专利名称：嗜酸乳杆菌及其应用与饲料添加剂和预混料的制作方法在动物的肠道内栖息着各种细菌，根据与宿主的作用关系可分为有益菌、中性菌和致病菌。在健康动物的肠道内，各种菌群维持一个相对稳定的状态，但是当某些环境改变时，肠道内的致病菌会大量繁殖并同时产生细菌毒素，引起动物疾病，如细菌性痢疾等。嗜酸乳杆菌(LactcAacillus acidophilus)是动物肠道的常驻菌群之一，其能够在胃液中存在并分泌乳酸、乙酸等促进胃部的消化能力；另外，嗜酸乳杆菌能够调整肠道菌群平衡，抑制肠道不良微生物的增殖，嗜酸乳杆菌能分泌抗生物素类物质(嗜酸乳菌素 (acidolin)、嗜酸杆菌素(acidophilin)、乳酸菌素(laetocidon))，对肠道致病菌产生拮抗作用。但由于目前动物饲养过程中长期、大量使用抗生素，使致病菌耐药性增强、动物肠道菌群失调、免疫力下降。
本发明的目的在于提供一株抗逆性强、产酸能力强、益生功能优秀的益生菌-—嗜酸乳杆菌(LactcAacillus acidophilus)，此菌具有良好的产酸功能和益生功能 耐人工胃酸、耐胆汁液、对大肠杆菌K88、痢疾杆菌和金黄色葡萄球菌有较强抑制作用。本发明的另一目的在于提供该菌在制备禽畜或水产养殖饲料添加剂中的应用。本发明还提供了包含该嗜酸乳杆菌的饲料添加剂和其预混料。本发明的目的是通过如下技术方案实现的本发明提供一株新的嗜酸乳杆菌(LactcAacillus acidophilus)，其保藏编号为 CGMCCNo. 5093。进一步，该菌的16S rRNA基因序列如SEQ ID No 1所示。本发明的嗜酸乳杆菌可用于制备禽畜或水产养殖的饲料添加剂。本发明还提供了包含所述的嗜酸乳杆菌的饲料添加剂，其特征在于饲料添加剂中嗜酸乳杆菌的活菌数为109-101QCfU/g。其中，本发明的饲料添加剂中的嗜酸乳杆菌为经如下工艺制备而成(1)高密度发酵培养，培养条件为35-40°C、罐压为0. 03-0. 05Mpa，搅拌转速为60_100rpm，每30-60 分钟搅拌一次，每次搅拌时间为10-20分钟，得嗜酸乳杆菌发酵液；所用的发酵培养基的成分及质量体积比为蔗糖1_2%，大豆蛋白胨1-2%，酵母膏1-2%，硫酸铵0. 5-1. 0%，磷酸二氢钾0. 2-0. 5%、柠檬酸钠0. 2-0. 8%，硫酸镁0. 01-0. 05% ； (2)将得到的嗜酸乳杆菌发酵液3500-5000rpm离心，得到菌泥，加入与菌泥的重量体积比为15-20%的冻干保护剂，混勻，于-25°C -45°C冷冻干燥，至水分含量小于5% ；所述的冻干保护剂的组成成分及质量体积比为脱脂牛奶5-10%、麦芽糊精5-15%、海藻糖5-15%、维生素C 0. 5-2. 5%谷氨酸钠 0. 5-2. 5 %、硫酸锰 0. 4-1 %、甘油 2-5 %。进一步，嗜酸乳杆菌高密度发酵的培养条件为37°C、罐压为0. 05Mpa，搅拌转速为 60rpm，每45分钟搅拌一次，每次搅拌时间为15分钟；所用的发酵培养基的成分及质量体积比为蔗糖2 %，大豆蛋白胨1. 5 %，酵母膏1.5%，硫酸铵0.8%，磷酸二氢钾0.4%，柠檬酸钠0.6%，硫酸镁0.01-0. 05% ；所述的冻干保护剂的组成成分及质量体积比为脱脂牛奶 8 %、麦芽糊精8 %、海藻糖10 %、维生素C 0. 8 %、谷氨酸钠2 %、硫酸锰0. 8 %、甘油2 %。本发明也提供了包含所述的嗜酸乳杆菌的饲料添加剂的预混料，其特征在于预混料中饲料添加剂的添加质量体积比为0. 5-10%。，预混料中嗜酸乳杆菌的活菌数为 106-108cfu/g。本发明的嗜酸乳杆菌(LactcAacillus acidophilus)为申请人从猪粪便中分离得到，其生物学特征如下菌落圆整，表面光滑，不透明，乳白色，边缘光滑，革兰氏阳性菌; 单个菌体为杆状。