专利名称：一种dna分子及重组质粒和大肠杆菌的制作方法L-苏氨酸是人体所必需的8种氨基酸之一，广泛应用于医药、食品、饲料等，目前L-苏氨酸主要以微生物发酵的方法生产，多种细菌可用于L-苏氨酸生产，如谷氨酸棒杆菌、大肠杆菌等。由于大肠杆菌发酵生产L-苏氨酸具有繁殖迅速、发酵温度高、生理生化基础研究较深入的优势，逐渐成为L-苏氨酸生产的常用菌株。随着世界对L-苏氨酸需求量的不断増加，L-苏氨酸高产菌株的研究越来越受到重视。其中，影响大肠杆菌高产的最关键的ー个因素就是其耐受L-苏氨酸的能力，只有解除L-苏氨酸对代谢途径的抑制，才能进而增加L-苏氨酸的产量。虽然野生型的大肠杆菌具有表达L-苏氨酸耐受蛋白的基因，但该基因所表达的蛋白量较低，仅为大肠杆菌正常生·长所需，并不能耐受大于O. IM浓度的L-苏氨酸，使得野生型的大肠杆菌的产酸能力较低。因此，利用生物技术手段对野生型大肠杆菌进行改造，使其能够具有较高L-苏氨酸耐受能力，对L-苏氨酸的生产具有十分重要的意义。
有鉴于此，本发明的目的是提供ー种DNA分子及重组质粒和大肠杆菌，使得所述大肠杆菌对L-苏氨酸具有较高的耐受活性。为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案ー种DNA分子，其核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示。本发明从NCBI数据库获得来自于耶尔森氏菌属-Yersinia enterocoliticaW22703的一段蛋白质序列，其氣基酸序列如SEQ IDNO :4所不，NCBI蛋白序号为Gi 3308625798，该蛋白具体功能尚未得到公开确认，而经申请人研究其具有耐受L-苏氨酸的活性，但是表达该蛋白的基因来源于同大肠杆菌种属差异较大的耶尔森氏菌属，其在大肠杆菌中并不能正确表达该蛋白。故本发明按照大肠杆菌W3110密码子的偏好性，优化密码子,通过核酸合成仪合成核苷酸序列如SEQ ID NO :1所示的DNA分子，测序验证该序列的正确性，合成基因酶切位点为Smal/Hindlll，其中优化、合成工作由上海生エ生物工程技术服务有限公司完成。本发明还提供ー种重组质粒pKR-C，由质粒pKK223-3在其SmaI和HindIII酶切位点间插入如SEQ ID NO :1所示核苷酸序列的DNA分子获得，经PCR和酶切验证并测序，表明如SEQ ID NO 1所示核苷酸序列的DNA分子已成功构建至质粒pKK223_3中SmaI和HindIII酶切位点间，其质粒图谱见图I。本发明还提供ー种重组质粒PKTR-C，其由以下方法制备以重组质粒PKR-C为模板，用核苷酸序列如SEQ ID NO :2所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO 3所示的下游引物扩增，BamHI/SphI双酶切扩增产物，获得由Tac启动子、SEQ ID NO : I所示核苷酸序列的DNA分子、rrnB Tl Terminator终止子、rrnBTerminator终止子组成的片段，然后与经过BamHI/SphI双酶切的质粒pKK223-3_ThrA’ BC连接即得；其中，所述Tac启动子、rrnB Tl Terminator终止子位于片段两端，SEQ ID N0:1所不核苷酸序列的DNA分子位于Tac启动子、rrnB Terminator终止子之间，rrnB Terminator终止子位于SEQ ID NO :I所示核苷酸序列的DNA分子和rrnB Tl Terminator终止子之间。经PCR和酶切验证并测序，表明所述片段已成功构建至质粒pKK223-3-ThrA’BC中BamHI和SphI酶切位点间，其质粒图谱见图2。质粒pKK223-3 和 pKK223_3_ThrA’ BC 已在文献“Kwang Ho Lee, Molecy IarSystems Biology 3 :149，2007”中公开，并可通过市售获得，两者皆为强表达质粒，以两者为基础质粒构建的重组质粒PKR-C和pKTR-C有助于本发明所述DNA分子在大肠杆菌中的表达。