专利名称：包括胎盘提取物的细胞保护剂的制作方法通常，细胞是在_196°C的极低温度下冷冻保藏，并在需要活细胞时迅速解冻获得。尽管冻融细胞(frozen-and-then-thawed cells)的存活率根据细胞类型或操作员的熟练程度而不同，但是正常且有用的细胞，非癌症细胞，的存活率非常低。另外，在只需要运输或储存几小时或几天，而并非长期运输或储存的情况下，深低温保藏(cryopreservation)法是不实际的。 近来，正在开发使用从动物组织分离的成熟细胞或干细胞来治疗各种疾病的细胞治疗技木。因此，強烈需要开发出能长时间维持从组织获得的成熟细胞和干细胞的存活性(viability)并提供更佳保藏的保护剂。目前，暂时将用于培养动物细胞的培养基用作细胞保护剂，而关于专用于保藏细胞的有用保护剂的研究很少。针对人类干细胞培养，使用包括动物血清(胎牛血清)的培养基。由于使用胎牛血清培养的细胞即使在用无血清溶液洗涤细胞后，仍旧与感染疯牛病或其他疾病的风险相关，因此美国禁止将使用胎牛血清培养的细胞移植给人类。从人骨髓以及从脂肪组织中分离间充质干细胞(mesenchymal stem cell)的技术分别公开于Pittenger et al. [Science284 143-147，1997]和 Van et al. [J. Clin. Invest. 58 699-704，1976]，其中使用a-MEM或DMEM和10_20%胎牛血清来培养细胞。然而，动物血清(胎牛血清)的使用在涉及向人体移植的安全性方面具有争议。为了克服这ー问题，尝试使用人血清代替胎牛血清[Kuznetsov SA, et al.,Transplantation. 2000Dec 27; 70 (12) : 1780-7]。然而，当细胞培养基中使用人血清而不进行任何处理时，干细胞容易丧失它们的特性，例如増殖和分化能力降低、易于分化成骨细胞等等。另外，移植后，干细胞的存活性极低并且不会完全发挥它们的能力。为了优化成体干细胞的组织再生，需要对提高移植的干细胞的存活性以及优化并提高移植效果的技术进行研究。
技术问题因此，本发明的目的是提供一种细胞保护剂，所述细胞保护剂相比于现有的动物细胞培养基能够提高在低温下储存的细胞的存活性，井能够提高干细胞的増殖和能力(capability)。技术方案本发明的发明者们致カ于解决前述现有技术的问题。结果，他们开发了ー种包括氨基酸、矿物质、维生素、生长因子和胎盘提取物的细胞保护剂，并证实该细胞保护剂能够不使用动物血清而提高动物细胞的存活性且能够增强干细胞的能力。有益效果本发明的细胞保护剂可用于安全地储存细胞，不仅是干细胞而且还有各种其他的动物细胞。当用于细胞治疗的细胞在低温储存和运输时，该细胞保护剂可用于保护所述细胞。当在培养前用本发明的细胞保护剂处理动物细胞时，可获得提高的细胞増殖率和干细胞能力。因此，本发明的细胞保护剂作为保藏细胞以及提高干细胞能力的保护剂是非常有用的。通过下面结合附图对给出的优选实施方式的描述，本发明的上述以及其他目的、特征和优点将显而易见，在附图中图I比较了在对照培养基或在本发明的CeLLGUARD溶液中低温(4°C )储存了 72小 时的从脂肪组织中分离的脂肪细胞在没有培养时的细胞存活率；图2a比较了用对照培养基或CeLLGUARD处理的源自脂肪组织的间充质干细胞的干细胞能力；图2b比较了用对照培养基或CeLLGUARD处理的源自脂肪组织的间充质干细胞的细胞増殖率；图3a比较了用对照培养基或CeLLGUARD处理的源自脂肪组织的间充质干细胞在7天、10天和14天的细胞增殖率；图3b示出了用对照培养基或者CeLLGUARD处理源自脂肪组织的间充质干细胞后，鉴定表面表达标记的结果；图4a和图4b比较了用对照培养基或CeLLGUARD处理的间充质干细胞愈合伤ロ的效果;图5示出了在用对照培养基或CeLLGUARD处理从皮肤组织分离的角质形成细胞(keratinocyte)并培养后,鉴定表面表达标记的结果；以及图6比较了从皮肤组织分离的角质形成细胞在用对照培养基或CeLLGUARD处理后，培养后的干细胞能力。