专利名称：b型流感嗜血杆菌高密度培养生产细菌荚膜多糖的方法如今,流感嗜血杆菌(Haemophilus Influenzae, Hi)仍是导致人类侵袭性疾病的主要致病菌，其中绝大部分由b型流感嗜血杆菌(Haemophi Ius Influenzae type b,Hib)引起。Hib脑膜炎的危害居细菌性脑膜炎的首位，具有发病率高、病死率高和致残率高的特点；其另一个特点是发病年龄小，婴幼儿感染率高，发病年龄主要集中在5岁以下，尤其是2岁以下。据2006年世界卫生组织(WHO)报道，每年全世界Hib脑膜炎至少造成300万例严重疾病，其中约38. 6万人死亡，已成为全球性的一大公共卫生问题。在发展中国家，Hib肺炎在儿童感染性疾病中占有很大比例，约占所有儿童肺炎的20%，是发展中国家儿童肺炎 的重要死亡原因。在亚洲22个国家的48项研究中，有2/3表明Hib是儿童非结核性脑膜炎的首要致病原。我国3 5岁儿童中Hib自然感染抗体水平低，为Hib感染高危人群。因此，我国有使用Hib疫苗的必要。接种疫苗是预防绝大多数Hib严重病例的唯一公共卫生措施。第一种Hib多糖疫苗于1985年4月在美国上市，这种疫苗适用于2 5岁的儿童。流行病学调查表明6月龄前儿童就需要保护，然而，对于小于18月龄的儿童，这种采用PRP的疫苗的有效率为零，这成为该疫苗使用上的最大障碍和不足。结合疫苗的研制成功解决了疫苗在婴幼儿中无效的问题，结合疫苗比以往的疫苗具有更强的免疫原性和更好的免疫效果。结合疫苗于1987年投放市场，针对18月龄以上儿童。在随后几年间，三种新的疫苗很快面市，采用了不同的蛋白作为结合蛋白。这些新疫苗在婴幼儿中非常有效。即使在小年龄婴儿中使用Hib疫苗，也是安全有效的。上世纪90年代初，西欧、美洲等国家将Hib结合疫苗纳入常规儿童免疫规划，Hib侵袭性疾病的发病率迅速降低，甚至消失。目前，世界卫生组织(WHO)正致力于推动将其纳入其它国家的计划免疫程序中。至2004年，全球已有包括美洲、欧洲大部分地区和澳洲在内的94个国家将Hib疫苗纳入儿童免疫计划，另有15个国家在全球疫苗与免疫联盟(GAVI)的资助下使用这种疫苗，占全球所有国家和地区使用量的一半。至2007年，已经有112个国家纳入Hib疫苗计划免疫，3个国家部分纳入Hib疫苗。但在人口占世界1/2的亚洲，只有少数几个国家，如马来西亚和蒙古(GAVI资助)等将Hib疫苗纳入了计划免疫中。我国由于缺乏系统的Hib疾病流行病学资料，Hib疫苗尚未纳入中国计划免疫的范围。仅有部分城市开始推广使用Hib疫苗并获得了较好的效果。在农村和城市中低收入家庭，由于疫苗价格较高，限制了疫苗的普及。制备Hib结合疫苗首先要获得Hib荚膜多糖，目前大规模生产Hib荚膜多糖的方法主要是通过发酵罐搅拌及深层通气的方式培养，当Hib细菌至对数生长期后期或静止期前期时，使用甲醛杀菌后去除菌体，收集发酵液上清液，再经后续一系列纯化工序后获得高纯度的Hib荚膜多糖 。传统生产方式的Hib荚膜多糖产率较低，疫苗生产过程中的成本较高，这也是使Hib疫苗价格居高的其中一个原因。同时，由于Hib发酵液中含有较多的核酸及蛋白等杂质成分，增加了后续纯化的难度，为了获得高纯度的Hib荚膜多糖，只能增加纯化的工序，更进一步降低了 Hib荚膜多糖的收率，使产量进一步下降。