本发明的嗜酸乳杆菌经过人工胃液、胆汁液及抗逆性的筛选；可以耐受 pH2.0，l%胃蛋白酶的人工胃液，可以耐受0.3%的人工胆汁液，也可以抑制致病性大肠杆菌K88，痢疾杆菌和金黄色葡萄球菌，具有较强的产酸和抑菌能力。本发明的嗜酸乳杆菌 (Lactobacillusacidophilus)申请人已于2011年7月沈日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCCJia 北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No. 5093。有益效果(1)本发明的嗜酸乳杆菌CGMCC No. 5093的抗逆性强，可以耐受人工胃液，人工胆盐，因此在经过动物胃肠道环境后，能够保证大量活菌可以顺利进入动物的肠道，在肠道中发挥益生功能，提高动物免疫力，降低养殖成本。(2)本发明的嗜酸乳杆菌可以有效抑制动物肠道内常见致病菌大肠杆菌K88，痢疾杆菌和金黄色葡萄球菌。(3)本发明的嗜酸乳杆菌可以大量的产酸，能够降低肠道内的PH抑制有害菌的生长和繁殖，同时也有助于消化。(4)本发明的嗜酸乳杆菌经过培养和高密度发酵及添加的保护剂等，得到的产品嗜酸乳杆菌活菌含量高，可作为生物饲料添加剂添加到养殖动物的饮水或者饲料中，可制备成预混料等饲料，减少抗生素的添加，真正改善动物肠道健康，提升动物免疫力，增加动物的生产性能。图1 嗜酸乳杆菌抑菌试验结果。通过下列实施例将更具体的说明本发明，但是应理解所述实施例仅是为了说明本发明，而不是以任何方式限制本发明的范围。一步复筛。菌落形态菌落圆整，表面光滑，不透明，乳白色，边缘光滑，革兰氏阳性菌；经革兰氏染色后在显微镜下观察，单个菌体为细长杆状。生理盐水的配制方法是0. 85%氯化钠溶液，高压灭菌后备用。2、复筛将1中挑出来的菌落进行进一步分离纯化，并将活化后菌落分别划线至含有2% CaCO3的MRS固体培养基的平皿上，37°C，恒温培养箱进行培养，24h后，挑取钙圈较大的菌落，进行进一步的保存和鉴定。3、嗜酸乳杆菌的分子鉴定利用细菌的通用引物对筛选到的菌株进行PCR鉴定按细菌DNA提取试剂盒操作说明书提取模板DNA。使用16S rRNA保守序列的上游引物5，-AGAGTT TGA TCC TGG CTC AG-3，，见 SEQID No. 2 和下游引物 5，_GGT TACCTT GTT ACG ACT T-3，见 SEQ ID No. 3 扩增细菌16s rRNA基因片段。经过测序进一步鉴定该菌为嗜酸乳杆菌，扩增片段的测序结果见 SEQ ID No. 1。实施例2嗜酸乳杆菌CGMCC No. 5093的益生功能及抗逆性能实验利用MRS培养基，对得到的嗜酸乳杆菌CGMCC No. 5093进行了耐酸性、耐胆盐和抑菌活性实验。(1)嗜酸乳杆菌耐酸性试验人工胃液的配制人工胃液的配制方法是胃蛋白酶，0.85%氯化钠，用浓盐酸调PH值到2. 0,3. 0,4. 0，经细菌过滤器过滤除菌后备用；试验结果如表1。表1嗜酸乳杆菌耐酸性试验结果


本发明属于生物技术领域，涉及一株嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)及其应用与其饲料添加剂和预混料。本发明的嗜酸乳杆菌抗逆性强，可以耐受人工胃液，人工胆盐，因此在经过动物胃肠道环境后，能够保证大量活菌可以顺利进入动物的肠道，在肠道中发挥益生功能，提高动物免疫力，降低养殖成本。本发明的嗜酸乳杆菌经过培养和高密度发酵及添加的保护剂等，得到的产品嗜酸乳杆菌活菌含量高，可作为生物饲料添加剂添加到养殖动物的饮水或者饲料中，可制备成预混料等饲料，减少抗生素的添加，真正改善动物肠道健康，提升动物免疫力，增加动物的生产性能。