(MHC)的差异，当然还有其它诸多已知与未知因素如次要组织相容性抗原(mHA)、组织特异性抗原以及非免疫学因素等等，不可避免的要发生宿主抗移植物(HVGD)和移植抗宿主病(GVHD或GVHR)，这是导致同种异体组织器官移植失败与移植物慢性失功(GOT)的最重要、最根本的原因之一。随着急需器官移植患者人数的不断增加，供体缺乏的矛盾显得日加突出。无论是在现在还是将来，以不完全相合或者半相合移植的病例都将成为造血干细胞移植和器官移植的主流和方向。传统的防治方法是以破坏移植受体的全部免疫机能以至于丧失移植物抗白血病(GVL)、抗感染等作用为代价的，诸如使用大剂量多种免疫抑制剂或者去除移植物中全部T细胞。毫无疑问，解决GVHD和HVGD发生发展的根本出路或新的策略则在于能否有效地干预或抑制T细胞活化的始动环节，诱导特异性的免疫耐受，从而从根本上遏制“细胞因子风暴”的发生与发展。因此，一种理想高效的allo-HSCT和器官移植治疗还应同时包含修正或改良T细胞对异基因抗原的初始反应的策略，而不是去除移植受体内或供体移植物中所有的T细胞。也就是说，诱导对受体或供体的特异性免疫耐受仅是靶向性消除或抑制受体或供体T细胞对同种异基因抗原反应的能力，但仍保留该T细胞对其它抗原反应的正常功能。业已证实，供、受体的T细胞在造血干细胞移植或器官移植中起着双重作用，既能够有助于造血干细胞或器官的植活、控制条件性感染以及抗白血病效应；同时也是导致GVHD或HVGD的根本原因。这一系列的免疫反应是通过T细胞的识别、活化而完成的。T细胞活化需要两种信号与T细胞受体结合信号和CM8共刺激信号。第一信号受第二信号调控，导致T细胞活化、部分活化或无反应。因此，通过阻断T细胞受体信号或CM8介导的共刺激信号抑制T细胞活化是防治HVGD和aGVHD的重要策略。目前国际上主要采用CTLA4_Ig或B7抗体诱导特异性免疫耐受，达到防治HVGD和aGVHD的目的，并且已在大量体内、外动物实验的结果中得到证明。但其缺憾在于，所诱导的免疫耐受期限较短，且诱导无能的T细胞可经旁路重新激活，从而导致治疗失败；并且阻断所采用的单抗多为鼠源性，其产生的免疫原性会影响疗效。因此，提供一种具有良好的免疫耐受与治疗性的治疗或预防同种异体组织/器官移植排斥反应诸如移植物抗宿主病的DNA疫苗是本领域技术人员急需解决的。
本发明人经过大量的试验和创造性的劳动，发现了一种B7-1-PE40KDEL外毒素融合基因，并且惊奇地发现，转染入真核细胞的重组表达载体PCDNA3.1/Zeo(+)-B7-1-PE40KDEL经转录、翻译和翻译后修饰被分泌到胞外，pcDNA3.1/ko(+)-B7-l-PE40KDEL可在真核细胞中高效表达并且表达产物具有很好的靶向免疫抑制活性；发明人还发现，pcDNA3.1/Zeo(+)-B7-1-PE40KDEL外毒素融合基因的DNA疫苗可以有效地预防和治疗(例如小鼠)移植物抗宿主病。由此提供了下述发明本发明的一个方面涉及一种B7-1-PE40KDEL外毒素融合基因，其核苷酸序列如SEQIDNO:1或SEQIDNO2所示。B7-1-PE40KDEL测定序列及开放阅读框分析如下SEQIDNO1的碱基序列(1850个碱基)CGTTTMCTTMGCTTGGTACCTGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGC60TCTGGGTTCCAGGTTCCACTGGTGACGTTATCCACGTGACCMGGMGTGAMGMGTAG120CMCGCTGTCCTGTGGTCACMTGTTTCTGTTGMGAGCCGGCACAMCTCGCATCTACT180GGCAAAAGGAGMGMMTGGTGCTGACTATGATGTCTGGGGACATGMTATATGGCCCG240AGTACMGMCCGGACCATCTTTGATATTACTMTMCCTCTCCATTGTGATCCTGGCTC300TGCGCCCATCTGACGAGGGCACATACGAGTGTGTTGTTCTGMGTATGMAMGACGCTT360TCMGCGGGAACACCTGGCTGMGTGACGTTATCAGTCMAGCTGACTTCCCTACACCTA420GTATATCTGACTTTGAMTTCCMCTTCTAATATTAGMGGATMTTTGCTCMCCTCTG480GAGGTTTTCCAGAGCCTCACCTCTCCTGGTTGGAAMTGGAGMGMTTAAGTGCCATCA540ACACMCAGTTTCCCMGATCCTGAMCTGAGCTCTATGCTGTTAGCAGCAMCTGGATT600TCMTATGACMCCMCCACAGCTTCATGTGTCTCATCMGTATGGACATTTMGAGTGA660ATCAGACCTTCMCTGGMTACAACCAAGCMGAGCATTTTCCTGATMCGGTGGCGGCG720GATCTGGAGGCGGTGGMGCGGTGGTGGCTCGGGCGGTGGTGGGTCGGGCGGCAGCCTGG780CCGCGCTGACCGCGCACCAGGCTTGCCACCTGCCGCTGGAGACTTCCACCCGTCATCGCC840AGCCGCGCGGCTGGGMCMCTGGAGCAGTGCGGCTATCCGGTGCAGCGGCTGGTCGCCC900TCTACCTGGCGGCGCGGCTGTCGTGGMCCAGGTCGACCAGGTGATCCGCMCGCCCTGG960CCAGCCCCGGCAGCGGCGGCGACCTGGGCGMGCGATCCGCGAGCAGCCGGAGCAGGCCC1020GTCTTGCCCTGACCCTGGCCGCCGCCGAGAGCGAGCGCTTCGTCCGGCAGGGCACCGGCA1080ACGACGAGGCCGGCGCGGCCMCGCCGACGTGGTGAGCCTGACCTGCCCGGTCGCCGCCG1140GTGMTGCGCGGGCCCGGCGGACAGCGGCGACGCCCTGCTGGAGCGCAACTATCCCACTG1200GCGCGGAGTTCCTCGGCGACGGCGGCGACGTCAGCTTCAGCACCCGCGGCACGCAGMCT1260GGACGGTGGAGCGGCTGCTCCAGGCGCACCGCCMCTGGAGGAGCGCGGCTATGTGTTCG1320TCGGCTACCACGGCACCTTCCTCGMGCGTCGCAMGCATCGTCTTCGGCGGGGTGCGCG1380CGCGCAACCAGGACCTCGACGCGATCTGGCGCGGTTTCTATATCGCCGGCGATCCGGCGC1440TGGCCTACGGCTACGCCCAGGACCAGGAACCCGACGCACGCGGCCGGATCCGCMCGGTG1500CCCTGCTGCGGGTCTATGTGCCGCGCTCGAGCCTGCCGGGCTTCTACCGCACCAGCCTGA1560CCCTGGCCGCGCCGGAGGCGGCGGGCGAGGTCGMCGGCTGATCGGCCATCCGCTGCCGC1620TGCGCCTGGACGCCATCACCGGCCCCGAGGAGGAAGGCGGGCGCCTGGAGACCATTCTCG1680GCTGGCCGCTGGCCGAGCGCACCGTGGTGATTCCCTCGGCGATCCCCACCGACCCGCGCA1740ACATCGGCGGCGACCTCGACCCGTCCAGCATCCCCGACMGGMCAGGCGATCAGCGCCC1800TGCCGGACTACGCCAGCCAGCCCGGCAAACCGCCGAAGGACGAGCTGTAA1850上述序列中，带下划线的部分为KpnI酶切位点，加框部分为起始密码子和终止密码子。上述序列SEQIDNO1中的开放阅读框为SEQIDNC:2(1827个碱基)t本发明的另一-方面涉及外_e素融合基因(SEQIDNO:1或SEQIDNO:2)所编码的外毒素融合蛋白(SEQIDNO3)OSEQIDNO:3的氨基酸序列如下:(608个氨基酸，带下划线的部分为信号肽序列)MetGluThrAsdThrLeuLeuLeuTrDValLeuLeuLeuTrDValPro151015GlySerThrGlyAsdVallieHisValThrLysGluValLysGluVal202530AlaThrLeuSerCysGlyHisAsnValSerValGluGluProAlaGln354045ThrArglieTyrTrpGlnLysGluLysLysMetValLeuThrMetMet505560SerGlyAspMetAsnlieTrpProGluTyrLysAsnArgThrliePhe65707580AsplieThrAsnAsnLeuSerlieVallieLeuAlaLeuArgProSer859095AspGluGlyThrTyrGluCysValValLeuLysTyrGluLysAspAla100105110PheLysArgGluHisLeuAlaGluValThrLeuSerValLysAlaAsp115120125PheProThrProSerlieSerAspPheGluIleProThrSerAsnlie130135140ArgArglielieCysSerThrSerGlyGlyPheProGluProHisLeu145150155160SerTrpLeuGluAsnGlyGluGluLeuSerAlalieAsnThrThrVal165170175SerGlnAspProGluThrGluLeuTyrAlaValSerSerLysLeuAsp180185190PheAsnMetThrThrAsnHisSerPheMetCysLeulieLysTyrGly195200205HisLeuArgValAsnGlnThrPheAsnTrpAsnThrThrLysGlnGlu210215220HisPheProAspAsnGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGly225230235240GlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGlySerLeuAlaAlaLeuThr0074]2452502550075]AlaHisGlnAlaCysHisLeuProLeuGluThrSerThrArgHisArg0076]2602652700077]GlnProArgGlyTrpGluGlnLeuGluGlnCysGlyTyrProValGln0078]2752802850079]ArgLeuValAlaLeuTyrLeuAlaAlaArgLeuSerTrpAsnGlnVal0080]2902953000081]AspGlnVallieArgAsnAlaLeuAlaSerProGlySerGlyGlyAsp0082]3053103153200083]LeuGlyGluAlalieArgGluGlnProGluGlnAlaArgLeuAlaLeu0084]3253303350085]ThrLeuAlaAlaAlaGluSerGluArgPheValArgGlnGlyThrGly0086]3403453500087]AsnAspGluAlaGlyAlaAlaAsnAlaAspValValSerLeuThrCys0088]3553603650089]ProValAlaAlaGlyGluCysAlaGlyProAlaAspSerGlyAspAla0090]3703753800091]LeuLeuGluArgAsnTyrProThrGlyAlaGluPheLeuGlyAspGly0092]3853903954000093]GlyAspValSerPheSerThrArgGlyThrGlnAsnTrpThrValGlu0094]4054104150095]ArgLeuLeuGlnAlaHisArgGlnLeuGluGluArgGlyTyrValPhe0096]4204254300097]ValGlyTyrHisGlyThrPheLeuGluAlaAlaGlnSerlieValPhe0098]4354404450099]GlyGlyValArgAlaArgAsnGlnAspLeuAspAlalieTrpArgGly0100]4504554600101]PheTyrlieAlaGlyAspProAlaLeuAlaTyrGlyTyrAlaGlnAsp0102]4654704754800103]GlnGluProAspAlaArgGlyArglieArgAsnGlyAlaLeuLeuArg0104]4854904950105]ValTyrValProArgSerSerLeuProGlyPheTyrArgThrSerLeu0106]5005055100107]ThrLeuAlaAlaProGluAlaAlaGlyGluValGluArgLeulieGly0108]5155205250109]HisProLeuProLeuArgLeuAspAlalieThrGlyProGluGluGlu0110]5305355400111]GlyGlyArgLeuGluThrlieLeuGlyTrpProLeuAlaGluArgThr0112]545550555560ValVallieProSerAlalieProThrAspProArgAsnlieGlyGly565570575AspLeuAspProSerSerlieProAspLysGluGlnAlalieSerAla580585590LeuProAspTyrAlaSerGlnProGlyLysProProLysAspGluLeu595600605本发明的还一方面涉及一种重组表达载体，其含有与选自pcDNA3.1Zeo(+)、pffLNEO,pSV2CAT、pOG44、pXTl、pSG、pSVK3、pBPV、pMSG、pSVL和腺病毒的真核表达载体有效连接的B7-1-PE40KDEL外毒素融合基因。