专利名称：使用过氧化物氧化还原酶1(prx1)作为佐剂的方法和组合物的制作方法Prxl是典型的2-半胱氨酸过氧化物氧化还原酶家族的ー员，其主要的胞内功能是通过其过氧化物酶的活性作为过氧化氢信号通路的调控因子和作为蛋白质的伴侶蛋白。Prxl的表达在各种癌症中会上调，包括食管癌、胰腺癌、肺癌、甲状腺滤泡癌和口腔癌。PrxI水平的升高与临床结果不理想和病人整体存活情况降低相关。最近的研究证实Prxl可以由非小细胞肺癌细胞分泌，该分泌可能通过ー种非经典的分泌途径。然而，分泌的Prxl的作用至今尚未知晓，之前也未就治疗目的加以探索。
本发明提供了用于激发免疫反应的组合物和方法。这种组合物包括抗原和分离的Prxl蛋白。抗原和Prxl蛋白可以以复合物的形式提供，或者它们可以彼此共价连接。Prxl蛋白在复合物中可以以多聚体的形式存在。在一个实施方式中，所述多聚体是十聚体。组合物还可以包括接触过抗原和/或Prxl蛋白的抗原呈递细胞。抗原可以是用于激发所需要的免疫反应的任何抗原，包括但不限于传染源或癌细胞表达的抗原。在一个实施方式中，抗原由肿瘤细胞表达。在个体中激发针对抗原的免疫反应的方法包括给予该个体包含该抗原和分离的Prxl蛋白的组合物。所激发的免疫反应可强于该抗原在不给予分离的Prxl蛋白时所激发的免疫反应。激发的免疫反应可包括细胞介导的免疫反应、体液免疫及其组合。在一个实施方式中，激发针对抗原的免疫反应的个体是有风险发生、被怀疑患有或已经诊断患有癌症的个体。附图简要说明图I. Prxl刺激巨噬细胞分泌细胞因子(A)采用流式细胞仪检测TG诱出的巨噬细胞所表达的⑶llb、Grl和F4/80。示出3次独立分离的代表性柱状图，显示⑶Ilb+细胞的Grl和F4/80的表达情况。插入框中的数字表明是每个象限中CDllb+细胞的百分比。(B)将TG诱出的巨噬细胞和刺激物共同培养24小吋，收获上清液后分析TNF- α (空心柱)和IL-6 (灰色柱)的水平。结果以pg/ml为单位，代表了三组独立试验，误差线代表标准差。(C)将TG诱出的巨噬细胞分别如下培养24小时仅用培养基(黑色柱)；用IOOnM LPS或2000nM Prxl (空心柱)；用IOOnM LPS或2000nM Prxl，经lOug/mL多粘菌素B预孵育20分钟(阴影线柱)；100nM LPS或变性的2000nM Prxl (灰色柱)。星号表示与仅用Prxl或LPS处理过的细胞相比p彡O. 01。(D)将TG诱出的巨噬细胞分别以单独的培养基、Prxl (50nM)或LPS(IOOnM)培养24小时，灰色柱表示培养时添加10%的FBS，空心柱表示未添加10%的FBS。收获上清液，并分析IL-6的水平。结果以pg/ml为单位，误差线代表标准差。图2. Prxl刺激树突状细胞的成熟与激活。(A和B)将未成熟的骨髓来源的树突状细胞(iBMDC)分别以单独的培养基、20-200nM Prxl或IOOnM LPS培养24小时。(A)培养后，通过流式细胞仪分析细胞中⑶Ilc和⑶86的表达情況。结果显示为占所有细胞的百分比，误差线代表标准差。(B)收获上清液，并对TNF-α进行分析。结果以pg/ml为单位，代表三组独立实验，误差线代表标准差。(C)将TG诱出的巨噬细胞与如下培养基共同培养收获自培养转染有编码对照shRNA (乱序，Scramble)或Prxl特异性shRNA (shPrxl)的cDNA的前列腺肿瘤细胞系的培养基，或者是收获自培养表达Prxl特异性shRNA的细胞的培养基(其中添加了 50nM外源性的Prxl，shPrxl+Prxl)。培养24小时后收获上清液，对TNF-α进行分析。结果以Pg/ml为单位，代表三组独立试验，误差线代表标准差。 林P彡O. 01，与仅用培养基培养的细胞所分泌的TNF- α水平相比;## P ^ 0.01,与用获自表达对照shRNA的细胞的培养基培养的细胞所分泌的TNF- α水平相比 PS0.0丨，与用获自表达Prxl特异性ShRNA的细胞的培养基培养的细胞所分泌的TNF-α水平相比。图3. Prxl诱导的细胞因子分泌依赖于TLR4。(A)从 C57BL/6 小鼠(TLR4+/+;空心柱)和 C57BL/10ScNJ 小鼠(TLR4+ ;实心柱)分离得到iBMDC，分别用200nM PrxlUOOnM LPS或IOOmM Pam3Cys激发。收集上清液，用IL-6ELISA试剂盒分析。(B)从C57BL/6小鼠(TLR4+/+;空心柱)和C57BL/10ScNJ小鼠(TLR4+;实心柱)分离得到TG诱出的巨噬细胞，分别用200nM PrxlUOOnM LPS或IOOmMPam3Cys激发。收集上清液，用IL-6ELISA试剂盒分析。结果以pg/ml为单位；误差线代表标准差，星号表示P值小于O. 01。(C)向未处理的C57BL/6(TLR4+/+;空心柱)小鼠和C57BL/10ScNJ(TLR4^;实心柱)小鼠腹腔内注射200nm的Prxl。6小时后，采集血样，用ELISA分析IL-6的存在。结果以pg/ml为单位；误差线代表标准差，星号表示P彡O. 0002。图4 =Prxl和TLR4的相互作用依赖于CD14和MD2。(A)从C57BL/6小鼠中分离得到TG诱出的巨噬细胞，在存在或不存在对照或针对Prxl、CD14或MD2的封闭抗体的情况下用50nM Prxl刺激24小吋。收集上清液，用IL-6ELISA试剂盒分析。结果以pg/ml为单位；误差线代表SEM，星号表示P值小于O. 01。(B)收获TG诱出的巨噬细胞，如材料和方法中所述，用针对TLR4、TLR2和小鼠/山羊IgG的抗体沉淀细胞裂解物；所得沉淀物经SDS-PAGE分离并通过蛋白质印迹分析检测Prxl的存在。还用TLR4或TLR2的抗体检测印迹以作为内參照。(C)收获TG诱出的巨噬细胞，如材料和方法中所述，将细胞裂解物与针对TLR4或小鼠/山羊IgG的抗体共孵育；所得沉淀物经SDS-PAGE分离并通过蛋白质印迹分析检测Prxl、⑶14和MD2的存在。还用TLR4抗体检测印迹以作为内參照。图5 :TLR4/Prxl相互作用的动力学。(A) TG诱出的巨噬细胞经200nM的FITC-Prxl或PE连接的抗TLR4(PE-TLR4)激发。