最佳实施方式下文中，将參考附图详细描述本发明的实施方式。一方面，本发明提供ー种包括氨基酸、矿物质、维生素、生长因子和胎盘提取物的细胞保护剂。在本发明中，细胞保护剂指ー种培养基组成，所述组成用于在低温或者室温下储存动物细胞几小时至几天，直至所述动物细胞被用于实验、操作或处理。细胞保护剂与为了生长和増殖特定细胞所优化的普通动物细胞培养基在组成、含量和使用上不同。尽管本发明的细胞保护剂可作为培养细胞的添加剂而添加，但是它自身不足以用作培养基。也即，对于特定细胞的培养和生长来说，推荐使用针对它们优化的培养基，而并不推荐使用本发明的细胞保护剂自身作为培养基。所述细胞保护剂可用于保藏细胞，添加到培养基中以提高细胞的存活性或生长，或者在细胞在充分培养基中生长之前处理细胞。本发明的细胞保护剂可用于动物细胞，优选干细胞，更优选成体干细胞。通常，动物细胞需要氨基酸、矿物质、维生素等以便存活。通常使用的动物细胞培养基包括这些成分。尽管本发明的细胞保护剂也包括诸如氨基酸、矿物质、维生素等的那些成分，但是细胞保护剂中的这些成分的组成和含量与动物细胞培养基不同，因为细胞保护剂的目的是保藏各种动物细胞而不是培养或增殖细胞(參见表1-4)。在本发明实施例I中，对脂肪细胞执行细胞存活性测试。当细胞在低温下储存72小时，获得了至少70%的存活性(參见表I)。此外，角质形成细胞和脂肪源性干细胞的细胞増殖率和干细胞能力的测试结果也显著优于现有动物细胞培养基的测试结果(參见图2和图6)。现有动物细胞培养基包括动物血清作为营养成分。尽管这有助于细胞稳定生长，但是当细胞保护剂中包括动物血清并且室温或低温(非超低温)下长期放置时，会导致细胞存活性降低。然而，由于本发明的细胞保护剂并非用于培养或増殖细胞，而是用于提高细胞存活性直至该细胞被用于实验或操作，因此本发明的细胞保护剂是无血清的并且含有为更大量存活所需的成分。 尤其是，本发明的细胞保护剂可有用地用于保藏干细胞。对于近来研究很多的细胞治疗，本发明的细胞保护剂可用作能储存并运输干细胞的保护剂。此外，通过用本发明的细胞保护剂处理干细胞，可提高干细胞的能力。当处理干细胞时，本发明的细胞保护剂降低了细胞死亡并活化了细胞。因此，本发明的细胞保护剂对于稳定干细胞是非常有用的。优选地，在本发明的细胞保护剂中，除了组成蛋白质的20种基本氨基酸以外，氨基酸还包括L-胱氨酸和L-轻脯氨酸(L-Hydroproline)。L-羟脯氨酸用于抵御还原的DNA的氧化攻击，修复受损DNA并产生胶原蛋白。它
作为向胶原蛋白生物合成和维持的必需氨基酸-轻脯氨酸(hydroxyproline)和轻赖氨
酸提供羟基的供体，是胶原蛋白生物合成中的必要辅因子。因此，预计L-羟脯氨酸起到抗氧化剂的作用来除去反应性氧物种并防止细胞死亡。L-胱氨酸含有硫并且是毛发或角(horn)的组分。尤其是，L-胱氨酸以约10%的量存在于角蛋白中，并且易于还原成L-半胱氨酸。L-胱氨酸在决定多肽的三级结构以及酶或激素的活性中起到重要作用。因此，L-胱氨酸对于细胞活性有重要作用。优选地，在本发明的细胞保护剂中，除了细胞生长所需的诸如钙、钠、钾、铜、鉄、镁和锌之类的一般元素以外，矿物质还包括痕量元素锆、锗和钒。本发明的细胞保护剂中包括的矿物质可以以无机盐的形式存在，例如ZrOCl2 8H20, GeO2和NaV03。优选地，在本发明的细胞保护剂中，维生素包括能够抑制反应性氧物种的泛酸钙、氯化胆碱、叶酸、肌醇和抗坏血酸。矿物质和维生素用于除去细胞(例如抗氧化作用)产生的毒性物质并促进细胞代谢，由此提高细胞存活性。这些功能被认为是通过本发明的细胞保护剂中包括的成分间的相互作用而获得的。优选地，在本发明的细胞保护剂中，生长因子包括碱性成纤维生长因子(bFGF)、表皮生长因子(EGF)和血小板源性生长因子(PDGF)。