专利名称：一种嗜酸乳杆菌冻干保护剂的制作方法嗜酸乳杆菌是动物体中固有的有益菌，它和双歧杆菌占动物体肠道内益生菌的95%以上，它们主要是通过维护肠道的微生态平衡而起到促进动物健康作用的。嗜酸乳杆菌主要存在在肠道的上半部，与主要存在在下半部的双歧杆菌共同维护着整个肠道的健庚。综合起来具有以下几方面的作用(I)提高免疫力嗜酸乳杆菌可产生大量的免疫球蛋白，从而激活集体的免疫细胞，使得外在菌难以留存在动物体内，达到免疫调节作用。(2)改善胃肠道功能嗜酸乳杆菌在肠道粘膜表面形成保护屏障，能够产生乳酸和醋酸，形成不利于有害菌生长的环境，抑制有害菌的生长，从而起到调节肠道菌群平衡的作用。(3)营养功能嗜酸乳杆菌能够产生乳酸和醋酸，能够提高钙、磷、铁的利用率，促进铁和维生素的吸收，产生维生素K和维生素B，产生乳糖酶帮助消化乳糖。(4)恢复因使用抗生素后而破坏的肠道菌群。但是，嗜酸乳杆菌作为益生菌在生产制备、贮藏和进入肠道之前很容易失活，为了得到较高的活菌，需要对其进行必要的保护，因此，嗜酸乳杆菌的保护技术成为其应用于在动物生产时的核心技术问题。冷冻保藏和冻干技术是生物学的ー个重要应用技术，近年来这ー技术因为“功能性食品”的快速发展而被应用于食品生产中，酸奶中的乳酸菌发酵剂的制备也常用该技木。然而，要想获得理想的冷冻及冻干效果，除エ艺外，主要是筛选和使用适宜的冷冻保护剂。适宜的冻干保护剂能够使得益生菌在冻干过程中的保藏最小限度死亡，减轻冷冻干燥所引起的对菌体的损伤，在保存时耐受较高的温度不损害菌体的活力。因而，冻干保护剂的种类、浓度和配制方法对益生菌的保存效果有明显的影响。
为了解决上述问题，本发明的目的在于提供一种嗜酸乳杆菌的冷冻干燥保护剂。首先，本发明提供一种嗜酸乳杆菌冷冻干燥保护剂，其含有1.0-5. 0%海藻糖；5. 0-20.0% 脱脂奶粉；2. 0-8.0% 蔗糖；0. 4-1. 0% D-异抗坏血酸；0. 5-2. 0% 谷氨酸钠。 进ー步地，本发明提供一种嗜酸乳杆菌冷冻干燥保护剂，其含有5%海藻糖、15%脱脂奶粉、4%蔗糖、I % D-异抗坏血酸和2. O %谷氨酸钠。其中，所述冷冻干燥保护剂的悬浮基质为无菌生理盐水或MRS液体培养基。其中，所述的脱脂奶粉为伊利高蛋白脱脂高钙奶粉。本发明还提供一种嗜酸乳杆菌冻干剂，其含有所述的冷冻干燥保护剂。进ー步地，所述的嗜酸乳杆菌为嗜酸乳杆菌CGMCC No. 5093。本发明中的嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)为申请人从动物肠道中分离得到，能分泌抗生物素类物质(嗜酸乳菌素、嗜酸杆菌素、乳酸菌素)，对肠道致病菌产生拮抗作用，抑制肠道不良微生物的増殖，调整肠道菌群平衡，它的生物学特征如下杆菌，两端圆，0. 6-0. 9X1. 5-6 u m,以单个、成双或短链出现；不运动，无边帽，菌落粗糙。在显微镜下观察，显示缠绕或微绒毛丝状物，从似暗影的菌堆的中心放射伸出。无特有的色素。可同 化苦杏仁苷、纤维ニ糖、七叶苷、果糖、麦芽糖、半乳糖、乳糖、蔗糖、甘露糖、蜜ニ糖、棉籽糖、海藻糖，不能同化阿拉伯糖、葡萄糖酸盐、甘露糖。同型发酵，产生DL-乳酸。15°C下不生长，最适生长温度为35°C -38°C，生长初始pH值为5. 0-7. 0，最适生长pH值为5. 5-6. O。本发明的嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)申请人已于2011年7月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，简称CGMCCJii :北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No. 5093。