在指定的时间收集样品。样品和细胞群体通过安尼斯(Amnis)技术分析。图示为在每个时间点下，代表性的免疫染色细胞和两种染色合并后的图像。最右边的柱状图为通过所分析的每个细胞的像素统计分析(n=5，000)得出的像素柱状图，其中y轴表示的是细胞的数目，X轴表示的是Prxl和TLR4之间的相似系数。(B)图示为每个时间点所有细胞的平均相似系数；误差线表示标准差。图6. Prxl结合TLR4是结构依赖性。(A)从TLR4+/+(白色柱)或TLR4+巨噬细胞(实心柱)中分离得到TG诱出的巨噬细胞，然后分别与培养基(无添加)、200nM的Prxl、200nM的PrxlC52S或200nM的PrxlC83S培养24小时，收获上清液，分析TNF- α和IL-6的存在。⑶从TLR4+/+(白色柱)或TLR4+巨噬细胞(实心柱)中分离得到TG诱出的巨噬细胞，与2000nM的FITC标记的蛋白质共同培养20分钟，然后用流式细胞仪分析。通过去除7-AAD高表达的细胞群选取活细胞用于分析。结果经归ー化处理，以除去FITC标记中的差异，结果以每nM蛋白质中的MFI/FITC表示，误差线表示标准差。星号表示P彡O. 01。(C)TG诱出的巨噬细胞分别与各种浓度的FITC-BSA (正方形),Prxl (黒色圆圈)、PrxlC52S (灰色圆圈)和PrxlC83S(空心圆圈)共同培养20分钟，并用流式细胞仪分析。结果经归ー化处理，以除去FITC标记中的差异，结果以每nM蛋白质中的MFI/FITC表示。每条曲线代表三次独立试验。(D)将TG诱出的巨噬细胞与IOOOnM的Prxl共培养，清洗后与递增浓度的 如下竞争剂共培养0VA (正方形)、Prxl (黑色圆圈)、PrxlC52S (灰色圆圈)、PrxlC83S (空心圆圈)。结果以对于无竞争剂情况下FITC-Prxl的MFI百分比形式表示；误差线表示标准差。所有的实验都进行三次，综合后的结果如图所示。图7. Prxl刺激巨噬细胞依赖于MyD88并导致NF κ B的核易位。(A)包含对照(空心柱)或MyD88DN(实心柱)表达质粒的RAW264. 7巨噬细胞系的稳定感染子用IOOnM LPS或IOOOnM Prxl激发24小时，用ELISA分析得到的上清液中IL-6的表达。在三组独立实验中进行了 ELISA分析；误差线表示标准差。星号表示P值彡0.001。(B)从C3H/HeNCr (TLR4+/+)和C3H/HeNJ (TLR4+)小鼠中分离得到TG诱出的巨噬细胞，在完全培养基中用200nM Prxl激发。在指定的时间点，用FITC连接的抗NFk B p65抗体和DRAQ5(核染剂)染细胞10分钟，然后用安尼斯(Amnis)技术进行分析。最右边的柱形显示了基于NF κ B和核染色相似性的逐像素统计分析。(C)在每个时间点下，在C3H/HeNCr(实心圆圈)和C3H/HeNJ(空心圆圈)巨噬细胞中的的总体相似系数的平均数值；误差线代表标准差。(D)将TG诱出的巨噬细胞与特定浓度的Prxl共孵育I小吋。按照实施例I所述进行EMSA分析。图8.在PC-3M细胞中表达Prxl特异性shRNA导致Prxl的表达減少。(A)用凝胶电泳分离从表达对照(乱序)shRNA或Prxl特异性shRNA (shPrxl)的基因工程化PC-3M细胞(右图)中得到的细胞裂解物，用Prxl特异性抗体进行印迹和探測。⑶表达Prxl特异性shRNA导致Prxl水平的降低。收获表达对照shRNA (乱序)或Prxl特异性shRNA的基因工程化PC3-M细胞系，用蛋白质印迹分析Prxl或Prx2的表达。(C)Prxl激发的TG诱出巨噬细胞分泌IL-6依赖于CD14和MD2，其中CD14和MD2是TLR4的辅因子。从C57BL/6小鼠中分离得到TG诱出的巨噬细胞，在存在或不存在对照或者针对CD14或MD2的封闭抗体的情况下用LPS激发24小吋。收获上清液后用IL-6ELISA试剂盒分析。结果以pg/ml为単位，误差线代表标准差。图9提供了用于显示动物模型中Prxl抗肿瘤的佐剂效果的图示。发明描述本发明是基于以下意想不到的发现过氧化物氧化还原酶I (Prxl)是Toll样受体4(TLR4)的配体，并且Prxl的这种功能使得它能作为ー种佐剂。本发明提供增强个体中针对抗原的免疫反应的组合物及方法。该组合物包括分离的Prxl和抗原。Prxl的氨基酸序列及其DNA和RNA编码序列是本领域技术人员所熟知的。在一个实施方式中，分离的Prxl蛋白以十聚体的方式提供。这种分离的Prxl蛋白可包括191个氨基酸的序列或者由191个氨基酸的序列所组成，这种包括191个氨基酸的序列或由191个氨基酸的序列所组成的蛋白质具有过氧化物氧化还原酶的活性。在一个实施方式中，Prxl蛋白含有2009年8月23日登入的NCBI參考序列NP 859047. I所示的氨基酸序列，该序列通过引用納入本文。据信任何的剪接变体和/或Prxl异构体都可以用在本发明中。本发明的方法包括给予个体该组合物从而激发抗该抗原的免疫反应。这种激发的免疫反应可具有治疗或预防的效果，可包括细胞介导的反应和/或体液反应，或其组合。这样激发的免疫反应可强于用单独的抗原激发的免疫反应。Prxl是ー种在大多数细胞类型中都存在的抗氧化剂和伴侣蛋白分子，并由转化的 和活化的细胞分泌。TLR4是Toll样受体(TLR)家族的ー员。TLR与其配体的相互作用启动炎症介质(如促炎细胞因子)的释放以及启动免疫反应细胞的成熟/活化。炎症和免疫细胞的成熟/活化对于抗原特异性免疫(包括抗肿瘤免疫)的诱导都是必不可少的。在本领域中，能够触发炎症和免疫细胞成熟/活化的试剂被称为佐剂。在此，我们证明Prxl与负责诱导抗原特异的免疫反应的免疫细胞(例如树突状细胞和巨噬细胞)表面上表达的TLR4相互作用。我们还证明，Prxl和TLR4的相互作用导致产生树突状细胞和巨噬细胞的成熟/活化并导致分泌促炎细胞因子。因此，认为Prxl是免疫佐剂。重要的是，我们证实向抗肿瘤疫苗中添加Prxl增强了疫苗在动物中所起的效果。就此，用许多TLR激动剂来改善抗肿瘤免疫，包括TLR9激动剂CpG基序和TLR7激动剂咪喹莫特。