其中，PKR-C带有基础质粒PKK223-3的Tac强启动子，能增加大肠杆菌中所述 DNA分子的拷贝数和表达量，并通过基础质粒pKK223-3原有的具有强终止结构的rrnB TlTerminator终止子和rrnB Terminator终止子终止该基因的表达，以防所述DNA分子中TAG終止密码子不能終止基因表达造成的通读。pKTR-C是以pKR-C为模板，将上述带有Tac启动子、rrnB TlTerminator终止子和rrnB Terminator终止子的所述DNA分子克隆到质粒pKK223_3_ThrA’ BC中BamHI和SphI酶切位点间，同样具有上述优势。此外，pKTR-C带有基础质粒pKK223-3-ThrA’BC的定点突变苏氨酸操纵子-ThrA’BC，该操纵子与引入的强Tac启动子可以共同增强所述DNA分子的表达量，有利于改造后的大肠杆菌的L-苏氨酸耐受能力的提高。本发明将重组质粒pKR-C按照本领域常规方法转化到经氯化钙法制备的大肠杆菌W3110感受态细胞中，得到ー种能够耐受L-苏氨酸的新型大肠杆菌，命名为MHZ-0210-1，经PCR和酶切验证并测序，表明所述重组质粒pKR-C已成功转入大肠杆菌W3110中，并于2011年12月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No :5662，分类命名为大肠埃希氏菌，Escherichia, coli。本发明将重组质粒pKTR-C按照本领域常规方法转化到经氯化钙法制备的大肠杆菌W3110感受态细胞中，得到ー种能够耐受L-苏氨酸的新型大肠杆菌，命名为MHZ-0210-2，经PCR和酶切验证并测序，表明所述重组质粒pKR-C已成功转入大肠杆菌W3110中，并于2011年12月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No :5663，分类命名为大肠埃希氏菌，Escherichia, coli。所述大肠杆菌W3110购自于美国模式培养物集存库，商品货号为ATCC Number :39936 。将保藏编号为CGMCC No :5662和CGMCC No :5663的大肠杆菌(以下简称为MHZ-0210-1 和 MHZ-0210-2)与分别转入 pKK223_3 和 pKK223_3_ThrA’ BC 的两株大肠杆菌W3110(以下简称为MHZ-0200-1和MHZ-0200-2)进行L-苏氨酸耐受试验，结果表明，MHZ-0210-1和MHZ-0210-2两菌株分别可耐受0. 5M和0. 4M的L-苏氨酸，而MHZ-0200-1和MHZ-0200-2两菌株在0. 1-0. 5M范围内均不耐受，表明本发明所述的新型大肠杆菌菌壳耐受较高浓度的L-苏氨酸。此外，将MHZ-0210-1、MHZ-0210-2、ΜΗΖ-0200-1 和 MHZ-0200-2 分别在相同环境下进行L-苏氨酸发酵试验，结果表明，MHZ-0210-1和MHZ-0210-2两菌株L-苏氨酸产量分别为 O. 32g/L、l. 06g/L，而 MHZ-0200-1 和 MHZ-0200-2L-苏氨酸产量分别为 O、O. 9g/L，本发明所述新型大肠杆菌L-苏氨酸产量均高于各自的对照菌株，表明其可以应用于L-苏氨酸发酵中。由以上技术方案可知，本发明以一段功能未知的蛋白序列为參照，优化并合成一段新DNA序列，并克隆至强表达载体pKK223-3和pKK223_3_ThrA’ BC中，转化到大肠杆菌W3110中得到两株具有高L-苏氨酸耐受活性的新型大肠杆菌，能够应用于L-苏氨酸的发酵中。生物材料保藏信息说明I、MHZ-0210-1大肠杆菌，已于2011年12月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No :5662，地址为北京市朝阳区北辰西路I号 院3号，中国科学院微生物研究所，分类命名为大肠埃希氏菌，Escherichia, coli。