专利名称：山葵试管苗离体茎尖包埋干燥超低温保存及再生培养方法在种质资源保藏工作中，为了贮存种质的安全，要求长期种质库保藏的种质材料在若干年后重新繁殖时仍具有较高的再生率，并保持原来的遗传性状。山葵(及wasabi (Sieboid) Maxim)又名山箭菜,是十字花科山箭菜属的多年生草本植物，原产于东亚，分布于我国西南和浙江等省，是兼蔬菜和药用的重要经济作 物，其根、茎、叶都具有极高的经济价值。山葵全株具有香、辛、甘、粘等风味及杀菌特性，其独特的辛辣味道使之作为独特的调味品用于食品，叶片可作为蔬菜食用，有发汗、利尿、解毒、清血等功效。山葵能够促进淀粉性食物的消化、稳定胃肠中的维生素C、杀死消化道中寄生虫，近年研究还发现其具有防治胃癌的功效。还有研究报告称，山葵粉碎物加上过氧化氢物可以产生很好的生物酚，具有治理各种化工污染物的作用。山葵不易结籽，且其种子对干燥敏感，不耐低温长期贮藏。生产上多利用根苗和蘖芽苗进行繁殖，需沙藏越冬，由于不易控制贮藏中的温湿度条件，贮藏中易腐烂，因此山葵种质资源须在田间基因圃中保存，每年进行种、收、贮藏操作，除占用大量的时间、人力、物力、财力和耕地，且易受自然灾害影响，造成一些品种缺失。使用离体试管苗方法来保存山葵种质需要不断继代，有可能因操作污染、混杂而使保存材料丧失，而且容易随着保存时间延长而发生变异。超低温保存方法是长期安全保存种质资源的最佳技术手段，节约空间，费用低，稳定、有效，目前已研究出多种超低温保存种质的方法。由于不同物种甚至同一物种的不同品种最其适宜的超低温保存方法及程序技术各有不同，当前还没有建立起一种具有普适性的超低温保存方法，这是超低温保存技术在实际应用中的主要难点之一。已知关于山葵的超低温保存方法研究有玻璃化法和包埋玻璃化法两种，皆存在植株变异和再生率低的问题，目前尚无更有效的方法的研究报告。
本发明的目的在于提供一种山葵试管苗离体茎尖包埋干燥法超低温保存以及再培养方法，能够更加安全、有效的保存山葵的种质资源，且避免产生遗传变异，化冻后植株再生率高,再生苗生长良好。为了实现上述目的，本发明的技术方案是 山葵试管苗离体茎尖包埋干燥法超低温保存及其再生培养方法，包括以下步骤 一材料扩繁； 一莖尖剥取；一预培养； 一藻酸钙包埋成球； 一无菌空气流干燥；
一装入冷冻管；
一投入液氮超低温保存；
一化冻；
一恢复再生培养。材料扩繁，将无菌苗培养在825 mg/L NH4N03、950mg/L KN03、220mg/LCaCl2 2H20、185mg/L MgS04 7H20、85mg/L KH2P04 的 MS + 0. lmg/L BA + 20g/L 蔗糖 +7g/L琼脂的培养基上，PH 5. 8，温度20±2°C，光照时间16h，每35 40d继代I次。 茎尖剥取，在无菌条件下从生长健壮的无菌苗上切取直径大小约I 3mm的离体茎尖为材料。预培养，剥取的茎尖在20°C或25°C条件下用含0. 3mol/L蔗糖的MS固体培养基预培养I 2d。藻酸钙包埋成球，将预培养后的离体茎尖置于含25g/L海藻酸钠+ 2mol/L甘油+ 0.8mol/L蔗糖的无钙MS培养液中，用无菌滴管或移液器吸取含一个茎尖的无钙MS培养液滴至含0. lmol/L氯化钙+ 2mol/L甘油+ 0. 8mol/L蔗糖的培养液中，并于25°C保持25 30 min使之成包埋球，每个包埋球大小约4 5mm，含有一个茎尖。无菌空气流干燥，将含茎尖的包埋球取出，放置于无菌培养皿上的无菌滤纸上，在无菌空气流中干燥3 5h。装入冷冻管，无菌空气流干燥后，将包埋球装入冷冻管，每个冷冻管装10 20个包埋球。投入液氮超低温保存，将装有包埋球的冷冻管置于冷冻管架或沙袋后投入液氮进行超低温保存。化冻，从液氮中取出冷冻管，在38 40°C水浴中化冻I. 5 3min。恢复再生培养，化冻后的包埋球在KN03 950mg/L和NH4N03 825mg/L的MS +
0.lmg/LBA + 30g/L蔗糖+ 6. 5g/L琼脂，PH 5. 8的培养基中进行恢复培养，先在黑暗条件或弱光下培养8 — 10天后，再转入与继代培养相同的条件下培养。本发明提供了一种安全、稳定、可靠、简单、有效地长期保存山葵种质资源的方法，山葵试管苗离体茎尖经过超低温保存后，将其化冻处理、恢复再生培养直接成苗，不形成愈伤组织，避免产生遗传变异，遗传稳定性好，再生苗恢复生长良好，植株再生率可达86 %以上。