CpG基序是包含未甲基化的胞嘧啶-鸟嘌呤和侧翼核苷酸的DNA寡脱氧核苷酸序列(ODN)，可以与TLR9相结合。咪喹莫特[1-(2-甲基丙基)-IH-咪唑并[4，5-c]喹啉-4胺；AlderaTM;R-837, S26308]是合成的TLR7激动剂，其可以诱导DCs28的成熟与迁移，IFN-a ,TNF- α、IL-I α、IL-6, IL-12和IL-8的表达，以及增强CD8+T细胞的活化。咪喹莫特已成功用于治疗基底细胞癌，最近的一项临床试验显示局部应用咪喹莫特可以有效清除O期的黑素瘤。这两种TLR激动剂都已列入美国国家癌症研究所(NCI)进ー步开发作为抗癌疫苗用佐剂的优先列表。Prxl显示很多与CpG和咪喹莫特相同的活性,然而,Prxl所结合的受体TLR4的表达比与CpG和咪喹莫特相作用的TLR更广泛。因此，Prxl有成为更有效的抗癌疫苗佐剂的潜力。预期本发明可以用于激发任何抗原所引起的免疫反应，因此，该抗原可以作为免疫源起作用。抗原包括但不限干蛋白质、多肽或肽抗原。这种抗原可能已被充分表征，或者可能还未知，除了已知或者怀疑存在于(例如)细胞裂解物内的抗原，所述细胞裂解物来自包含或者可能包含该抗原的特定的细胞种类或任何其它生物组织样品。在一个实施方式中，本发明激发引起的免疫反应所针对的抗原是肿瘤抗原。肿瘤抗原可以通过传统的技术得到，如通过反复冻融肿瘤细胞/组织来制备肿瘤细胞裂解物而获得所述肿瘤抗原，所述肿瘤细胞/组织获自新鲜的肿瘤活检组织或获自体外组织培养所产生的肿瘤细胞。该肿瘤细胞裂解物可以通过离心和收集上清液得到。该肿瘤细胞裂解物既可以立即使用，也可以冰冻储存备用。这种抗原可以以纯化的形式、部分纯化的形式或以细胞裂解物形式存在的未纯化形式使用。或者，可以通过重组DNA技术在众多表达系统中的任何ー种中表达该抗原。因此，本领域技术人员应认识到可提供分离的Prxl蛋白以用于本发明中，从而使得个别的(discreet)、分离的Prxl蛋白与ー种或多种不同的抗原复合。这样的复合物可以在各种条件下形成，如改变Prxl/抗原的比例，使用不同的缓冲液、孵育时间以及温度。在一个实施方式中，Prxl蛋白和抗原在本发明的组合物中以复合物的形式存在，可以彼此共价或者非共价地连接。例如，Prxl蛋白及抗原可能通过化学键相互连接，如通过共价键、离子键、氢键和/或范德华键，或上述键的组合。形成含或不含共价键的蛋白质/抗原复合物的方法在本领域是已知的，并且这些方法可以用于形成分离的Prxl蛋白和一种或多种抗原的复合物。本发明中的复合物可包含分离的Prxl蛋白和抗原，或基本由Prxl蛋白和抗原所组成，或由分离的Prxl蛋白和抗原所组成。“分离的”指Prxl蛋白与其天然存在的环境相分离。分离的蛋白质不一定是纯化的蛋白质。然而，为用于本发明，分离的Prxl蛋白仍然可纯化到任何需要的纯度。分离的Prxl蛋白包括通过重组的方法得到的Prxl蛋 白。根据本发明，Prxl多聚体，如十聚体，也被认为是分离的Prxl蛋白。此外，分离的Prxl蛋白还包括与抗原通过肽键相连的Prxl蛋白，例如在融合蛋白中。简而言之，为了产生这样的融合蛋白，可使用传统的技术构建编码Prxl蛋白和该抗原的DNA序列，并用任何适合的表达载体在适宜的细胞类型中表达。如此，这种融合蛋白即能在细胞内表达，且可使用任何本领域技术人员熟知的方法分离得到这种融合蛋白。在一个实施方式中，Prxl/抗原的融合蛋白可以由接头序列间隔开。本发明中适合给予个体的组合物可以通过以下方法制备将分离的Prxl蛋白和/或抗原与任何合适的药学上可接受的载体、赋形剂和/或稳定剂混合。可在下列文献中找到一些适用于混合试剂的组合物的例子Remington:The Science and Practice ofPharmacy (《雷明登药物科学与实践》)(2005)，第21版，宾夕法尼亚州费城，利平科特 威廉斯·威尔金斯出版公司(Lippincott Williams & Wilkins)。在一个实施方式中，根据本发明中的方法激发免疫反应的个体是有风险发生、被怀疑患有或已经诊断患有癌症的个体。因此，在各种实施方式中，与Prxl蛋白联用的抗原是在任ー种癌细胞中表达的抗原，具体的例子包括但不限干纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肉瘤、软骨肉瘤、成骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、腹膜假性粘液瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因氏肿瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状上皮细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌，支气管癌、肾细胞癌、肝癌、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎性癌、肾母细胞瘤、子宫颈癌、睾丸肿瘤、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神经胶质瘤、星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、少突胶质瘤、脑脊膜瘤、黑素瘤、成神经细胞瘤、视网膜成神经细胞瘤、白血病、淋巴瘤、多发性骨髓瘤、瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症和重链病。在一个实施方式中，个体具有带传染源的风险，或者疑似带有传染源，或者已被诊断带有传染源。因此，在多种实施方式中，用于本发明中的抗原可以是由传染源所表达的那些抗原。此类传染源的例子包括但不限干病毒、细菌、真菌和其它寄生生物。病毒的例子包括但不限于こ型肝炎或丙型肝炎病毒、流感病毒、水痘病毒(vaticella)、腺病毒、I型或II型单纯疱疹病毒、牛瘟病毒、鼻病毒、艾柯病毒、轮状病毒、呼吸道合胞体病毒、乳头瘤病毒、乳多空病毒、细胞巨化病毒、棘状病毒、虫媒病毒、汉坦病毒、柯萨奇病毒、腮腺炎病毒、麻疹病毒、风疹病毒、骨髓灰质炎病毒、人I型或II型免疫缺陷病毒。