本发明的目的在于解决现有技术的不足，提供一种有效降低发酵液中核酸和蛋白等杂质含量、降低去除杂质蛋白所需的苯酚用量的、Hib荚膜多糖产量高的b型流感嗜血杆菌高密度培养生产细菌荚膜多糖的方法。本发明的目的是通过以下技术方案实现的b型流感嗜血杆菌高密度培养生产细菌荚膜多糖的方法，它包括以下步骤(I)Hib菌种一至四代传代培养，它包括以下传代培养步骤A、第一代培养开启Hib菌种传代至5 IOmlHib液体培养基,放入恒温摇床振荡培养16 20h，其中，恒温摇床振荡培养的温度为35 37°C、回旋频率为250 330rpm ；B、第二代培养将第一代培养所得的Hib菌种接种到10 20mlHib液体培养基，继续放入恒温摇床振荡培养6 8h，其中，恒温摇床振荡培养的温度为35 37°C、回旋频率为 250 330rpm ；C、第三代培养将第二代培养所得的Hib菌种接种到20 50mlHib液体培养基，继续放入恒温摇床振荡培养6 8h，其中，恒温摇床振荡培养的温度为35 37°C、回旋频率为 250 330rpm ；D、第四代培养将第三代培养所得的Hib菌种接种到500 IOOOmlHib液体培养基，继续放入恒温摇床振荡培养，直到培养基中菌浓度达到100 200亿/ml，其中，恒温摇床振荡培养的温度为35 37°C、回旋频率为250 330rpm ；(2)种子罐培养将第四代培养所得的Hib菌种接种到种子罐中，恒温搅拌通气培养，直到菌浓度达到200 300亿/ml，其中，恒温搅拌通气培养的温度为35 37°C、搅拌频率为100 200rpm ；(3)发酵罐培养将在种子罐中培养所得的Hib菌种接种到发酵罐中，恒温搅拌通气培养，在此过程中向发酵罐中补加浓度为10 %的葡萄糖溶液，至Hib细菌至对数生长期后期或静止期前期，菌浓度达到300 400亿/ml时停止搅拌培养，其中，恒温搅拌通气培养的温度为35 37°C、搅拌频率为200 300rpm ；(4)杀菌、取上清液向发酵罐中加入甲醛溶液至甲醛终浓度为I 2%进行杀菌，待杀菌完成后，取发酵液上清液；(5)纯化对上清液进行纯化处理，获得b型流感嗜血杆菌荚膜多糖成品。本发明所述的Hib液体培养基包括以下重量比的组分胰蛋白胨10 20，酸水解酪蛋白5 15，酵母提取物5 30，氯化钠2 8. 5，葡萄糖5 20，氯化血红素0. 01 0.03，辅酶 I 0. 01 0. 03。本发明的有益效果是(I)培养Hib细菌达到较高的浓度，使Hib荚膜多糖的产量在传统方式的基础上提高了 50% 100%，且生产出的荚膜多糖符合国家质量标准；(2)将发酵液中的核酸和蛋白等杂质含量控制在低水平，较低的蛋白含量减少了苯酚抽提去除杂质蛋白的次数，从而降低了后续纯化过程中的苯酚用量，减少了对环境的污染，也降低了生产成本；(3)多糖产量稳定，纯化后的精糖蛋白和内毒素等杂质含量都大大低于国家控制的标准，并且得到的多批多糖原液各项检定结果稳定，重复性很高，可操作性强，有利于大规模生产。 下面结合具体实施例进一步描述本发明的技术方案实施例Ib型流感嗜血杆菌高密度培养生产细菌荚膜多糖的方法，它包括以下步骤(I)Hib菌种一至四代传代培养，它包括以下传代培养步骤A、第一代培养开启Hib菌种传代至5mlHib液体培养基,放入恒温摇床振荡培养16h，其中，恒温摇床振荡培养的温度为35°C、回旋频率为250rpm ；B、第二代培养将第一代培养所得的Hib菌种接种到IOmlHib液体培养基，继续放入恒温摇床振荡培养6h，其中，恒温摇床振荡培养的温度为35°C、回旋频率为250rpm ；C、第三代培养将第二代培养所得的Hib菌种接种到20mlHib液体培养基，继续放入恒温摇床振荡培养6h，其中，恒温摇床振荡培养的温度为35°C、回旋频率为250rpm ；D、第四代培养将第三代培养所得的Hib菌种接种到500mlHib液体培养基，继续放入恒温摇床振荡培养，直到培养基中菌浓度达到100亿/ml，其中，恒温摇床振荡培养的温度为35°C、回旋频率为250rpm ；其中，所述的Hib液体培养基包括以下重量比的组分胰蛋白胨10，酸水解酪蛋白5，酵母提取物5，氯化钠2，葡萄糖5，氯化血红素0.01，辅酶10.01。