在本发明的一个实施方案中，所述的重组表达载体，其由B7-1-PE40KDEL基因与pcDNA3.1/Zeo(+)载体组成。本发明的还一方面涉及一种组合物，其含有本发明的任一项重组表达载体。本发明的还一方面涉及一种治疗或预防移植物抗宿主病的DNA疫苗，其包含本发明的任一项重组表达载体。在本发明的一个实施方案中，所述的DNA疫苗，其还包含医药学上可接受的免疫佐剂。在本发明的一个实施方案中，所述的DNA疫苗，其用于以注射、粘膜、基因枪导入等方式实施免疫；具体的，其用于以至少一种选自静脉注射、动脉注射、肌肉注射、皮下注射、器官注射、胸腔注射和腹腔内注射的方式实施免疫。在本发明的一个实施方案中，所述的DNA疫苗，其为可经由注射或可经由粘膜施用的水溶液剂或复溶用冻干粉针剂。本发明的又一方面，提供一种制备DNA疫苗的方法，其包括将包含SEQIDN0:1或2所示核苷酸序列的B7-1-PE40外毒素融合基因与pcDNA3.1/Zeo(+)载体有效连接的步骤。根据本发明所述制备DNA疫苗的方法，其包括以下步骤1)分别设计含有信号肽及KpnI酶切位点的上游引物P1，及含有确^CbaI酶切位点的下游引物P2，其中所述引物的序列如SEQIDNO4和SEQIDNO5所示；2)以原核表达载体pGEMT-B7-l-PE40KDEL质粒为模板，采用高保真的PfuDNA聚合酶进行PCR扩增；3)将PCR扩增产物回收，并用KpnI+Xbal双酶切上述回收产物及pcDNA3.1/Zeo(+)载体，电泳后回收酶切产物；4)回收酶切产物；5)将双酶切后的PCR产物与pcDNA3.1/Zeo(+)载体连接；6)挑取具有Amp抗性的阳性菌落，提取质粒，双酶切鉴定，菌株冻存；和7)培养菌株，提取并纯化DNA疫苗治疗用质粒，以及任选地，8)将所获得的质粒与医药学上可接受的免疫佐剂混合。本发明的还一方面涉及本发明的外毒素融合基因或者本发明的重组表达载体在制备治疗或预防移植物抗宿主病的DNA疫苗中的用途。本发明的还一个方面涉及一种治疗或预防移植物抗宿主病的方法，包括向受试者施用治疗或预防有效量的本发明的DNA疫苗的步骤。可以将一天的剂量在一天中一次性全部给与受试者，也可以在一天内将需要的剂量分成两个、三个、四个或更多个小剂量以合适的间隔施用。所述小剂量可以配制成单元剂量形式，例如每个单元剂量形式含有日总剂量细分适宜次数的相应量。当然，也可以以一定的时间周期施用，例如一天施用一次、两天施用一次、一周施用一次、一月施用一次、二月施用一次、三月施用一次、六月施用一次、一年施用一次、两年施用一次等。图1真核表达载体pcDNA3.1/B7-1-PE40KDEL构建示意图，其中S表示信号肽序列。图2琼脂糖电泳分析B7-1-PE40KDELPCR扩增结果。泳道1，DNAmarker(DNA标志物)；泳道2，B7-1-PE40KDELPCR扩增产物。图3琼脂糖电泳分析KpnI+XbaI双酶切重组质粒pcDNA3.1/B7-1-PE40KDEL结果。泳道1，DNAmarker；泳道2，XbaI单酶切重组质粒；泳道3，KpnI+XbaI双酶切重组质粒。图4转染CH0-K1-RPE.40细胞后RT-PCR产物的琼脂糖凝胶电泳分析。泳道1，DNA标志物；泳道2，转染pcDNA3.1/B7-1-PE40KDEL的CH0-K1-RPE.40细胞B7-1-PE40KDEL扩增结果；泳道3，β-actin的PCR扩增产物；泳道4，转染pcDNA3.1空载体的CH0-K1-RPE.40细胞B7-1-PE40KDEL扩增结果；泳道5，未经转染的CH0-K1-RPE.40细胞B7-1-PE40KDEL扩增结果。图5=WesternBlot检测B7-1-PE40KDEL融合蛋白在真核细胞中的分泌。泳道1，转染pcDNA3.1/Zeo(+)-B7-1-PE40KDEL；泳道2，pcDNA3.1/Zeo(+)空载体。图6经Zeo筛选后获得稳定转染CHO-Kl-RPE.40细胞株表达PEA的相对于定量结果。图A，实时聚合酶链反应定量分析；图B，扩增曲线；图C，溶解曲线。图7=PEA浓度检测的标准曲线。图8真核表达产物B7-1-PE40KDEL的选择性细胞抑制活性比较。图9琼脂糖电泳分析pcDNA3.1/B7-1-PE40KDEL质粒肌肉注射后在血液中的表达情况。