人透明带b细胞表位融合肽及其生产方法

曹佐武

2002年5月22日

2001年11月6日

2001年11月6日

暨南大学

C12N15/12GK1350003SQ0112986

表位 融合 透明 细胞 生产

1.一种人透明带B细胞表位融合肽，其特征在于由两段肽段串联而成，一个肽段含人透明带(ZP3)B细胞表位嵌合肽41肽序列，再在该肽段的C末端或N末端串联一段含有6个组氨酸表位的短肽，所述的人透明带ZP3的B细胞表位嵌合肽(41肽)序列如下Pro Ser Asp Lys His Ile Glu Gln Tyr Leu Lys Lys Lys AlaArg Arg Gln Pro His Val Met Ser Gln Try Ser Arg Ser AlaSer Arg Asn Arg Arg His Val Thr Glu GluAla Asp Val2.根据权利要求1所述的人透明带B细胞表位融合肽，其特征在于所述人透明带B细胞表位融合肽氨基酸序列如下Ala Asp Pro Ser Asp Lys His Ile Glu Gln Tyr Leu Lys LysLys Ala Arg Arg Gln Pro His Val Met Ser Gln Try Ser ArgSer Ala Ser Arg Asn Arg Arg His Val Thr Glu Glu Ala AspVal His His His His His His3.根据权利要求1所述的人透明带B细胞表位融合肽，其特征在于所述的人透明带B细胞表位融合肽氨基酸序列如下Ala Asp Pro His His His His His His Pro Ser Asp Lys His Ile GluGln Tyr Leu Lys Lys Lys Ala Arg Arg Gln Pro His Val MetSer Gln Try Ser Arg Ser Ala Ser Arg Asn Arg Arg His ValThr Glu GluAla Asp Val4.权利要求1所述的人透明带B细胞表位融合肽的生产方法，其特征在于采用基因工程方法生产5.根据权利要求4述的人透明带B细胞表位融合肽的生产方法，其特征在于基因工程方法处理后得到的培养液离心取上清，透析，浓缩，过柱；用平衡缓冲液洗柱，匀速加样，之后加入平衡缓冲液，再用洗脱缓冲液洗脱分离的样品，收集各个组分分析鉴定，回收融合肽6.根据权利要求4或5所述的人透明带B细胞表位融合肽的生产方法，其特征在于利用杆状病毒表达系统生产权利要求2所述的融合肽1)、构建杆状病毒表达载体融合肽的DNA序列如下GGATCCTTCTGACAAGCACATCGAGCAATACTTGAAGAAGAAGGCTAGAAGACAGCCTCACGTGATGAGCCAGTGGTCTAGATCTGCTTCCAGAAACCGCAGACACGTGACTGAGGAGGCTGACGTGCATCATCATCATCATCATTAAGAATTC将该DNA插入杆状病毒表达载体pAcGP67A(PharMingen catalog#21223p)的BamHI和EcoRI的克隆位点，筛选出重组质粒2)、制备重组病毒构建的重组质粒与线形化的杆状病毒基因组DNA共转染sf9昆虫细胞，一周后一些细胞出现感染状，表明发生同源重组产生重组病毒收集病毒液，-20℃保存备用3)、在昆虫细胞中表达融合肽基因用无血清培养基27℃培养昆虫细胞，对数生长期后，用制备的重组病毒感染昆虫细胞，待出现明显的感染状后，取细胞悬液，2000g离心10分钟，收集培养液上清，4℃透析20小时，中间换水3次冻干浓缩备用4)、分离纯化表达产物使用Roche公司的多组氨酸蛋白纯化柱(Cat No.1817698)，经固化金属亲和层析法批量分离纯化表达产物先用20mL平衡缓冲液洗柱，加入适量样品，封好柱之后水平转动层析柱20min，垂直放置层析柱使凝胶下沉加入20mL平衡缓冲液洗柱，再依次分别用洗脱缓冲液1，2，3(分别为10mM，50mM和500mM的咪唑)洗柱，连续收集洗脱液，每管5mL，待OD280＝0时才换下一种洗脱缓冲液分析鉴定各洗脱样品5)、鉴定表达产物用Tricine-SDS-PAGE检测收集的洗脱液成分，而洗脱液1洗脱出来的主要是细胞的自分泌蛋白融合肽主要分布在洗脱缓冲液2和3的收集液中，分子量约6-7kD把只含融合肽的洗脱液收集起来，4℃透析20小时冷冻干燥7.根据权利要求4或5所述的人透明带B细胞表位融合肽的生产方法，其特征在于利用杆状病毒表达系统生产权利要求3所述的融合肽将该DNA插入杆状病毒表达载体pAcGP67A的EcoRI和BamHI间的克隆位点，制备重组质粒，按权利要求6所述的方法制备重组病毒，感染昆虫细胞表达该嵌合肽基因