(2)种子罐培养将第四代培养所得的Hib菌种接种到种子罐中，恒温搅拌通气培养，直到菌浓度达到200亿/ml，其中，恒温搅拌通气培养的温度为35°C、搅拌频率为IOOrpm ；(3)发酵罐培养将在种子罐中培养所得的Hib菌种接种到发酵罐中，恒温搅拌通气培养，在此过程中向发酵罐中补加浓度为10 %的葡萄糖溶液，至Hib细菌至对数生长期后期或静止期前期，菌浓度达到300亿/ml时停止搅拌培养，其中，恒温搅拌通气培养的温度为35°C、搅拌频率为200rpm ；(4)杀菌、取上清液向发酵罐中加入甲醛溶液至甲醛终浓度为I %进行杀菌，待杀菌完成后，取发酵液上清液；(5)纯化对上清液进行纯化处理，获得b型流感嗜血杆菌荚膜多糖成品。实施例2b型流感嗜血杆菌高密度培养生产细菌荚膜多糖的方法，它包括以下步骤(I)Hib菌种一至四代传代培养，它包括以下传代培养步骤A、第一代培养开启Hib菌种传代至IOmlHib液体培养基,放入恒温摇床振荡培养20h，其中，恒温摇床振荡培养的温度为37°C、回旋频率为330rpm ；B、第二代培养将第一代培养所得的Hib菌种接种到20mlHib液体培养基，继续放入恒温摇床振荡培养8h，其中，恒温摇床振荡培养的温度为37°C、回旋频率为330rpm ；C、第三代培养将第二代培养所得的Hib菌种接种到50mlHib液体培养基，继续放入恒温摇床振荡培养8h，其中，恒温摇床振荡培养的温度为37°C、回旋频率为330rpm ；D、第四代培养将第三代培养所得的Hib菌种接种到IOOOmlHib液体培养基，继续放入恒温摇床振荡培养，直到培养基中菌浓度达到200亿/ml，其中，恒温摇床振荡培养的温度为37°C、回旋频率为330rpm ；其中，所述的Hib液体培养基包括以下重量比的组分胰蛋白胨20，酸水解酪蛋白15，酵母提取物30，氯化钠8. 5，葡萄糖20，氯化血红素0. 03,辅酶I 0. 03。(2)种子罐培养将第四代培养所得的Hib菌种接种到种子罐中，恒温搅拌通气培养，直到菌浓度达到300亿/ml，其中，恒温搅拌通气培养的温度为37°C、搅拌频率为200rpm ； (3)发酵罐培养将在种子罐中培养所得的Hib菌种接种到发酵罐中，恒温搅拌通气培养，在此过程中向发酵罐中补加浓度为10 %的葡萄糖溶液，至Hib细菌至对数生长期后期或静止期前期，菌浓度达到400亿/ml时停止搅拌培养，其中，恒温搅拌通气培养的温度为37°C、搅拌频率为300rpm ；(4)杀菌、取上清液向发酵罐中加入甲醛溶液至甲醛终浓度为2%进行杀菌，待杀菌完成后，取发酵液上清液；(5)纯化对上清液进行纯化处理，获得b型流感嗜血杆菌荚膜多糖成品。