图10:PE40KDELmRNA在血液中的相对定量表达。图Ii采用流式细胞仪分析外周血⑶3+ra^+T细胞的部分代表图。图12融合毒素基因疫苗pcDNA3.1/B7-1-PE40KDEL肌注后体内Q^8+T细胞清除状况。图13血清中PEA抗体浓度检测的标准曲线。图14受鼠出现典型GVHD体征，图为典型的弓背㈧和脱毛⑶表型。图15移植后各组小鼠体重变化。A:aGVHD模型组；B骨髓移植组；C脾细胞移植组；D单纯照射组。图16移植后嵌合体检测Y染色体sry基因PCR扩增产物电泳图。泳道1，DNA标志物；泳道2，aGVHD模型组sry基因扩增；泳道3，骨髓移植组sry基因扩增；泳道4，脾细胞移植组sry基因扩增；泳道5，单纯照射组sry基因扩增。图17:aGVHD受鼠病理组织学切片(HE染色X100)。A小肠；B肝脏；C脾脏；D皮肤。图18移植后各组GVHD小鼠的生存率。图19移植后各组GVHD小鼠的体重变化。图20移植后各组aGVHD小鼠WBC的变化。图21外毒素融合基因疫苗pcDNA3.1/B7-1-PE40KDEL以及pcDNA3.1/B7-2-PE40KDEL防治各组aGVHD小鼠小肠的组织病理学改变(HE染色，40X)。A组(B7-1)，B组(B7-2)，C组(B7-1+B7-2)，D组(空载体组)，E组(CsA+MTX)，F组(aGVHD未治疗组)。图22外毒素融合基因疫苗pcDNA3.1/B7-1-PE40KDEL以及pcDNA3.1/B7-2-PE40KDEL防治各组aGVHD小鼠皮肤的组织病理学改变(HE染色，40X)。A组(B7-1)，B组(B7-2)，C组(B7-1+B7-2)，D组(空载体组)，E组(CsA+MTX)，F组(aGVHD未治疗组)。图23外毒素融合基因疫苗pcDNA3.1/B7-1-PE40KDEL以及pcDNA3.1/B7-2-PE40KDEL防治各组aGVHD小鼠肝脏的组织病理学改变(HE染色，40X)。A组(B7-1)，B组(B7-2)，C组(B7-1+B7-2)，D组(空载体组)，E组(CsA+MTX)，F组(aGVHD未治疗组)。图24外毒素融合基因疫苗pcDNA3.1/B7-1-PE40KDEL以及pcDNA3.1/B7-2-PE40KDEL防治各组aGVHD小鼠的生存曲线以及中位生存时间。图25移植后各组嵌合体检测Y染色体sry基因PCR扩增产物电泳图。泳道1，DNA标志物；泳道2，pcDNA3.1/B7-1-PE40治疗组sry基因扩增；泳道3，pcDNA3.1/B7-2-PE40治疗组sry基因扩增；泳道4，B7-1+B7-2治疗组sry基因扩增；泳道5，pcDNA3.1输注组sry基因扩增；泳道6，CsA+MTX输注组sry基因扩增；泳道7，aGVHD模型组sry基因扩增。图沈外毒素融合基因疫苗治疗对aGVHD小鼠外周血⑶4+/⑶8+细胞比例的影响。图27流式细胞术分析各组小鼠外周血中⑶3+⑶4+T以及⑶3+CD8+T细胞比例的部分代表性图谱。图28外毒素融合基因疫苗治疗对aGVHD小鼠外周血CD4+CD25+Treg/CD4+T细胞比例的影响图四流式细胞术分析小鼠外周血中⑶4+⑶25+Treg细胞比例的部分代表性图谱。图30外毒素融合基因疫苗治疗对aGVHD小鼠外周血⑶细胞比例的影响。图31流式细胞术分析小鼠外周血中⑶细胞比例部分代表性图谱。具体实施例方式下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。实施例1真核表达载体pcDNA3.1/B7-1-PE40KDEL的构建1.材料与方法1.1质粒、细胞及主要试剂PGEMT-B7-1-PE40KDEL(2003.3.3)原核表达载体由本室构建。表达载体pcDNA3.1/Zeo(+)由我室保存。kocin、Trizol、Lipofectamine2000购自Invitrogen公司；DMEM/F12培养基购自Gibco公司。Jurkat细胞系、Raji细胞系为本室保存。CHO-K1-RPE.40细胞系由MoehringJM和MoehringTJ构建，由SucicJoseph.博士惠赠。PEA多抗购自Sigma公司；CD80单抗购自R&D公司。PVDF膜，AmiconUltra-4购自Millipore公司。ECL发光液购自Pierce公司。MTS(CellTiter96AQueousOneSolutionCellProliferationAssay)、PureYieiIdplasmidmidiprepsystem购自Promega公司。