细菌的例子包括但不限干结核分枝杆菌、分枝杆菌、支原体、奈瑟氏菌和军团杆菌。其它寄生生物的例子包括但不限于立克次体和衣原体。本发明的组合物可以通过任何适宜的给药途径给药。一些非限制性的例子包括ロ服、胃肠道外给药、皮下给药、腹膜内给药、肺内和鼻内给药。胃肠外输注包括肌肉内、静脉内、动脉内、腹膜内和皮下给药。本发明的组合物的给药可以和g在治疗抗原相关的疾病或紊乱的常规治疗联合进行。例如，组合物可在常规抗癌治疗之前、同时或之后给予。这些治疗包括但不限于化疗、手术干预和放疗。 总体而言，适宜的剂量和治疗方案提供有效量的该组合物以激发免疫反应，从而提供治疗或者预防益处。这种反应可以通过临床结果的改善监测到，如抑制肿瘤的生长和/或转移、增强对感染的抵抗力、促进免疫细胞的活化、和/或对于本领域技术人员而言显而易见的其它參数，取决于所治疗病状。在此公开的治疗用组合物的给药途径、频率及剂量在不同个体之间各不相同，但使用标准的技术可以很方便的确定。在一个实施方式中，本发明提供一种组合物，其包含分离的抗原呈递细胞(APC)群和包含分离的Prxl和抗原的复合物。Prxl/抗原复合物可以被用于致敏APC，如树突状细胞。给予个体经致敏APC可以获得增强的免疫反应。因此，包含分离的APC群和复合物(所述复合物包含分离的PrxI蛋白和抗原)的组合物中细胞的全部、基本全部、或者部分是树突状细胞。据此，组合物中的细胞可以100%是树突状细胞，也可以10%-100%(包括之间所有的整数)是树突状细胞。在一个实施方式中，给予个体包含分离的APC群和复合物(所述复合物包含分离的Prxl蛋白和抗原)的组合物以在该个体中激发预防性或治疗性免疫反应。给予个体的APC可以是异基因的或同基因的。以下实施例是为了说明而非限制本发明。实施例I本实施例提供了实施本发明中使用的材料和方法的描述。材料脂多糖(LPS,大肠杆菌(Escherichia coli)血清型026:B6)多粘菌素B硫酸盐、牛血清白蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)购自西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich，密苏里州圣路易斯)。7-氨基-放线菌素D(7-AAD)和硫代こ醇酸盐布氏改良培养基购自BD公司(加利福尼亚州拉霍亚)(Becton Dickinson, La Jolla, CA)。Luminex分析系统中所使用的用于捕获和检测IL-6和TNF-α的抗体、以及蛋白质标准品购自英杰公司(加利福尼亚州卡尔斯巴德)(Invitrogen, Carlsbad, CA)。Q)llb、Gr-1> F4/80及所有的同种型的特异性抗体购自法明基公司(加利福尼亚州山景城)(PharMingen, Mountain View, CA) 抗TLR2、TLR4和NF κ B亚基的抗体购自圣克鲁斯生物技术公司(加利福尼亚州圣克鲁斯)(SantaCruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) 抗MD2和0)14的封闭抗体购自圣克鲁斯生物技术公司。藻红蛋白(PE)连接的抗TLR4抗体,购自易生物科学公司(eBioscience,加利福尼亚州圣地亚哥)。抗Prxl的特异性抗体购自实验室前沿公司(Lab Frontier,首尔,韩国)；这种抗体为Prxl特异性，在表达Prxl的细胞的蛋白质印迹分析中只检测一条条带(图8A)。动物和细胞 系C57BL/6NCr (TLR4+/+ 和 TLR2+/+)、C57BL/10ScNJ (TLR4+)、Β6· 129-Tlr2tmlKir/J(TLR2+)、C3H/HeNCr (TLR4+/+)和C3H/HeNJ(TLR4+)无病原体小鼠，购自美国杰克逊实验室(The Jackson Laboratory,緬因州巴港)。动物饲养在置于层流柜中的微小_离饲育盒中，暴露在环境光下。小鼠饲养在罗斯维尔帕克癌症研究所(Roswell Park CancerInstitute，美国纽约州布法罗)的无病原实验室中。动物的护理和实验均得到动物护理和使用委员会(The Institutional Animal Care and Use Committee)的批准。Prxl在体内的作用通过向C57BL/6NCr或C57BL/10ScNJ小鼠静脉注射90ugPrxl (大约为IOOOnM)来測定。两小时后进行心脏穿刺。如下获得血清将血液在4°C下孵育过夜，然后离心样品，收集上清液。培养的小鼠巨噬细胞系(RAW264. 7)于37° C和5. 0%的CO2条件下培养于达尔伯克氏改良伊格尔培养基(DMEM)中，该培养基包含10%的特级胎牛血清和100U/ml的青霉素以及100ug/ml的链霉素。RAW264. 7细胞转染了 pcDNA3. I质粒，该质粒包含对照或者包含编码MyD88显性阴性突变体(MyD88dominant negative, DN)的寡核苷酸,根据制造商的实验设计，用FuGENE 6(英杰公司，加利福尼亚州卡尔斯巴德)进行转染。然后使用G418筛选转染细胞中表达对照或MyD88DN的细胞。然后分别用缓冲液、Prxl或LPS发激细胞24小吋，培养基收获后通过ELISA分析IL-6细胞因子。在肺癌细胞系(A549)中用于产生Prxl敲减的逆转录病毒感染过程和逆转录病毒短发夹RNA表达构建体是本领域技术人员已知的。(Kim等，(2007)CancerRes. 67:546-554 ；Park 等，Cancer Res. (2007) 67 :9294-9303 ; Park 等，2006. CancerRes. 66:5121-5129，其内容通过引用纳入本文。分离巨噬细胞和树突状细胞小鼠腹腔诱出的巨噬细胞是通过腹腔内注射I. O毫升3. 0%(w/v)的硫代こ醇酸盐培养基(TG)得到的。注射后四天，处死小鼠，灌洗腹腔收集巨噬细胞。巨噬细胞在完全培养基(DMEM培养基添加10%的特级FBS和100U/ml的青霉素以及100ug/ml的链霉素)中培养I小时通过贴壁筛选得到富集，然后通过FACS分析法用标准技术鉴定⑶llb、Grl以及F4/80的表达。