实施例3b型流感嗜血杆菌高密度培养生产细菌荚膜多糖的方法，它包括以下步骤(I)Hib菌种一至四代传代培养，它包括以下传代培养步骤A、第一代培养开启Hib菌种传代至8mlHib液体培养基,放入恒温摇床振荡培养18h，其中，恒温摇床振荡培养的温度为36°C、回旋频率为290rpm ；B、第二代培养将第一代培养所得的Hib菌种接种到15mlHib液体培养基，继续放入恒温摇床振荡培养7h，其中，恒温摇床振荡培养的温度为36°C、回旋频率为290rpm ；C、第三代培养将第二代培养所得的Hib菌种接种到35mlHib液体培养基，继续放入恒温摇床振荡培养7h，其中，恒温摇床振荡培养的温度为36°C、回旋频率为290rpm ；D、第四代培养将第三代培养所得的Hib菌种接种到750mlHib液体培养基，继续放入恒温摇床振荡培养，直到培养基中菌浓度达到150亿/ml,其中，恒温摇床振荡培养的温度为36°C、回旋频率为290rpm ；其中，所述的Hib液体培养基包括以下重量比的组分胰蛋白胨15，酸水解酪蛋白10，酵母提取物18，氯化钠5，葡萄糖12，氯化血红素0.02，辅酶I 0.02。(2)种子罐培养将第四代培养所得的Hib菌种接种到种子罐中，恒温搅拌通气培养，直到菌浓度达到250亿/ml，其中，恒温搅拌通气培养的温度为36°C、搅拌频率为150rpm ；(3)发酵罐培养将在种子罐中培养所得的Hib菌种接种到发酵罐中，恒温搅拌通气培养，在此过程中向发酵罐中补加浓度为10 %的葡萄糖溶液，至Hib细菌至对数生长期后期或静止期前期，菌浓度达到350亿/ml时停止搅拌培养，其中，恒温搅拌通气培养的温度为36°C、搅拌频率为250rpm ；
(4)杀菌、取上清液向发酵罐中加入甲醛溶液至甲醛终浓度为I. 5%进行杀菌，待杀菌完成后，取发酵液上清液；(5)纯化 对上清液进行纯化处理，获得b型流感嗜血杆菌荚膜多糖成品。实施例4b型流感嗜血杆菌高密度培养生产细菌荚膜多糖的方法，它包括以下步骤(I)Hib菌种一至四代传代培养，它包括以下传代培养步骤A、第一代培养开启Hib菌种传代至5mlHib液体培养基,放入恒温摇床振荡培养20h，其中，恒温摇床振荡培养的温度为37°C、回旋频率为300rpm ；B、第二代培养将第一代培养所得的Hib菌种接种到IOmlHib液体培养基，继续放入恒温摇床振荡培养7h，其中，恒温摇床振荡培养的温度为37°C、回旋频率为300rpm ；C、第三代培养将第二代培养所得的Hib菌种接种到20mlHib液体培养基，继续放入恒温摇床振荡培养7h，其中，恒温摇床振荡培养的温度为37°C、回旋频率为300rpm ；D、第四代培养将第三代培养所得的Hib菌种接种到500mlHib液体培养基，继续放入恒温摇床振荡培养，直到培养基中菌浓度达到150亿/ml,其中，恒温摇床振荡培养的温度为37°C、回旋频率为300rpm ；其中，所述的Hib液体培养基包括以下重量比的组分胰蛋白胨10，酸水解酪蛋白10，酵母提取物15，氯化钠6，葡萄糖10，氯化血红素0. 02,辅酶I 0. 02。(2)种子罐培养将第四代培养所得的Hib菌种接种到种子罐中，恒温搅拌通气培养，直到菌浓度达到200亿/ml，其中，恒温搅拌通气培养的温度为37°C、搅拌频率为200rpm ；(3)发酵罐培养将在种子罐中培养所得的Hib菌种接种到发酵罐中，恒温搅拌通气培养，在此过程中向发酵罐中补加浓度为10 %的葡萄糖溶液，至Hib细菌至对数生长期后期或静止期前期，菌浓度达到400亿/ml时停止搅拌培养，其中，恒温搅拌通气培养的温度为37°C、搅拌频率为300rpm ；(4)杀菌、取上清液向发酵罐中加入甲醛溶液至甲醛终浓度为I. 5%进行杀菌，待杀菌完成后，取发酵液上清液；(5)纯化对上清液进行纯化处理，获得b型流感嗜血杆菌荚膜多糖成品。