专利名称：玉米酪氨酸蛋白磷酸酶基因及其编码蛋白与应用的制作方法 干旱缺水是限制我国北方广大地区农、林、牧业生产的主要因素之一。近年来大量的研究表明，植物具有对干旱胁迫快速感知和主动反应的能力，这种快速感知和主动反应能力的获得是通过一系列逆境信息传递过程实现的。植物可以通过一系列的信息传递产生各种抗逆的生理、生化反应，以渡过短暂的干旱的不利环境。脱落酸(abscisic acid，ABA)作为五大类植物激素之一，已被公认为，对提高植物抗逆性起至关重要的作用，人们也通俗地称之“诱抗素”。ABA不仅可以作为长距离信号，由根部运输到植物叶片，调控气孔开关，从而调控植株整体的水分关系，而且ABA还可以作为细胞信号介导众多基因的表达，以提高植物的抗逆性。ABA之所以能够作为逆境信号物质其根本基础在于水分亏缺等环境胁迫可以快速及大量地诱导ABA的积累。水分亏缺诱导ABA积累过程实际上是一个细胞逆境信息传递过程，该过程包括细胞对水分亏缺的识别、细胞信号转导及ABA生物合成关键酶基因表达的调控等。水分亏缺诱导ABA积累包含整个细胞逆境信息传递系统中最关键的信息传递链，对该信息传递链的研究不仅有助于揭示水分亏缺原初信号的识别和转导机制，而且有可能为通过基因工程操纵植物的抗逆性提供直接的手段或策略。近年来本发明人所在实验室围绕水分胁迫诱导ABA积累的细胞逆境信号展开了大量的研究，但是没有发现人们熟知的信号组分或信号系统，如Ca2+、CaM、IP3和DG、PKC、CDPK、MAPK可以参与水分胁迫诱导ABA积累的细胞信号传递；却发现了水分胁迫诱导的ABA积累可被还原剂及酪氨酸蛋白磷酸酶(PTP)的专一抑制剂阻断(PlantCell and Environment 2000，231389-1395和科学通报2003，48(4)369-373)。PTK(酪氨酸蛋白激酶)/PTP催化的酪氨酸可逆蛋白磷酸化在动物及酵母细胞的信号传递中均起着非常重要的作用，例如PTP可以作为受体识别许多胞外信号，某些胞内PTP可以和激活的生长因子受体反应来调节细胞的生长和分化等。但是长期以来人们一直忽略了对植物酪氨酸蛋白磷酸酶的研究，认为植物细胞中不存在由PTK/PTP催化的酪氨酸蛋白可逆磷酸化系统，直到最近几年才偶有报道植物细胞中存在PTP，但对其功能还没有深入的了解。鉴于PTP专一抑制剂和还原剂可阻断干旱诱导的ABA积累，且在动物细胞中PTK/PTP催化的酪氨酸蛋白可逆磷酸化系统常常受到氧化还原的调控，因此认为对DTT敏感的PTP可能参与了水分亏缺诱导ABA积累的调控。ABA信号的起源问题即水分亏缺诱导ABA积累的分子机制问题是ABA信号传递的核心问题，也是提高植物抗旱性的关键问题。发明创造内容本发明的目的是提供一种参与调控ABA生物合成的玉米酪氨酸蛋白磷酸酶及其编码基因。本发明所提供的玉米酪氨酸蛋白磷酸酶编码基因ZmRSPTP1，是下列核苷酸序列之一1)序列表中的SEQ ID №1；2)编码SEQ ID№2蛋白质序列的核苷酸序列；3)与序列表中的SEQ ID №1限定的DNA序列具有90％以上同源性的DNA序列。本发明所提供的玉米酪氨酸蛋白磷酸酶ZmRSPTP1，是序列表中SEQ ID №2的氨基酸残基序列或将SEQ ID №2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与SEQ ID №2相同活性的由SEQ ID №2衍生的蛋白质。序列表中的SEQ ID №1由1122个碱基组成。序列表中SEQ ID №2是由373个氨基酸残基组成的蛋白质。
含有本发明基因的表达载体及细胞系均属于本发明的保护范围。
只要控制酪氨酸蛋白磷酸酶ZmRSPTP1的表达量及其活性，就能操纵ABA在植物体内的积累，从而解决植物的抗旱性问题。本发明的酪氨酸蛋白磷酸酶基因ZmRSPTP1在植物抗旱领域具有广阔的应用前景，可用于培育抗旱植物特别是抗旱玉米，其经济效益潜力巨大。


图1为蛋白纯化过程中各蛋白组分的SDS/PAGE电泳2为ZmRSPTP1-His融合蛋白初步纯化后的SDS-PAGE电泳3为PAO和DTT对融合蛋白ZmRSPTP1-His酶活性的影响柱状图
实施例1、PTP的提取和纯化及N-末端序列测定1)玉米胚芽鞘中总蛋白的提取玉米种子(农大4967)浸泡催芽后，播在装有蛭石和细纱混合物(2∶1)的8cm×30cm×60cm的盘中。28℃黑暗培养5天，当胚芽鞘长度为3cm左右时，取胚芽鞘进行如下各种实验。
200g胚芽鞘用3倍体积Buffer A(50mM MOPS pH7.4，2μg/ml亮抑制蛋白酶肽，2μg/ml pepatatin A，1mM PMSF，1mM EDTA，10％甘油，0.1％triton x-100)研磨匀浆后，4层纱布过滤，10000×g离心30分钟，上清液用Sephadex G-25脱盐，直接用于蛋白纯化。
