专利名称：淋巴细胞基因重排克隆性检测试剂盒及其检测方法淋巴瘤(lymphoma)是淋巴组织增生导致的常见恶性肿瘤，近年来随着工业化程度的普及和环境污染的加重，尤其是室内外装潢污染的加重，其发病率逐年升高，严重威胁人类身体健康和生活质量。虽然近年来淋巴瘤的治疗取得了一些进展，但因早期诊断上的困难，以及淋巴瘤类型的复杂性，其生存率的问题仍然没有根本性的改善，很多病人在确定诊断时已经处于疾病的晚期，失去了最佳治疗机会。淋巴组织由T、B、NK淋巴细胞等免疫活性细胞组成。淋巴细胞表面具有与抗体或抗原特异性结合的受体分子，包括B淋巴细胞产生的免疫球蛋白(Immunoglobin, IG),以及 T淋巴细胞产生的T细胞受体(T Cell Receptor, TCR)。淋巴细胞在未分化状态时，IG和 TCR基因的胚系形式是V、D、J、C基因从5’端到3’端呈线状不连续排列在DNA单链上；当淋巴细胞发育到一定阶段，在特殊的重组酶作用下，选择性将V、D、J、C区基因按不同顺序连接起来，即发生基因重排。只有发生基因重排才可能形成一个有表达功能的基因，淋巴细胞从母细胞分化到成熟细胞需要经过多次基因重排。正常B和T淋巴细胞呈多克隆的IG 和TCR基因重排而出现大小不同的重排DNA片段。淋巴组织恶性肿瘤的发生被认为是B或 T淋巴细胞被阻断在其分化过程中某一阶段而造成淋巴细胞的单克隆性增生，使其特殊的基因重排形式占一定的数量优势，出现单克隆性的IG或TCR基因重排所致。来源于B、T淋巴细胞的淋巴瘤分别出现IG和TCR的单克隆性重排，来源于NK细胞和NK/T细胞淋巴瘤则无IG和TCR单克隆性重排，而正常淋巴组织和反应性淋巴组织增生呈IG基因及TCR基因的多克隆性重排。这便是淋巴组织肿瘤基因诊断的理论基础。淋巴组织结构特殊，受到抗原刺激时能产生不同程度的反应性增生，正常结构出现紊乱，仅凭形态学观察很难确定其良恶性。实质上大多数淋巴瘤的早期表现就是淋巴组织非特异性增生，给早期诊断带来了困难。虽然多数淋巴组织增生性病变通过组织形态学观察及免疫表型分析能够明确诊断，但仍有较多病例需要通过基因水平的克隆性分析来协助确定病变性质，特别是在T细胞淋巴瘤的诊断上，仅凭免疫表型分析仍难定其良恶性。再加上实际工作中存在的病理形态变化的复杂性，免疫组化本身的不稳定性等原因，运用基因重排分析其克隆性则具有重要价值。基因重排检测技术为早期、疑难或微量淋巴组织标本确定诊断提供了可能，是对形态学检查和免疫组化方法的重要补充，其意义在于(I)确定淋巴组织增生性疾病良恶性，区分淋巴组织反应性增生和淋巴瘤。(2)确定淋巴瘤肿瘤细胞的起源。(3)治疗监控，帮助检查微小残余灶，确定肿瘤是否复发等。目前，检测淋巴细胞基因重排克隆性的方法主要采用PCR方法对IG及TCR基因进行克隆性检测，有相对高的敏感性。但是PCR方法的敏感性和特异性受到多种因素的影响， 其中引物的覆盖面一直是制约PCR检测阳性率的主要瓶颈。由于IG和TCR基因重排过程的复杂性、多样性和过去采用引物设计的局限性，假阴性和假阳性率均较高，使其应用受到一定限制。为解决引物覆盖率低的问题，欧洲七国血液病理等组成的专家小组2007年开发了 BI0MED-2基因重排引物检测系统及其试剂盒，有效地解决单一通用引物及半巢式PCR引物覆盖率低的问题。但是带来的问题是(l)BI0MED-2基因重排引物检测系统引物系统庞大，试剂盒非常昂贵；(2)该检测体系对反应体系如DNA聚合酶的要求较高，必需使用高质量的酶体系；(3)目前国内基因重排的收费标准较低，不能匹配该检测系统；(4)该系统推荐结果分析系统需要基因扫描，相关仪器设备非常昂贵。所以在国内，目前只有1-2家大型医院用于科研及临床诊断，大部分医院无法在临床上用于患者的诊断，临床普及难度很大。因此，现阶段国内迫切需要开发一种引物覆盖面全、成本低、操作简便及设备要求低的淋巴组织基因重排检测技术，能够在一般医院普及，来改变基因重排检测领域的现有状况，从而满足临床诊断的需要，为病人争取早期诊断，早期治疗的机会。
本发明的目的在于提供一种可用于检测淋巴细胞基因重排克隆性的试剂盒。本发明的目的还在于提供一种引物覆盖面全、成本低、操作简便及设备要求低，能够在一般医院普及的淋巴细胞基因重排克隆性检测的方法。本发明人针对目前国内现有对淋巴细胞基因重排克隆性的检测技术中存在的引物覆盖范围不全，假阴性和假阳性率高，现有试剂盒费用高，检测系统成本高，难以在国内普通医院普及推广等问题，经过广泛而深入的研究，并经过反复实验设计一套组合型引物体系，通过普通的PCR技术快速简捷地检出淋巴细胞基因重排的克隆性，确定淋巴组织增生性病变的良恶性。本发明的试剂盒和检测方法的基本原理是PCR技术，且以组合型引物体系为基础，覆盖面广，再加上科学的组合，PCR扩增时，只要有单克隆性基因重排存在就可以检测出来，从而实现对淋巴组织增生性病变的良恶性的确定。本发明人根据有关的淋巴细胞基因重排相关文献(van Dongen JJ, Langerak Aff, Briiggemann M，et al. Design and standardization of PCR primers and protocols for detection of clonal immunoglobulin and T cell receptor gene recombinations in suspect lymphoproliferations report of the Biomed—2 concerted action BMH4-C98-3936. Leukemia 2003 ；17 :2257-2317 ；van Krieken JH,Langerak AWiMacintyre EA, Improved reliability of lymphoma diagnostics via PCR—based clonality testing report of the BI0MED-2 Concerted Action BHM4-CT98-3936. Leukemia. 2007 ； 21 (2) :201-206 ；Briiggemann M，White HiGaulard P Powerful strategy for polymerase chain reaction-based clonality assessment in T-cell malignancies Report of the BI0MED-2 Concerted Action BHM4 CT98-3936. Leukemia. 2007 ；21 (2) :215-221 ;Evans PA， Port Ch, Groenen PJ, Significantly improved PCR—based clonality testing in B—cell malignancies by use of multiple immunoglobulin gene targets. Report of the BI0MED-2 Concerted Action BHM4-CT98-3936. Leukemia. 2007 ；21 (2) :207-214.)以及本发明人及其研究团队前期工作基础(倪灿荣，张太明，何妙侠等.基因重排检测技术操作体会及注意事项.临床与实验病理学杂志，2007 ;23 (4) :485-486.),结合常见的淋巴组织基因重排模式将引物的涵盖面扩大到最大范围，构成本检测试剂盒的组合引物体系来检测淋巴细胞基因重排的克隆性。具体基因重排引物组合相关信息见表I。表I淋巴细胞基因重排主要引物组合体及其检测对象和产物片段大小本发明属生物试剂技术领域。涉及与淋巴组织肿瘤诊断相关基因重排克隆性的检测。临床迫切需要开发一种引物覆盖面全、成本低、操作简便及能够在一般医院普及的淋巴组织基因重排检测试剂盒。本发明公开了一种检测淋巴细胞基因重排克隆性的试剂盒，该试剂盒是以含有组合性引物为基础的全液体型试剂，本发明还提供了相关的检测方法及分层优选方案。本发明的试剂盒用于检测淋巴细胞基因重排的克隆性，检测准确度可达到99％以上，且检测方法步骤简单，总成本低，有很高的临床推广价值。