⑶llb+GrrF4/80+型的细胞确认为巨噬细胞。使用标准技术在GM-CSF中培养骨髓来源的细胞从而产生未成熟的骨髄来源的树突状细胞。表达CDllc的细胞确认为树突状细胞。蛋白质纯化重组人Prxl、PrxlC52S和PrxlC83S蛋白的纯化方法如前所述(Kim等，2006.Cancer Res. 66:7136-7142;Lee 等，2007. J. Biol. Chem. 282:22011-22022，其各自掲示的内容通过引用納入本文)。简而言之，将包含有重组蛋白的细菌细胞提取物上样至DEAE琼脂糖凝胶(GE健康护理公司，GE Healthcare，美国)，经pH 7. 5的20mM Tris-Cl平衡。蛋白质经PH6. 5的50mM磷酸钠缓冲液(包含0. IM NaCl)透析。收集获自DEAE柱的含Prxl、PrxlC52S或PrxlC83S的未结合蛋白，合并且上样至Superdex 200 ((16/60，GE健康护理公司，美国)，经ρΗ7· O的50mM的磷酸钠缓冲液(包含O. IM NaCl)平衡。含有Prxl、PrxlC52S或PrxlC83S的部分收集后保存在-80摄氏度。根据制造商的指示，使用内毒素當试剂测定法(Limulus Amebocyte Lysate Assay)(龙沙公司，Lonza,马里兰州,沃克斯维尔)定量纯化蛋白中内毒素的水平。测定后发现，Prxl、PrxlC52S和PrxlC83S中分别含有14. 14±O. 050EU/ml、14. 07±O. 67EU/ml 和 14. 17±O. 025EU/ml。细胞因子分析贴壁的TG诱出的巨噬细胞经PBS清洗5至10次，以除去任何非贴壁的细胞。一经清洗后，即加入含有特定浓度的纯化的Prxl、PrxlC52S、PrxlC83S或LPS的完全培养基，其中存在或不存在Prxl、MD-2和CD14的封闭或对照抗体。在指定的实验中，添加前将Prxl蛋白或LPS与多粘菌素B共同孵育或者先煮沸20分钟。24小时后收集上清液，通过细胞因子特异的ELISA或Luminex多重分析系统进行分析。血清样品依如上所述的方法收集并使用ELISA测定IL-6的水平。TNF- α和IL-6ELISA试剂盒购于BD生物科学事业部(美国新 泽西州富兰克林湖市)(BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ),测试依照制造商的说明书完成。Luminex 分析在研究所流式细胞实验室(Institute Flow Cytometry Facility)完成，使用具有PVDF膜的96孔微量滴定板(多筛选HV板，Multiscreen HV plates)(密理博公司，Millipore,美国马萨诸塞州，比莱瑞卡)，以帝肯基因西斯液体操作机器人(TecanGenesis liquid handling robot,三角研究园(Research Triangle Park),北卡罗来纳州)完成所有的稀释、试剂添加以及微量滴定板的操作。包被有捕获抗体的微珠组被测试稀释剂稀释，收集，往每孔中加入各组的约1000枚微珠。从9000到I. 4pg/ml的重组蛋白质标准品使用稀释剂用3倍稀释法进行滴定。将样品和标准品添加至含有珠子的孔中。将平板置于摇床上在环境温度下孵育120分钟，然后以多歧真空抽滤盒抽吸用稀释剂清洗两次。然后添加抗各种细胞因子的生物素化测试抗体，孵育平板60分钟，并照之前所述的方法进行清洗。最后，向每个孔中添加PE连接的链霉亲和素，孵育平板30分钟并进行清洗。珠子在100 μ I的清洗缓冲液中重新悬浮,在Luminex 100系统(路明克斯公司(LuminexCorp.)，得克萨斯州，奥斯汀)上进行分析。每个样品都测试两次，且从所有读数中减去空白值。采用读珠(BeadView)软件(密理博)，依据珠子的MFI值对重组蛋白标准品的浓度计算出对数回归曲线。将偏离最佳拟合曲线的点，即低于测试极限或超过饱和度的点，从曲线中剔除。样品中的细胞因子的浓度通过将它们的珠子的平均荧光强度内插至所得最佳拟合曲线中计算得到。值超过测试极限的样品稀释后重新測定。用FITC标记蛋白质将BSA、Prxl、PrxlC52S和PrxlC83S蛋白通过FITC连接试剂盒(西格玛公司，密苏里州，圣路易斯)连接至FITC上。将20倍过量的FITC和単独蛋白质溶解至0. IM的碳酸氢钠/碳酸钠缓冲液(pH调至9.0)中；混合物在室温下温和摇动孵育2小吋。过量的游离FITC用Sephadex G-25凝胶柱(法玛西亚公司(Pharmacia),新泽西州，皮斯卡塔维)移除。蛋白质的量通过标准的Lowry检测法定量。F:P (荧光強度蛋白质)比根据制造商的说明书进行计算，FITC吸收率和蛋白质的吸收率分别为在495nm和280nm下的光学密度。BSA、PrxU PrxlC52S 和 PrxlC83S 的每 nM 蛋白质的 FITC 值分别为 31. 00± I. 92,38. 52±2· 39、74. 49±2· 64 和 44. 44±2· 64。饱和度分析FITC 连接的 BSA、Prxl、PrxlC52S 和 PrxlC83S 用含 I. 0% 的 BSA 的 PBS 稀释至特定浓度，反应的总体积为100 μし这些混合物与I. OX IO6个细胞/mL (的细胞)于冰上孵育20分钟，以防止内化。细胞用含1%BSA的PBS清洗两次，并进行孵育以显示相对于带有7-AAD的无活力细胞的存活性，然后在少于30分钟内用FACsCalibur检测。数据从至少20，000例细胞中得到，以并排列表(collateral list)模式储存，并用WinList处理程序(VSH公司(Verity Software House, Inc.),緬因州特普杉,Topsham)分析。7-AAD 阳性(无活力)的细胞被排除出事件外。FITC-连接的BSA被用于作为阴性结合对照，对于突变研究，FITC标记中的变化以每nM蛋白质中的FITC的标记归一化。