实施例5b型流感嗜血杆菌高密度培养生产细菌荚膜多糖的方法，它包括以下步骤(I)Hib菌种一至四代传代培养，它包括以下传代培养步骤A、第一代培养开启Hib菌种传代至IOmlHib液体培养基,放入恒温摇床振荡培养18h，其中，恒温摇床振荡培养的温度为37°C、回旋频率为280rpm ；B、第二代培养将第一代培养所得的Hib菌种接种到20mlHib液体培养基，继续放入恒温摇床振荡培养8h，其中，恒温摇床振荡培养的温度为37°C、回旋频率为280rpm ；C、第三代培养将第二代培养所得的Hib菌种接种到50mlHib液体培养基，继续放入恒温摇床振荡培养8h，其中，恒温摇床振荡培养的温度为37°C、回旋频率为280rpm ；D、第四代培养将第三代培养所得的Hib菌种接种到IOOOmlHib液体培养基，继续放入恒温摇床振荡培养，直到培养基中菌浓度达到200亿/ml，其中，恒温摇床振荡培养的温度为37°C、回旋频率为280rpm ；
其中，所述的Hib液体培养基包括以下重量比的组分胰蛋白胨20，酸水解酪蛋白15，酵母提取物5，氯化钠2，葡萄糖5，氯化血红素0.03，辅酶I 0.03。(2)种子罐培养将第四代培养所得的Hib菌种接种到种子罐中，恒温搅拌通气培养，直到菌浓度达到250亿/ml，其中，恒温搅拌通气培养的温度为37°C、搅拌频率为180rpm ；(3)发酵罐培养将在种子罐中培养所得的Hib菌种接种到发酵罐中，恒温搅拌通气培养，在此过程中向发酵罐中补 加浓度为10 %的葡萄糖溶液，至Hib细菌至对数生长期后期或静止期前期，菌浓度达到400亿/ml时停止搅拌培养，其中，恒温搅拌通气培养的温度为36. 5°C、搅拌频率为300rpm ；(4)杀菌、取上清液向发酵罐中加入甲醛溶液至甲醛终浓度为2%进行杀菌，待杀菌完成后，取发酵液上清液；(5)纯化对上清液进行纯化处理，获得b型流感嗜血杆菌荚膜多糖成品。制备三批，按药典方法检测其中蛋白、核酸、核糖、磷及内毒素含量，所得结果如下表所示
复合多多糖
口° 固总蛋白核酸核糖磷内毒素
批次糖产量产量
mg/ml mg/ml mg/ml mg/ml mg/ml EU/ u g
g/L g/L
标准------ <10 <10 320 410 68 90 <50
15.8 0.46 4. 77 <1. 05 5. 35 396. 93 68. 35 <12.47
27.2 0.43 4. 89 <1. 02 4. 6 374. 3 74. 58 <12.47
35.74 0. 37 5. 01 2. 18 3. 21 400. 63 76. 09 <12.47 经过各项检定表面，蛋白、核酸、核糖、磷和内霉素的含量均符合国家标准，得到的三批Hib荚膜多糖均符合药典要求。计算多糖产量发现，通过本方法得到的荚膜多糖产量在0. 4g/L左右，与传统生产方法0. 2g/L的产量相比，有了较大的提高。


本发明公开了一种b型流感嗜血杆菌高密度培养生产细菌荚膜多糖的方法，它包括以下步骤Hib菌种一至四代传代培养，种子罐培养，发酵罐发酵培养，杀菌、取上清液和纯化。本发明的有益效果是(1)培养Hib细菌达到较高的浓度，使Hib荚膜多糖的产量在传统方式的基础上提高了50%～100%，且生产出的荚膜多糖符合国家质量标准；(2)将发酵液中的核酸和蛋白等杂质含量控制在低水平，较低的蛋白含量减少了苯酚抽提去除杂质蛋白的次数，从而降低了后续纯化过程中的苯酚用量，减少了对环境的污染，也降低了生产成本；(3)多糖产量稳定，纯化后的精糖蛋白和内毒素等杂质含量都大大低于国家控制的标准。