本发明涉及生物化学领域，特别是人透明带B细胞表位融合肽，本发明还涉及该融合肽的生产方法透明带是精卵识别和结合的基础，利用抗透明带抗体可以阻止精卵结合，透明带疫苗能抑制受精，在受孕前避孕天然的人透明带来源于育龄妇女的卵泡组织，可想而知，取材特别困难；用基因重组的人透明带作抗原进行主动免疫会引起自身免疫卵巢炎等副作用；van Duin等(1994)用CHO细胞表达的人透明带(rhZP3)，但Paterson等(1998)用rhZP3免疫猕猴，初次免疫产生1/10000的抗体滴度，但rhZP3引起的免疫反应也引起卵巢炎，卵泡发生抑制这是由于透明带引起的T细胞免疫导致的自身免疫反应所致发明人曾经设计了由人透明带精子受体相关的B细胞表位和外源辅助T细胞表位串联而成的嵌合肽，该嵌合肽可诱发抗体而不引起自身免疫反应但由于该嵌合肽分子量小，通过基因工程方法表达以后与宿主细胞自分泌蛋白混在一起，不易鉴定和纯化，特别是在大规模生产时增加生产成本原来的人透明带B细胞表位嵌合肽由外源辅助T细胞表位14肽和人透明带ZP3的334-360位的27肽串联组成的41肽Pro Ser Asp Lys His Ile Glu Gln Tyr Leu Lys Lys Lys Ala ArgArg Gln Pro His Val Met Ser Gln Try Ser Arg Ser Ala SerArg Ash Arg Arg His Val Thr Glu Glu Ala Asp Val多肽链的分子量约为4.5kD，如果计算一定的O-糖链，分子量可达5-7kD当用基因工程方法表达生产这一短肽时，用常规的方法不易分离纯化该短肽，特别是细胞培养液中往往含有其它的培养液蛋白和细胞自分泌蛋白等多种成分，一般要经过离子交换和凝胶过滤才能把该表达产物分离开来而且，由于该表达产物分子量很小，需要选用适合小分子量的填料进行凝胶过滤才能有效地分离本发明目的在于针对现有技术存在的缺陷，设计一种人透明带B细胞表位融合肽，在尽量不改变原嵌合肽的结构和功能的前提下对该嵌合肽进行小的分子修饰，使其基因表达产物能方便地鉴定和分离本发明的目的还在于提供该融合肽的生产方法本发明的人透明带B细胞表位融合肽由两段肽段串联而成，一个肽段含人透明带B细胞表位嵌合肽41肽序列，另一肽段是含有6个组氨酸表位的短肽，将它串联在嵌合肽的C末端或N末端作特征性标记，既可保留原肽段的功能，又便于该融合肽的鉴定和分离如果把该组氨酸表位的短肽串联在原嵌合肽的两端，则不会影响原嵌合肽的结构和功能分离后不必酶解去除6组氨酸短肽，直接使用可保留原嵌合肽的功能活性本发明的人透明带B细胞表位融合肽可以用以下方式表达1、在含人透明带(ZP3)B细胞表位嵌合肽41肽序列肽段的C末端串联一段含有6个组氨酸表位的短肽作特征性标记 2、在含人透明带(ZP3)B细胞表位嵌合肽41肽序列肽段的N末端串联一段含有6个组氨酸表位的短肽作特征性标记 其中， 表示含有6个组氨酸表位的短肽； 表示含人透明带(ZP3)的B细胞表位嵌合肽的肽段人透明带(ZP3)的B细胞表位嵌合肽(41肽)序列如下Pro Ser Asp Lys His Ile Glu Gln Tyr Leu Lys Lys Lys AlaArg Arg Gln Pro His Val Met Ser Gln Try Ser Arg Ser AlaSer Arg Asn