竞争试验 将未标记的OVA、Prxl、PrxlC52S和PrxlC83S与和FITC相连的Prxl以特定浓度在100 μ I含I. 0%BSA的PBS中短暂混合。该混合物在冰上孵育20分钟，然后用含I. 0%BSA的PBS清洗两次。接着，将细胞与7-AAD共孵育，在30分钟内用流式细胞仪检测。在所有的竞争试验中，OVA都用作阴性竞争对照。数据从至少20，000例细胞中得到，以并排列表模式储存，并用WinList处理程序(VSH公司，緬因州特普杉)分析。当使用WinList分析结果时，7-AAD阳性的细胞被排除出事件外。免疫沉淀取500 μ g细胞裂解物和4 μ g抗TLR4或抗TLR2在4摄氏度培养过夜进行免疫沉淀。添加25 μ L的蛋白G琼脂糖(圣克鲁斯生物技术公司)后，将裂解物继续孵育4小吋。为了验证有特异性蛋白质相互作用，使用山羊IgG(圣克鲁斯生物技术公司)或小鼠IgG(圣克鲁斯生物技术公司)作为阴性对照。珠子用裂解缓冲液清洗三次，用SDS-PAGE分离，用Prxl特异性的抗体进行免疫印迹。使用ECL系统(伯乐公司(Biorad))检测蛋白质。Prxl/TLR4的共定位及NF κ B的易位如下进行共定位实验将200nM FITC标记的Prxl和PE连接的抗TLR4加入含有TG诱出的巨噬细胞的培养基中，置于37摄氏度下，孵育指定的时间，然后转移至冰上，固定并分析。免疫染色检测NF κ B核易位的方法如下。来源于C3H/HeNCr (TLR4+/+)和C3H/HeNJCTLIM+)小鼠的TG诱出的巨噬细胞经200nM Prxl处理。在37。C下孵育指定时间后，将细胞刮下并收集至试管中，用清洗缓冲液(含2%FBS的磷酸盐缓冲盐水)清洗两遍，然后在常温下的固定缓冲液(含4%多聚甲醛的磷酸盐缓冲盐水)中固定10分钟。清洗后，细胞用含10 μ g/ml抗NF B p65抗体(圣克鲁斯生物技术公司)的Perm洗涤缓冲液(含0.1%曲通X-100、3%FBS、0. 1%叠氮化钠的磷酸盐缓冲盐水)于室温下重新悬浮20分钟。细胞再用Perm洗涤缓冲液进行清洗，并在室温下于含7. 5 μ g/ml FITC接合的F(ab)2驴抗兔IgG的Perm洗漆缓冲液中重新悬浮15分钟。细胞再用Perm洗漆缓冲液清洗两次,于室温下在含5μΜ DRAQ5核染剂(生物态公司，BioStatus)的1%的多聚甲醛中重新悬浮5分钟。图像分析用ImageStream 多光谱成像流式细胞仪(安尼斯公司，华盛顿州西雅图)(AmnisCorp. , Seattle, WA)分析Prxl和TLR4的共定位和NF- κ B的核转位。在姆种试验条件下，至少获得5000次事件,用IDEAS 软件包分析相应的图片。采用层级门控(hierarchicalgating)策略，使用基于图像的物体对比度(梯度RMS)特征和面积对长宽比筛选在焦点中的单个细胞。分别使用Prxl和TLR4图像或NF κ B和DRAQ5图像的IDEAS*相似性特征测定各单独细胞中的共定位和核易位，该相似性特征是对全细胞中空间相关像素強度的对数转换的皮尔森相关系数。相似性得分是两张图像线性相关的程度的量度。电泳迁移率变动分析(EMSA)使用传统技术进行EMSA。简而言之,将10 μ g的核蛋白与Y-32P标记的双链NF κ B寡核苷酸共孵育于 20 μ L含 IOmM HEPES (pH 7. 9)、80mM NaCl、10%甘油、ImM DTTUmM EDTA、100yg/mL聚(脱氧肌核酸一脱氧胞苷酸)的结合溶液中。DNA-蛋白质复合物在200V，4° C，非变性条件下在6%聚丙烯酰胺凝胶中解析2小吋。凝胶干燥后进行放射自显影。统计学分析 为比较各实验组，采用带,尔奇校正(Welch’s correction)的标准化T测试进行统计分析，其中不假设方差相等。P值小于等于O. 05时认为差异有显著性。实施例2本实施例提供对由实施例I中所描述的材料与方法所得结果的描述。Prxl激发DC和TG-巨噬细胞分泌细胞因子以及Prxl激发DC的成熟依赖于TLR4硫代こ醇酸盐(TG)诱出的小鼠巨噬细胞用于评估Prxl激发细胞因子分泌的能力。通过分析腹腔渗出液细胞群的⑶llb、Grl和F4/80的表达鉴定巨噬细胞的表型。分离的细胞群中大于99%为^11ビ，在这些^11ド细胞群中大多数为61*1_、？4/80+(

图1A)。用Prxl激发TG诱出的巨噬细胞导致该细胞剂量依赖地分泌TNF- α和IL-6，其分泌显著高于所有浓度未激发细胞的分泌(P <0.01;图IB)。Prxl与内毒素的灭活剂多粘菌素B—起预孵育对Prxl激发细胞因子的分泌没有显著影响(图1C);相反，Prxl的变性显著降低其激发细胞因子分泌的能力(Ρ〈0·01)。在无血清的条件下，与Prxl共孵育后对TG诱出的巨噬细胞分泌细胞因子的激发显著降低(P彡0.01;图1D);然而，即使在无血清的条件下，将Prxl与TG诱出的巨噬细胞共孵育也能显著增高IL-6的分泌(P ^ O. 005，与在无血清培养基中培养的细胞的分泌相比)。Prxl同样能够激发培养的树突状细胞系DCl. 2和鼠巨噬细胞系RAW264. 7分泌细胞因子(数据未显示)。外源性的Prxl可以诱导未成熟的骨髓来源的树突状细胞(iBMDC)的成熟与活化。将iBMDC与浓度递增的Prxl共培养24小时，检测细胞表面共刺激分子的表达和TNF-α的分泌。在所有测试剂量下，添加Prxl导致细胞表面共刺激分子CD86的表达(图2Α)和TNF-α的分泌(图2Β)呈显著的剂量依赖性增加(与对照相比P彡O. 01)。添加外源重组Prxl增强iBMDC和TG诱出的巨噬细胞分泌细胞因子可能是重组蛋白的现象，而无生理相关性。为了开始检测Prxl是否能在生理条件下促进细胞因子的分泌，将TG诱出的巨噬细胞与收集自分泌Prxl的肿瘤细胞上清液或收集自表达Prxl特异性shRNA的基因工程化肿瘤细胞上清液共培养24小时。shRNA的表达导致Prxl而非Prx2的表达降低(图8B)。将TG诱出的巨噬细胞与表达非特异性shRNA的基因工程化肿瘤细胞的上清液共培养将导致TNF-α表达的增强(Sc，图2C;P彡O. 0001，与培养基组相比)。