本发明提供的冻干保护剂具有体积小、含菌量高、低污染、便于保藏、运输，使用方便等优点。用本发明的冷冻干燥保护剂制备的嗜酸乳杆菌干粉的活菌数可达到4. 0X10nCFU/g 以上。(3)保护剂材料蔗糖、乳糖、脱脂奶粉、D-异抗坏血酸、玉米淀粉、谷氨酸钠、海藻糖、山梨醇、甘油。(4)补料50%的葡萄糖，经121°C灭菌15分钟。(4)菌落计数培养基MRS琼脂培养基。(5)真空冷冻干燥机德国CHRIST ALPHA2-4LSC型。2、嗜酸乳杆菌的冷冻干燥2. I嗜酸乳杆菌的増殖培养将培养好的种子液300mL接种至4L优化培养基的5L发酵罐中，培养參数为温 度，37。。;搅拌速度，50rmp ;pH值，6. 0±0. 5 ;培养时间，24h。嗜酸乳杆菌的増殖培养所用的优化培养基配方如下蛋白胨，10.0g/L;牛肉膏，8. Og/L ;酵母膏，6. Og/L ;葡萄糖，25. Og/L ;吐温80，lmL/L ;磷酸氢ニ钾，3. 0g/L ;三水こ酸钠，5. 0g/L ;柠檬酸三铵，2. 0g/L ;七水硫酸镁，0. 2g/L ;硫酸锰，0. 05g/L ；pH 6. 2±0. 2。发酵过程中加入0. 5-1 %的CaCO3,调节pH在6. 2 6. 5 ;发酵8h后进行补料，即加入50%的葡萄糖200mL。将发酵完成的嗜酸乳杆菌发酵液取出，并进行活菌计数，发酵液中嗜酸乳杆菌活菌数达到 I. 8X 109CFU/mL。活菌计数采用平板涂布计数法取ImL菌液加入到9mL无菌水中，用十倍梯度稀释法稀释，选择适宜的三个稀释梯度进行測定。分别吸取样品稀释液0. lmL，每个稀释度做三个平板，倒置于37°C恒温箱中培养36h，计数，并按如下公式计算。嗜酸乳杆菌发酵液活菌数(CFU/mL)=每平皿平均菌体数(CFU) XlOX稀释倍数2. 2嗜酸乳杆菌发酵液的收集浓缩将嗜酸乳杆菌发酵液进行高速离心，转速4000rmp，20min,得到菌泥，并进行活菌计数，活菌数 4. 28 X 1012CFU/g。活菌计数方法取Ig菌泥加入到9mL无菌水中，用十倍梯度稀释法稀释，选择适宜的三个稀释梯度进行測定。分别吸取样品稀释液0. lmL，每个稀释度做三个平板，倒置于37 0C恒温箱中培养36h，计数，并按如下公式计算。嗜酸乳杆菌菌泥活菌数(CFU/g)=每平皿平均菌体数(CFU) XlOX稀释倍数2. 3冻干保护剂的筛选选取与发酵液同体积的保护剂将离心后的菌泥稀释均匀成菌悬液(悬浮基质为MRS液体培养基)，分装于小瓶中，在超低温冰箱(-80°C)进行预冻贮藏，贮藏4h后，取出在40°C水浴中化冻后，用平板计数法測定活菌数，然后计算出冻干前活菌数。预冻后，置于真空冷冻干燥机中干燥，冷阱温度_50°C左右，真空度20Pa，干燥24h左右后得到嗜酸乳杆菌菌干粉，測定干粉的活菌数。用倒平板法进行活菌计数，试验重复3次，毎次试验取2个平行样。并按照如下公式计算在不同保护剂作用下嗜酸乳杆菌的存活率，由此确定较好的保护剂。存活率(％) = V2XIooZV1V1——干燥前的活菌数(ImL液体样的活菌数，CFU/mL)V2——干燥后的活菌数(ImL液体样干燥后的活菌数，CFU/mL)冻干保护剂的筛选结果见表I。表I冻干保护剂的筛选结果

本发明公开了一种嗜酸乳杆菌冷冻干燥保护剂，其含有1.0-5.0％海藻糖；5.0-20.0％脱脂奶粉；2.0-8.0％蔗糖；0.4-1.0％D-异抗坏血酸；0.5-2.0％谷氨酸钠。本发明提供的冻干保护剂具有体积小、含菌量高、低污染、便于保藏、运输，使用方便等优点。用本发明的冷冻干燥保护剂制备的嗜酸乳杆菌干粉的活菌数可达到4.0×1011CFU/g以上。