Arg Arg His Val Thr Glu Glu Ala Asp Val串联一段含6个组氨酸的短肽后，则可利用该肽的抗体进行鉴定和分离现有商品化的分离纯化柱，可通过一步纯化法回收表达产物的融合蛋白本发明的人透明带B细胞表位融合肽生产方法是采用基因工程方法生产该融合肽基因工程方法处理后得到的培养液离心取上清，透析，浓缩，过柱；用平衡缓冲液洗柱，匀速加样，之后加入平衡缓冲液，再用洗脱缓冲液洗脱分离的样品，收集各个组分分析鉴定回收的融合肽经透析，浓缩后保存备用本发明与现有技术相比具有如下优点1、本发明的人ZP3精子受体相关的B细胞表位融合肽可用于免疫抑制受精的表位抗原，可作为抗原用于发展避孕疫苗阻止受精是透明带避孕疫苗的新突破2、由于天然来源的人透明带严重短缺，通过基因工程表达生产的人透明带B细胞表位融合肽填补了这一空白，特别是本融合肽设计了含6个组氨酸表位的短肽，便于分离纯化和产业化因此对发展新型避孕疫苗有很好的前景下面通过实施例进一步叙述本发明实施例1在人透明带B细胞表位嵌合肽的C末端串联6个组氨酸构成融合肽ZPhis 氨基酸序列如下(共49氨基酸残基)Ala Asp Pro Ser Asp Lys His Ile Glu Gln Tyr Leu Lys LysLys Ala Arg Arg Gln Pro His Val Met Ser Gln Try Ser ArgSer Ala Ser Arg Ash Arg Arg His Val Thr Glu Glu Ala AspVal HisHisHisHisHisHis利用杆状病毒表达系统生产该融合肽1)、构建该融合肽基因的杆状病毒表达载体该融合肽基因的DNA序列如下GGATCCTTCTGACAAGCACATCGAGCAATACTTGAAGAAGAAGGCTAGAAGACAGCCTCACGTGATGAGCCAGTGGTCTAGATCTGCTTCCAGAAACCGCAGACACGTGACTGAGGAGGCTGACGTGACTGTGGGACCACATCATCATCATCATCATTAAGAATTC将该DNA插入杆状病毒表达载体pAcGP67A(PharMingen catalog#21223p)的BamHI和EcoRI间的克隆位点，筛选出重组质粒2)、制备重组病毒构建的重组质粒与线形化的杆状病毒基因组DNA共转染sf9昆虫细胞，一周后一些细胞出现感染状，表明发生同源重组产生重组病毒收集病毒液，-20℃保存备用3)、在昆虫细胞中表达该融合肽基因用无血清培养基27℃培养昆虫细胞，对数生长期后，用制备的重组病毒感染昆虫细胞，待出现明显的感染状后，取细胞悬液，2000g离心10分钟，收集培养液上清，4℃透析20小时，中间换水3次冻干浓缩备用4)、分离纯化表达产物使用Roche公司的多组氨酸蛋白纯化柱(Cat No.1817698)，经固化金属亲和层析法批量分离纯化表达产物先用20mL平衡缓冲液洗柱，加入适量样品，封好柱之后水平转动层析柱20min，垂直放置层析柱使凝胶下沉加入20mL平衡缓冲液洗柱，再依次分别用洗脱缓冲液1、2、3(分别为10mM、50mM和500mM的咪唑)洗柱，连续收集洗脱液，每管5mL，待OD280＝0时才换下一种洗脱缓冲液分析鉴定各洗脱样品5)、鉴定表达产物用Tricine-SDS-PAGE检测收集的洗脱液成分，洗脱液1洗脱出来的主要是细胞的自分泌蛋白融合肽主要分布在洗脱缓冲液2和3的收集液中，分子量约6-7kD把只含融合肽的洗脱液收集起来，4℃透析20小时冷冻干燥实施例2在人ZP3的B细胞表位嵌合肽的N端串联一个6组氨酸短肽构成融合肽hisZP 