相反，将TG诱出的巨噬细胞与收集自Prxl表达水平降低的肿瘤细胞的上清液共培养使得分泌的TNF-α水平显著降低(P彡O. 0001，与收获自表达对照shRNA的细胞的上清液组相比；图2C);向这些上清液中添加外源性的Prxl恢复TG诱出的巨噬细胞的TNF-α分泌(shPrxl+Prxl;P ( O. 003，与收获自表达Prxl特异性shRNA的细胞的上清液组相比)。为了检测Prxl激活iBMDC和TG诱出的巨噬细胞是否依赖于TLR4，从C57BL/6NCr (TLR4+/+)和 C57BL/10ScNJ(TLR4+)小鼠中分离得到 iBMDC 和 TG 诱出的巨噬细胞，用Prxl、LPS或Pam3Cys ( ー种TLR2激动剂)激发。结果提示Prxl、LPS和Pam3Cys激发从C57BL/6NCr小鼠中分离得到的iBMDC(图3A)和巨噬细胞(图3B)分泌细胞因子，但只有Pam3Cys激发从C57BL/10ScNJ小鼠中分离得到的iBMDC和巨噬细胞分泌细胞因子(P彡O. 01，与从C57BL/NCr小鼠中分离得到的细胞所分泌的细胞因子相比)。通过向C57BL/6NCr (TLR4+/+)或 C57BL/10ScNJ (TLR4+)小鼠腹腔注射重组 Prxl 来检测Prxl诱导体内TLR4依赖性炎症的能力。注射后2小时采集血样，通过检测全身IL-6的水平评估全身性炎症的程度(图3C)。注射Prxl导致C57BL/6NCr(TLR4+/+)小鼠的全身性IL-6水平显著升高(P彡O. 0002)，但对C57BL/10ScNJ (TLR4+)小鼠的全身性IL-6水平 并没有显著影响。在无血清条件下，TG诱出的巨噬细胞与Prxl共培养后细胞因子表达减少(图1D)，这提示血清蛋白可能有助于Prxl/TLR4的最优化相互作用。很多的TLR4配体与TLR4相互作用时是作为ー个更大的复合物的一部分，其可包括⑶14和/或MD2。为了測定Prxl增强TG诱出的巨噬细胞分泌细胞因子是否涉及⑶14或MD2，在针对MD2、⑶14或对照IgG的封闭抗体存在的情况下，将细胞与Prxl或LPS共培养(图4A)。与存在对照IgG时Prxl所诱导的相比，添加针对Prxl、⑶14或MD2的封闭抗体显著抑制Prxl激发TG诱出的巨噬细胞分泌IL-6的能力(P彡O. 01)。针对⑶14和MD2的封闭抗体也阻断LPS激发的细胞分泌细胞因子(图8C)。为了进一步证实Prxl和TLR4/MD2/⑶14之间的相互作用，将TG诱出的巨噬细胞的裂解物与同种型的对照抗体或者TLR4或TLR2特异的抗体共培养(图4B)。分离抗体复合物，用Prxl抗体进行免疫印迹；仅在用TLR4免疫沉淀的裂解物中发现Prxl (图4B)。Prxl处理过的细胞中分离得到的TLR4/Prxl复合物也包含CD14和MD2 (图4C)，确证了 Prxl与包含⑶14和MD2的复合物中的TLR4相互作用的这ー发现。使用成像流分析(imagestream analysis,安尼斯(Amnis))确定 Prxl 与 TLR4 相互作用的动力学，检测这两种分子的共定位。将TG诱出的巨噬细胞与FITC标记的Prxl和PE连接的抗TLR4抗体共培养。代表性的细胞的合并图像表明Prxl和TLR4在5分钟内共定位到巨噬细胞的膜上，30分钟时TLR4和部分Prxl分子已内化(图5A)。合并图像右边的柱状图是在逐像素基础上，在5000例细胞上得到的FITC-Prxl和PE-抗-TLR4的相似性的统计分析。该分布右移说明有更大程度的相似性。每个时间点平均的相似系数显示于图5B中。在每个时间点上，Prxl和TLR4的染色都有高度的相似性(相似系数>1)，表明Prxl和TLR4共定位。这些结果证实Prxl和TLR4在细胞表面相互作用，并且至少部分Prxl随TLR4内化。激发细胞因子的分泌以及与TLR4结合依赖于Prxl的结构Prxl既是过氧化物酶，也是蛋白质伴侣蛋白(Wood等(2003) Trends Biochem.Sci. 28:32-40)。为检验Prxl激发TG诱出的巨噬细胞分泌细胞因子的能力是否与其过氧化物酶的活性和/或伴侶蛋白的活性有夫，检测两种Prxl突变体。PrxlC52S突变体缺乏过氧化物酶的活性，但保留伴侶蛋白活性所需的十聚体结构；PrxlC83S主要以ニ聚体的形式存在，其伴侶蛋白的活性降低但保留完整的过氧化物酶活性。PrxlC52S激发TG诱出的巨噬细胞后的细胞因子分泌与用Prxl激发后观察到的结果没有显著差异(图6A);然而，PrxlC83S激发的TG诱出的巨噬细胞的细胞因子分泌显著降低(P ( O. 01)。Prxl结合TG诱出的巨噬细胞依赖于TLR4的存在，因为在TLR4不存在的情况下，Prxl和无酶活性突变体(PrxlC52S)的结合显著降低(图6B)。PrxlC83S的结合无论在TLR4表达还是不表达的巨噬细胞上都是最小的，确证Prxl与TLR4的相互作用是非过氧化物酶依赖性的，但却是结构依赖性的。采用饱和结合实验(图6C)和竞争分析(图6D)测定Prxl结合到TG诱出的巨噬细胞表面的Kd与Ki值。Prxl结合到TG诱出的巨噬细胞的Kd值为1.6禮，1值为4. ImM (表I)。
Prxl激发细胞因子的分泌依赖于MyD88，并导致TLR4依赖的NF κ B的核易位配体介导的TLR4活化的后续下游信号传导事件可能是MyD88依赖性或非MyD88依赖性的。用Prxl激发RAW264. 7细胞表达细胞因子，该细胞表达显性阴性突变(DN)的MyD88蛋白。Prxl激发后的IL-6分泌依赖于MyD88的功能(图7A)，表明Prxl激活了 MyD88信号传导级联，该级联导致NF κ B的激活。为测定PrXI /TLR4的相互作用是否导致了 NF κ B的激活，分析从C3H/HeNCr和C3H/HeNJ小鼠中分离得到的巨噬细胞中Prxl激发后的NF κ B核易位。C3H/HeNJ小鼠的TLR4配体结合域中存在阻止配体结合的突变。将从C3H/HeNCr和C3H/HeNJ小鼠中得到的TG诱出的巨噬细胞在37 ° C下与200nM的PrxI共孵育指定的时间，转移至冰上，与抗NF κ Bρ65的抗体共孵育；在用图像流分析前15分钟加入核染剂DRAQ5。