图I为山葵试管苗离体茎尖包埋干燥超低温保存方法步骤框图。

作进一步的说明。如图I所示山葵试管苗离体茎尖包埋干燥法超低温保存及其再生培养方法，包括以下具体步骤
一材料扩繁将无菌苗培养在825 mg/L NH4N03、950mg/L KN03、220mg/L CaCl2 *2H20,185mg/L MgS04 7H20、85mg/L KH2P04 的 MS + 0. lmg/L BA + 20g/L 蔗糖 + 7g/L 琼脂的培养基上，PH 5.8，温度20±21，光照时间1611，每35 40(1继代I次。试验中发现，将MS培养基中NH4N03、KN03、CaCl2 2H20、MgS04 7H20、KH2P04的含量减半，无菌苗生长和扩
繁效果良好。一茎尖剥取在无菌条件下从生长健壮的无菌苗上切取直径大小约I 3mm的离体茎尖为材料。一预培养剥取的茎尖在20°C或25°C条件下用含0. 3mol/L蔗糖的 MS固体培养基预培养I 2d。使茎尖材料细胞中自由水含量降低，增强茎尖材料的抗冻能力，防止在超低温冷冻条件下在细胞中形成冰晶。一藻酸钙包埋成球将预培养后的离体茎尖置于含25g/L海藻酸钠+ 2mol/L甘油+ 0.8mol/L蔗糖的无钙MS培养液中，用无菌滴管或移液器吸取含一个茎尖的无钙MS培养液滴至含0. lmol/L氯化钙+ 2mol/L甘油+ 0. 8mol/L蔗糖的培养液中，并于25°C保持25 30 min使之成包埋球，每个包埋球大小约4 5mm，含有一个茎尖。包含一个茎尖的液滴滴入培养液中，液滴与培养液中钙离子反应生成固化包埋球，较高渗透压的培养液进一步降低包埋球及其中茎尖的含水量，进一步防止细胞中水分在超低温冷冻时生成冰晶。一无菌空气流干燥将含茎尖的包埋球取出，放置于无菌培养皿上的无菌滤纸上，在无菌空气流中干燥3 5h。在前述步骤的基础上，通过无菌空气流进一步降低包埋球的水分。一装入冷冻管无菌空气流干燥后，将包埋球装入冷冻管，每个冷冻管装10 20个包埋球。—投入液氮超低温保存将装有包埋球的冷冻管置于冷冻管架或沙袋后投入液氮进行超低温保存。在超低温一 196°C液氮中，山葵茎尖组织细胞生理活动停止，不会产生遗传变异。一化冻从液氮中取出冷冻管，在38 40°C水浴中化冻I. 5 3min。快速化冻，防止在复苏过程中生成冰晶对茎尖材料细胞造成伤害。一恢复再生培养化冻后的包埋球在KN03 950mg/L和NH4N03 825mg/L的MS +
0.lmg/LBA + 30g/L蔗糖+ 6. 5g/L琼脂，PH 5. 8的培养基中进行恢复培养，先在黑暗条件或弱光下培养8 — 10天后，再转入与继代培养相同的条件下培养。试验中证明，将化冻的包埋球置于减半硝酸钾、硝酸铵含量的MS培养基中再生，山葵茎尖不生成愈伤组织，避免了山葵茎尖组织在生成愈伤组织时发生遗传变异现象，生物性状保持稳定，保证山葵种质资源的安全可靠保藏，恢复再生苗生长良好，植株再生率可达86%以上。针对山葵的生物特异性，该方法成本低，操作手续简单有效，能够以较低成本长期大量保藏山葵品种资源，节约土地和人力物力损耗。


山葵试管苗离体茎尖包埋干燥超低温保存及再生培养方法，涉及种质保藏技术领域，包括以下步骤材料扩繁、茎尖剥取、预培养、藻酸钙包埋成球、无菌空气流干燥、装入冷冻管、投入液氮超低温保存、化冻、恢复再生培养。山葵试管苗离体茎尖超低温保存后经过化冻处理，恢复再生培养后直接成苗，避免遗传变异。长期、安全、稳定、可靠、简单、有效的保存山葵种质资源，再生苗恢复生长良好，植株再生率高。