氨基酸序列(50个氨基酸残基)如下Ala Asp Pro His His His His His His Pro Ser Asp Lys His Ile GluGln Tyr Leu Lys Lys Lys Ala Arg Arg Gln Pro His Val MetSer Gln Try Ser Arg Ser Ala Ser Arg Asn Arg Arg His ValThr Glu GluAla Asp Val该融合肽的DNA序列如下GGATCCACATCATCATCATCATCATGGATCCTTCTGACAAGCACATCGAGCAATACTTGAAGAAGAAGGCTAGAAGACAGCCTCACGTGATGAGCCAGTGGTCTAGATCTGCTTCCAGAAACCGCAGACACGTGACTGAGGAGGCTGACGTGACTGTGGGACCATAAGAATTC将该DNA插入杆状病毒表达载体pAcGP67A的EcoRI和BamHI克隆位点，制备重组质粒，按实施例1的方法制备重组病毒，感染昆虫细胞表达该融合肽基因通过基因工程表达生产该融合肽后，可利用现有的技术和试剂，方便地进行鉴定和分离纯化该融合肽，不需要常规的离子交换和凝胶过滤，一次性特异分离出该融合肽，对产业化有重要的价值本发明设计的融合肽保持人透明带ZP3的B细胞表位的基本结构功能，能诱发抗人透明带抗体，抗体能与人透明带结合取实施例1和2中分离纯化的融合肽免疫小鼠，每组5只小鼠，编号为HZ1、2、3、4和5；ZH1、2、3、4和5免疫注射诱导抗血清，每次免疫的剂量约5μg，首次免疫两周后，每周强化免疫一次，第35天后，眼眶取血制备血清双向免疫扩散试验用1％琼脂在载玻片上铺板，打梅花型孔，孔直径约0.3cm中央孔加入从培养液分离的表达产物浓缩品抗原，外周孔点不同的抗血清，将孔注满，编号记录将琼脂板放在密封潮湿盒中，37℃孵育24小时，观察抗原抗体扩散相遇产生的白色沉淀线ZH1、ZH3和HZ1号小鼠的抗血清出现阳性反应，结果见表1表1回收的融合肽的免疫抗血清的双扩散试验结果 人卵透明带酶标免疫细胞化学分析1.从临床手术中取人卵泡组织，制备人卵细胞的切片分四组编号，置于新配置的2％H2O2/PBS溶液中处理30分钟，抑制内源性的过氧化物酶2.ZH1、ZH3和HZ1号鼠抗血清用1％BSA/PBS液稀释10倍，对照小鼠的血清也同样稀释10倍四组切片分别用实验小鼠经稀释的抗血清和对照血清孵育30分钟3.用1％的BSA/PBS稀释辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG的二抗(IgG-HRP)25倍，用经稀释的IgG-HRP室温孵育30分钟4.DAB-H2O2液显色发现经ZH1、ZH3和HZ1号小鼠血清免疫反应后染色的切片，在卵细胞和颗粒层细胞之间的透明带有一条棕黄色的带包绕卵细胞，周围组织和卵细胞内很少或没有棕色而用对照鼠血清孵育后染色的切片，没有发现卵巢组织和卵细胞透明带区域有棕黄色说明抗血清与人卵泡的透明带有特异性结合，即融合肽ZPhis和hisZP能诱发抗人透明带抗体