Prxl在与从C3H/HeNCr小鼠中分离得到的巨噬细胞共培养的5分钟内即可触发NF κ B的易位，并且核定位直至60分钟依然显著(图7B)。相反，Prxl与从C3H/HeNJ小鼠中分离得到的巨噬细胞共培养并不触发NF κ B的易位(图7B)。合并图像右边的柱状图显示以逐像素为基础的NF κ B与核染剂的相似性。Prxl激发导致NF κ B以TLR4依赖性方式易位至核，这已通过用Prxl激发C3H/H3NCr的TG诱出的巨噬细胞后所观察到的正相似系数所证实，而用Prxl激发C3H/HeNJ的TG诱出的巨噬细胞后该相似系数降低(图7C)。用EMSA法确证Prxl激活NF- κ B的能力，该法表明将巨噬细胞与Prxl共孵育导致NF κ B DNA结合活性呈现剂量依赖式的升高(图7D)。本领域的技术人员会认识到前述的结果强有力地证明Prxl激发TG诱出的巨噬细胞和DC的TLR4依赖性TNF- α和IL-6分泌。细胞因子的分泌是TLR4激发MyD88依赖性信号传导级联的结果，并导致NF κ B的激活和易位。Prxl是ー种由肿瘤细胞和活化的T细胞所分泌的胞内蛋白。Prxl和TLR4相互作用并激发促炎细胞因子释放的能力提示它还可能作为内源性的损伤相关分子模式分子(DAMP)。HSP72和HMGBl都被归入内源性DAMP，这两者均被显示与TLR4相互作用。饱和与竞争性研究表明Prxl的Kd大约为I. SmMjKi大约为4. ImM ;由Binder等(Binder等，2000.J. Immunol. 165:2582-2587)提供的数据外推提示HSP72的Kd值介于2. 1-4. 4禮，1值介于10-21.8mM，这表明与HSP72相比，Prxl与TLR4有更强的相互作用。HMGBl的结合亲和力尚不可得。TLR4鉴定为重组蛋白受体可能因重组蛋白制品中可能存在的LPS而变得复杂。为解释在此呈现的结果中的这种可能性，在所有进行过的实验中都包括两组对照。在第一组对照中，在加至免疫细胞之前，重组蛋白先与多粘菌素B混合。多粘菌素B是ー种强效的LPS的灭活剂；重组的Prxl与多粘菌素B的预孵育对Prxl激发细胞因子表达的能力没有影响(图I)。然而，将LPS与相同浓度的多粘菌素B预孵育后显著抑制LPS激发细胞因子释放的能力。作为第二组对照，在加至免疫细胞之前，将Prxl和LPS煮沸，变性的Prxl显著抑制其激发细胞因子释放的能力，但煮沸对LPS激发细胞因子释放的能力没有影响。最后，本研究中用到的所有重组蛋白均以同样制备方式得到，并且纯化后都发现包含相同水平的内毒素(大约为14EU/ml)，尽管如此，PrxlC83S激发所分泌的细胞因子量显著要低，且看来不与表达TLR4的细胞结合。因此，结果似乎证明Prxl与TLR4的相互作用与LPS污染的存在无关。Prxl、HSP72和HMGBl没有显示显著的结构相似性，这些分子与LPS也并没有显示出同源性。Prxl、HSP72和HMGBl都是分子伴侣蛋白，并且HSP72/HMGB1和其它TLR4配 体之间不存在结构同源性，使得有人推測TLR4识别的不是伴侶蛋白本身而是伴侶蛋白运载物(cargo)。支持该假设的有最近的研究表明HMGBl结合至TLR9是TLR9识别HMGBl/DNA复合物的結果。胞外Prxl以十聚体的形式存在，该十聚体与Prxl的伴侣蛋白活性相关(Wood等，2002. Biochemistry 41:5493-5504，其内容通过引用納入本文)，而我们的研究表明Prxl与TLR4的结合依赖于它形成十聚体的能力(图3和图4B)。因此，Prxl与TLR4的结合可能是由于对运载物而不是Prxl本身的识别。尽管如此，预期本发明所述干扰Prxl结合TLR4的试剂会抑制血管发生。PrxlC83S突变体缺乏伴侣蛋白的活性，且主要以ニ聚体的形式存在(Wood等，2002. Biochemistry 41:5493-5504)，看来不结合TLR4 (图4B);然而，这种纯化的突变蛋白能激发巨噬细胞分泌细胞因子(图4A)。惯例上，生物功能的检测要比结合测试更敏感，因此ニ聚体形式的Prxl和TLR4的相互作用可能低于这些研究中所用的结合测试所能检测到的水平。一小部分的PrxlC83S以四聚体的形式存在，这种四聚体也可能可以和TLR4相互作用，其水平低于可检测到的水平，但足以激发细胞因子的分泌。Prxl激发细胞因子的分泌依赖于TLR4和MyD88(图3、图4和图5);然而，FITC标记的Prxl确实有结合到从TLR4+(B10SCNJ)小鼠中分离到的巨噬细胞上(图4B)，尽管结合水平低于结合到从TLR4+/+(B6)小鼠中分离到的巨噬细胞上的水平。对Prxl和TLR4在细胞水平上的相互作用的检测显示尽管大多数的TLR4在Prxl结合后均被内化，至少有部分Prxl依然留在细胞表面上(图3B/C)。这些发现可能是由于Prxl过量所致或者Prxl结合其它受体的結果。其它与TLR4结合的DAMP已显示与多种危险受体相结合，并且在一些情况下，DAMP与TLR4的结合需要辅助受体。PbA是Prxl的疟疾同源物，其需要MD2来与TLR4相结合；我们的研究表明，Prxl在有血清存在的情况下能最好地激发细胞因子的分泌，并且⑶14和MD2的抗体能阻断受Prxl激发细胞分泌细胞因子。另外，TLR4和Prxl的免疫沉淀复合物中包含有MD2与⑶14，提示这些蛋白质有助于Prxl结合TLR4。实施例3我们测试了使用Prxl作为抗肿瘤疫苗的佐剂的效力。结果显示于图9中，证明Prxl增强抗肿瘤疫苗的效力。为得到图9所示数据，对无处理小鼠用全细胞肿瘤裂解物进行单独接种或者用全细胞肿瘤裂解物与20nM重组Prxl的混合物进行接种。休息一周后,通过注射活的肿瘤细胞攻击小鼠。监测肿瘤生长60天；姆组10只小鼠。如图9所示，Prxl激发抗肿瘤疫苗抵御结肠26(Colon 26)肿瘤的效 力，该肿瘤是在小鼠中使用结肠26鼠结肠癌细胞诱发的。


本发明提供用于激发针对抗原的免疫反应的组合物和方法。该组合物包括抗原和分离的Prx1蛋白，该抗原激发所需要的免疫反应。Prx1蛋白作为佐剂起作用以使这种包含抗原与Prx1的组合物激发的对该抗原的免疫反应强于仅用该抗原激发的免疫反应。