反转录试剂盒、SYBRPremixExTaqTM、KpnI酶、XbaI酶及T4连接酶购自TaKaRa公司。TMB底物显色液、2XPfuPCRMasterMix购自TIANGEN公司。QIAquickGelExtractionKit购自QIAGEN公司。1.2主要仪器9700PCR仪(PerkinElmer)，Dll640紫外检测仪(Beckman)，MiniII型蛋白电泳仪及蛋白半干电转仪(Bio-fcid)，Gel-Pro3.1凝胶成像系统(MediaCybernetic)，550全自动酶标仪。实时荧光定量PCR仪(Stratagene，Mx3005P)。1.3真核表达载体pcDNA3.1/B7-1-PE40KDEL的构建分别设计含有信号肽及KpnI酶切位点的上游引物P1，及含有^CbaI酶切位点的下游引物P2。信号肽序列参照invitrogen公司的pSecTag2-B载体的信号肽MurineIgk-chainV-J2-Csingnalp印tide，分泌性较强。引物序列如下上游引物Pl:5，GGTACCTATCGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACTGGTGACGTTATCCACGTGACCAAGGAAGTG3，(SEQIDNO:4，其中，下划线部分为KpnI酶切位点，加框部分为起始密码子，斜体部分为信号肽编码序列)下游引物P2:P2:5’TCTAGATTACAGCTCGTCCTTCGGCGG3，(SEQIDNO:5，其中，下划线部分为XbaI酶切位点)因加入信号肽后的Pl序列过长，故用SOE-PCR方法将Pl分成两段引物进行重叠扩增。Pl-A5’CTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACTGGTGACGTTATCCACGTGACCAAGGAAGTG3’(SEQIDN0:6)Pl-B5，GGTACCTATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCA3，(SEQIDNO7)以原核表达载体pGEMT-B7-l-PE40KDEL质粒为模板，采用高保真的PfuDNA聚合酶进行PCR扩增。扩增体系如下2XPfuPCRMasterMix12.5μ1Pl(20μΜ)0.5μ1Ρ2(20μΜ)0.5μ1pGEMT-B7-l-PE40KDEL(150)3μ1ddH208.5μ1总体积25μ1PCR反应条件如下96°C预变性5min，96°C变性lmin，63°C退火lmin，72°C延伸30个循环，后72°C延伸lOmin，琼脂糖凝胶电泳鉴定。将PCR扩增产物回收，并用KpnI+XbaI双酶切上述回收产物及pcDNA3.1/Zeo(+)电泳后回收酶切产物。酶切体系如下IOXMBuffer2μ1XbaI1μ1KpnI1μ10.1%BSA2μ1回收PCR产物及pcDNA3·1/Zeo(+)14μ1载体总体积20μ1混勻后37°C水浴3h。将酶切产物按如下步骤回收1)用干净刀片将目的条带从琼脂糖凝胶上切下放入1.5mlEp管中。2)称量凝胶的重量，按IOOmg的凝胶加300μ1的BufferQG加入相应体积的溶胶3)50°C水浴孵育IOmin直至胶完全溶解，其间每2_;3min上下颠倒以彻底混勻。4)加入1倍体积的异丙醇，充分混勻。5)将样品加入QIAquick柱，离心Imin0弃掉废液，加0.5mlBufferQG,离心Imin06)弃掉废液。加0.75ml的BufferPE，放置2_5min，离心Imin07)弃掉废液，离心lmin。后将柱放于1.5ml的干净Ep管中。8)将30μ1注射用水加入柱膜中央，放置Imin后离心Imin收集洗脱液。9)将双酶切后的PCR产物与pcDNA3.1/Zeo(+)载体连接，体系如下2XT4LigaseBuffer5μ1Τ4Ligase1μ1双酶切PCR产物3μ1双酶切pcDNA3.1/Zeo(+)1μ1总体积10μ1将连接管至于4°C冰水混合物中连接过夜。将连接产物按如下方法转化入Dffia感受态菌中。具体操作如下1)将连接产物5μ1、试剂A20μ1用无菌水稀释至100μ1，冰上备用。2)冰上融化入Dffia感受态菌(5min)，加入上述稀释备用质粒。3)冰上放置20min，后室温放置lOmin。铺板，37°C过夜。挑取具有Amp抗性的阳性菌落，提取质粒，双酶切鉴定(条件同前)，阳性者送TaKaRa公司测序确认。将鉴定序列正确的菌株冻存并大量培养，采用PureYieild质粒中提试剂盒大规模提取并纯化基因治疗用质粒。