这些生长因子是细胞存活所必需的并且也影响细胞的活化。除了生长因子以外，本发明的细胞保护剂可进ー步包括血清替代物，例如白蛋白。优选地，细胞保护剂的前述成分以下面的含量存在基于整个保护剂计，氨基酸0.5 M 20g/L,维生素0. 01至I. Og/L，矿物质I. 0至100g/L以及生长因子0. 001至0. Img/し在本发明的细胞保护剂中，包括有胎盘提取物，以在存储期间保持细胞存活，并且如果需要还能在储存后的培养期间提高细胞活性。可以是胎盘提取物或者胎盘水解产物。基于保护剂的总重量计，胎盘提取物或者胎盘水解产物可以以l_20wt%，优选5_20wt%的量包括在细胞保护剂中。胎盘提取物可通过用盐酸水解来自对こ型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)以及人免疫缺陷病毒(HIV)呈阴性的健康人的胎盘而制备。具体地，为了使病毒或类似物失活，用盐酸在超过101°C处理胎盘至少I小时，然后通过约121°C的高压蒸汽处理60分钟进行灭菌。胎盘水解产物可通过用丙酮处理胎盘以除去脂肪并用胃蛋白酶和盐酸进行充分水解来制备。在本发明的实施例中，使用从Hwa Sung Bio Pharm市售购得的胎盘提取物和胎盘水解产物。
在本发明优选的实施方式中，细胞保护剂包括表1-4中列出的成分。本发明的发明者们开发的细胞保护剂，被称作“CeLLGUARD”，的组分和含量列于表1_4中。本发明的细胞保护剂可用于提高在0-37°C下，优选在0-10°C的低温下，更优选在
0-4°C的低温下，最优选在4°C的低温下，储存的细胞的存活性。不同于用于细胞増殖和分化的现有干细胞培养基，本发明的细胞保护剂提高了干细胞的能力以及干细胞的细胞増殖率，而不改变细胞特性。当用本发明的细胞保护剂处理干细胞然后培养时，干细胞増殖良好并且具有提高的干细胞能力。在本发明的实施例2和3中，測量了脂肪源性间充质干细胞的干细胞能力和细胞増殖率。结果掲示，相比于现有干细胞培养基，本发明的细胞保护剂具有显著的效果。本发明的细胞保护剂可用于储存和运输细胞治疗剂，以增强细胞治疗剂的疗效。术语“细胞治疗剂”指ー种用于治疗、诊断或预防疾病目的的新概念药物，所述药物通过体外増殖或筛选自体的、同种异体的或者异种的活细胞，或者以其他方式改变细胞的生物特性，以恢复或提高所述细胞和组织的功能。具体地，患者自身或者其他动物的体细胞可增殖，或者干细胞可分化成想要的细胞，以治疗烧伤或诸如癌症、痴呆(dementia)等的各种不愈症。在这方面，美国正在进行成百种临床实验，而韩国也在积极进行研究。在用于细胞治疗的细胞应用前,安全地储存和运输它们非常重要。大部分的动物细胞，特别是干细胞，在从它们的组织中分离后就死亡或者失活。在本发明的实施例I中，使用现有的脂肪细胞培养基或本发明的细胞保护剂，将从脂肪组织分离的脂肪细胞在4°C的低温下储存72小吋，然后测量细胞存活性。使用本发明的细胞保护剂储存的细胞显示出70%或更高的细胞存活率，而使用现有的脂肪细胞培养基储存的细胞显示出50%或更低的细胞存活率。因此，本发明的细胞保护剂对于细胞在用于细胞治疗前保持细胞存活非常有用。发明实施方式现在将描述实施例和实验。下面的实施例和实验仅仅是用于说明的目的，而不旨在限制本公开内容的范围。制备例I :细胞保护剂的制备通过将表I列出的氨基酸、表2列出的矿物质、表3列出的维生素和表4列出的其他组分混合，制备本发明的细胞保护剂，并命名为“CeLLGUARD”。作为对照，对脂肪源性间充
质干细胞使用Invitrogen的进ー步含有10%胎牛血清的DMEM/F12 (I: I)培养基，而对角质
形成细胞使用Lonza的KGM培养基。[表I]氨基酸


本发明公开了一种包括胎盘提取物的细胞保护剂，更具体地，一种用于储存和保护动物细胞的细胞保护剂，包括氨基酸、矿物质、维生素、生长因子和胎盘提取物。