2、MHZ-0210-2大肠杆菌，已于2011年12月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No :5663，地址为北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，分类命名为大肠埃希氏菌，Escherichia, coli。图I示本发明所述重组质粒pKR-C质粒图谱；图2示本发明所述重组质粒pKTR-C质粒图谱；图3示本发明所述重组质粒pKR-C的电泳鉴定图；其中，最右侧为Marker，其余两条带为PCR产物条带；图4示本发明所述重组质粒pKTR-C的电泳鉴定图；其中,最右侧为Marker,其余两条带为单酶切产物条带。參照实施例4或实施例5的方法，将质粒pKK223-3和质粒pKK223_3_thrA’ BC分别转化到大肠杆菌W3110中，得到MHZ-0200-1以及MHZ-0200-2大肠杆菌。按照《分子克隆试验指南》配制I. 5%琼脂的M9基本培养基，115°C灭菌20min，分别配制成含0、0. 1M、0. 2M、0. 3M、0. 4M、0. 5M的L-苏氨酸的培养基，待冷却到60°C左右，加入100mg/ml氨苄青霉素使终浓度100 μ g/ml, IM的IPTG O. I μ 1/ml，倒平板。菌株培养过夜，稀释10000倍取100 μ I涂布平板，每12h观察生长状況，培养72h菌落生长情况结果见表
Io表I各菌种L-苏氨酸耐受试验结果
L-苏氨酸浓度 菌株(所含质粒)
OO. IM 0.2M 0.3M 0.4M 0.5M
MHZ-0200-1 (pKK223-3 )ND - - - - --------
MHZ-0200-2 (pKK223-3-thrA，BC) ND - - - - -MHZ-0210-1 (pKR-C)++ + + + +
MHZ-0210-2 (pKTR-C)+ + + + + -注ND表示未检测到，-表示不耐受(不生长)，+表示耐受(生长)由表I可知，本发明所述新型大肠杆菌MHZ-0210-1和ΜΗΖ_0210_2能够分别耐受
O.5Μ和O. 4Μ的L-苏氨酸，但ΜΗΖ-0200-1和ΜΗΖ-0200-2两种菌株无法耐受超过O. IM的L-苏氨酸，在O的时候也无法确切检测到菌落的生长。实施例7 L-苏氨酸发酵试验将ΜΗΖ-0210-1、ΜΗΖ-0210-2、ΜΗΖ-0200-1 和 MHZ-0200-2 使用 200ml 三角摇瓶进行
发酵测试。种子培养基如表2所示，制备过程采用回转摇床，转速220rpm，培养温度37°C，装液量25ml/200ml三角瓶，同时添加终浓度100 μ g/ml的氨苄青霉素。发酵培养基如表3所示，发酵过程采用往复摇床，装液量20ml/500ml三角瓶。于37°C、150rpm振荡培养，发酵时间72h，接种量10%。发酵结束后将发酵液离心去除菌体，稀释适当倍数后经高效液相色谱法测定发酵液中L-苏氨酸含量，结果见表4。表2种子培养基
成葡萄玉米豆粕水酵母七水破 FeSO4和 pH
KH2PO4
_分—糖__浆__解液__膏___酸镁__MnSO4__值_
、农
25g/L 25g/L 7.7g/L 2.5g/L 1.4g/L 0.5g/L 50mg/L 7.0 _ 度______表3发酵培养基


本发明涉及生物技术领域，公开了如SEQ ID NO1所示核苷酸序列的DNA分子，以及由质粒pKK223-3在其SmaI和HindIII酶切位点间插入所述DNA分子获得的重组质粒pKR-C和由质粒pKK223-3-ThrA’BC在其BamHI和SphI酶切位点间插入由Tac启动子、所述DNA分子、rrnB T1Terminator和rrnB Terminator终止子组成的片段获得的重组质粒pKTR-C。将本发明所述重组质粒转入W3110大肠杆菌中获得两株具有高L-苏氨酸耐受活性的菌种，能够应用于L-苏氨酸的发酵中。