提纯的质粒溶解于生理盐水中，260/280在1.82.0.浓度〉0.5μg/μ1。1.4重组质粒pcDNA3.1/B7-1-PE40KDEL在CH0-K1-RPE.40细胞的瞬时表达采用脂质体介导方法，将0.5X105-2X105CH0-K1-RPE.40细胞传入6孔板(培养基为DMEM/F12，7.5%FBS,IX非必需氨基酸)，培养基加1。4μg质粒和10μ1Lipofectamine2000分别用250μIOPTI-MEMI培养基稀释，两者混合孵育20min，缓慢加入6孔板中。37°C、5%C02孵育他后，更换为完全DMEM培养基。4后收集培养细胞及上清，采用RT-PCR及Wfestern印迹进行检测。1.5RT-PCR检测转染细胞中B7-1-PE40KDEL的mRNA转染4后，将生长的CH0-K1-RPE.40细胞用PBS清洗两次，参照说明书用Trizol试剂盒提取细胞总RNA，然后逆转录合成cDNA，分别用上述引物PI、P2进行PCR扩增，并采用β-actin作为参比对照。反转录体系如下MgCl22μ110XRNAPCRBuffer1μ1dNTPMixture1μ1RNaseInhibitor0.25μ1AMV0·5μ1OligodT0.5μ1RNA4·75μ1总体积10μ1反应条件为42°C30min，99°C5min，5°C5min。PCR反应体系如下MgCl23μ110XLABuffer4μ1(MH2O31.75μ1LATaq0.25μ1Pl(20μm)0.5μ1P2(20μm)0.5μ1cDNA第一链10μ1总体积50μ1反应条件如下96°C预变性5min，96°C变性lmin，55°C退火lmin，72°C延伸3min，30个循环，后72°C延伸IOmin。1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。β-actin引物序列为上游引物Pl:5，CTGTGGCATCCACGAAACTA3，(SEQIDNO8)下游引物P2:5ACATCTGCTGGAAGGTGGAC3，(SEQIDNO:9)1.6Western印迹检测转染细胞B7-1-PE40KDEL蛋白的表达1)蛋白电泳转染CH0-K1-RPE.40细胞4后，收集培养上清并浓缩。取15μ1样品与15μ12XSDSLoadingBuffer混勻，煮沸5min，行SDS-PAGE蛋白电泳，80V电压电泳至蛋白泳出积层胶，后行150V电泳至分离胶底部，断开电源。蛋白电泳配方如下10%分离胶5%积层胶2)转膜电转至PVDF膜。PVDF膜选用Immobilon-P。在甲醇浸泡15s，水中泡2min,电转液中泡20min，同时将滤纸及胶泡电转液15min，按+(白色)/三层滤纸/膜/胶/三层滤纸/黑色。转膜条件60mA40min。3)使用封闭液室温封闭浊；4)加入以适当比例用封闭液稀释的一抗，PEA多抗或⑶80单抗4°C过液；5)TBST洗涤3次，每次5min；6)加入用封闭液稀释的HRP-抗兔或抗山羊IgG—抗，室温孵育Ih；7)TBST洗涤3次，每次IOmin；8)采用ECL方法曝光显影、定影。1.7重组质粒pcDNA3.1/B7-1-PE40KDEL稳定转染CH0-K1-RPE.40细胞采用脂质体介导方法，具体操作同1.4。转染24h后，120稀释转染细胞，按800μg/ml浓度加入kocin，每隔3d换液一次，待抗性克隆逐渐增大后将其转至M孔板，长满后传至6孔板中继续培养，并扩增多瓶。用实时荧光定量RT-PCR相对定量的方法进行鉴定，将阳性细胞克隆冻存备用。1.8ELISA检测稳定转染细胞B7_1_PE40KDEL蛋白表达量1)收集稳定转染细胞的4培养上清并浓缩。幻取10μ1浓缩液按110稀释后包被96孔板过夜，每孔100μ1，每组样品设3个平行孔。3)封闭液封闭Ih。4)加入抗PEA多抗37°C孵育Ih。幻用PBST洗板3次。6)加HRP-抗兔IgG37°C孵育Ih。7)PBST洗板3次。8)加入显色液TMB，15min后用2mol/L的H2S04中止，测450nm吸光度值并计算相应浓度。9)以未转染质粒的正常细胞培养液作为空白对照。采用PEA作为标准品绘制标准曲线(KirmanJR,SederRA.DNAvaccination:theanswertostable,protectiveT-cellmemory？CurrOpinImmunol,2003,15:471-476.)。1.9真核表达产物B7-1-PE40KDEL的选择性细胞毒作用检测(5ml)(2ml)ddH2030%丙烯酰胺1.5MTris-HCl(PH8.8)1.OMTris-HCl(PH6.8)10%SDS10%过硫酸铵TEMED1.90ml1.70ml1.30ml0.25ml0.05ml0.05ml0.002ml1.40ml0.33ml0.02ml0.02ml0.002ml1将高表达⑶观的人淋巴瘤细胞系Jurkat、鉴定阳性的pcDNA3.1/B7-1-PE40KDEL稳定转染CH0-K1-RPE.40细胞以lX105/ml浓度共培养于96孔培养板中，于37°C、5%CO2培养条件下孵育48h，加入20μ1MTS,Ih后测定490nm吸光度值计算细胞毒活性。以低表达⑶观的人Burkitt’s淋巴瘤细胞系Raji作为阴性对照。细胞死亡率按如下公式计算细胞死亡率=(1-稳定转染CH0-K1-RPE.40细胞与靶细胞共培养孔中的存活细胞/未转染CH0-K1-RPE.40细胞与靶细胞共培养孔中的存活细胞)X100%.2.结果2.lpcDNA3.1/B7_1_PE40KDEL真核表达载体的构建为使B7-1-PE40KDEL融合基因可在真核细胞中表达，一个含有B7-1-PE40KDEL以及Zeo抗性基因的真核表达载体pcDNA3.1/B7-1-PE40KDEL按图1所示构建。用所设计的PCR引物扩增人B7-1-PE40KDEL，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分析，可见预期大小为1850bp的特异性条带(图2)。将双酶切回收后产物克隆入真核表达载体pcDNA3.l/Zeo(+)的KpnI和^CbaI酶切位点，构建成pcDNA3.1/B7-1-PE40KDEL重组质粒，经质粒提取、双酶切后电泳(图3)和测序鉴定结果(图4，测序图见附录1)，得到阳性克隆。测序显示信号肽之后的碱基序列没有发生点突变和移码突变，与原核表达质粒PRSETA-B7-1-PE40KDEL中的基因序列完全一致，与人B7-1以及PE40蛋白一、二级结构比对结果见表1。表1:B7-1-PE40KDEL融合蛋白与B7-1及PE40蛋白一、二级结构比较权利要求1.一种B7-1-PE40KDEL外毒素融合基因，其核苷酸序列如SEQIDNO:1或SEQIDNO:2所示。2.权利要求1所述的外毒素融合基因所编码的外毒素融合蛋白。3.一种重组表达载体，其含有与选自pcDNA3.lZeo(+)、pWLNE0、pSV2CAT、p0G44、pXTl、pSG、pSVK3、pBPV、pMSG、pSVL和腺病毒的真核表达载体有效连接的B7-1-PE40KDEL外毒素融合基因。4.根据权利要求1所述的重组表达载体，其由B7-1-PE40KDEL基因与pcDNA3.1/Zeo(+)载体组成。5.一种组合物，其含有权利要求3或4所述的重组表达载体。6.一种治疗或预防同种异体组织/器官移植排斥反应诸如移植物抗宿主病等的DNA疫苗，其包含权利要求3或4所述的重组表达载体。7.根据权利要求6所述的DNA疫苗，其还包含医药学上可接受的免疫佐剂。8.根据权利要求6或7的DNA疫苗，其用于以注射、粘膜、基因枪导入等方式实施免疫；具体的，其用于以至少一种选自静脉注射、动脉注射、肌肉注射、皮下注射、器官注射、胸腔注射和腹腔内注射的方式实施免疫。9.根据权利要求6或7的DNA疫苗，其为可经由注射或可经由粘膜施用的水溶液剂或复溶用冻干粉针剂。10.权利要求1所述的外毒素融合基因或者权利要求3或4所述的重组表达载体在制备治疗或预防同种异体组织/器官移植排斥反应诸如移植物抗宿主病等的DNA疫苗中的用途。全文摘要本发明属于免疫学和分子生物学领域，涉及一种基于B7-1-PE40KDEL外毒素融合基因的DNA疫苗及其用途。具体地，所述DNA疫苗含有一种重组表达载体，所述重组表达载体含有与选自pcDNA3.1Zeo(+)、pWLNEO、pSV2CAT、pOG44、pXT1、pSG、pSVK3、pBPV、pMSG、pSVL和腺病毒的真核表达载体有效连接的B7-1-PE40KDEL外毒素融合基因。本发明还涉及一种B7-1-PE40KDEL外毒素融合基因、该外毒素融合基因编码的外毒素融合蛋白、含有该外毒素融合基因的重组表达载体、以及含有所述重组表达载体的组合物。本发明的DNA疫苗具有良好的治疗或预防同种异体组织/器官移植排斥反应诸如移植物抗宿主病的效果。文档编号A61K48/00GK102161998SQ20111002398公开日2011年8月24日申请日期2011年1月14日优先权日2011年1月14日发明者奚永志,骆媛申请人:中国人民解放军军事医学科学院附属医院