2)用阴、阳离子交换柱及分子筛纯化玉米胚芽鞘中对DTT敏感的PTP组分①用阴、阳离子交换柱层析分离PTP组分(i)DEAE-Sepharose柱层析DEAE-Sepharose柱(3.5×20cm)用Buffer B平衡(50mM MOPS pH7.4，2μg/ml亮抑制蛋白酶肽，2μg/ml pepatatin A，1mM PMSF，1mM EDTA，5％甘油)，样品上柱后，用2000ml Buffer B预洗脱至流出蛋白浓度为零。1500ml 0-0.7M NaCL梯度洗脱，每管收集10ml，以pNPP为底物测定磷酸酶活性，将活性管溶液(DEAE洗脱液)合并。
(ii)SP-Sepharose柱层析上述DEAE洗脱液用Buffer C透析(50mM乙酸钠缓冲液，pH4.7，1mM PMSF，1mM EDTA，5％甘油)。SP-Sepharose柱(2.6×20cm)用Buffer C平衡，上样。Buffer C预洗脱至蛋白浓度为零。0-0.6M NaCL梯度洗脱。每管收集5ml，以pNPP为底物测定磷酸酶活性，将活性管溶液(SP洗脱液)合并。检测各SP洗脱液组分磷酸酶活性对DTT(1mM)的反应，将对DTT敏感的SP洗脱液组分用10KD超滤管浓缩至5ml。
②用分子筛层析纯化PTP组分将①中得到的PTP组分进行两次Sephacryl S-200分子筛层析。Sephacryl S-200(2.6×100cm)用Buffer C平衡，样品上柱，Buffer C洗脱，每管收集3ml。以pNPP为底物测定磷酸酶活性，将活性管溶液(S-200洗脱液)合并，10KD超滤管浓缩至0.5ml，过第二次分子筛Sephacryl S-200(1×80cm)，Buffer C洗脱，每管收集0.5ml。以pNPP为底物测定磷酸酶活性，将活性管溶液合并。
③PTP组分纯度的检测将步骤②得到的PTP组分按照常规方法用BIO-RAD蛋白小型胶系统进行SDS-PAGE(12％胶)后，用银染色。结果如图1所示，A为总蛋白，B为①中得到经DEAE-Sepharose分子筛层析后具有PTP酶活性组分经SDS-PAGE电泳结果；C为①中得到的经SPSepharose分子筛层析后具有DTT敏感的PTP组分经SDS-PAGE电泳结果；D为步骤②中得到的经两次Sephacryl S200分子筛层析后具有DTT敏感的PTP组分经SDS-PAGE电泳结果。银染色表明D泳道中的样品为一条分子量为42kD的蛋白带，说明蛋白已得到均一的纯化。
④对PTP组分进行酶活性检测总反应体系为50μl，其中含有35μl反应缓冲液(50mM MOPS，pH6.0，1mMEDTA，10％甘油，500μM PMSF)，5μl蛋白磷酸酶底物(2mM通用底物pNPP或1mM PTPase底物END(pY)INASL及磷酸酪氨酸)，10μl蛋白样品，加DTT使其终浓度为1mM。反应在25℃进行30分钟，加Pi分析试剂终止反应。释放的Pi以Malachite-molybdate染料显色，650nm测定吸收值。蛋白磷酸酶活性以单位时间单位蛋白样品释放Pi的量来计算。测得纯化后的蛋白磷酸酶活性为1200nmol pi min-1mg-1蛋白。该PTP组分命名为ZmRSPTP1(reducer sensitive PTP1)。
3)N-末端序列测定经上述步骤纯化得到的蛋白样品进行N-末端部分氨基酸测序，使用Edman降解法又称异硫氰酸苯酯法(简称PTH法)进行N-末端序列测定。得到的N-末端序列为MNCLQNLLKEPPIVGS。
实施例2、ZmRSPTP1编码的cDNA的克隆(1)玉米胚芽鞘总RNA的提取按照Invitrogen公司总RNA提取试剂盒(TRIzol Reagent)(货号15596-026)的方法进行玉米胚芽鞘总RNA的提取。
(2)玉米胚芽鞘mRNA的分离纯化按照Promega公司试剂盒(PolyAtract mRNA Isolation System III(withMagnetic Stand)货号Z5300)的方法进行玉米胚芽鞘mRNA的分离纯化。
(3)反转录合成按照Invitrogen公司的SuperScriptTMRNaseH-Reverse Transcriptase产品说明进行反转录。
(4)PCR扩增ZmRSPTP1以反转录合成的cDNA为模板，根据PTP的N-末端序列测定结果(MNCLQNLLKEPPIVGS)，从N端6个氨基酸及玉米密码子偏爱性设计8个上游引物如下ATGAACTGCTTGCAG；ATGAACTGCTTCCAG；ATGAACTGCCTCCAG；ATGAACTGCCTGCAG；AACTGCTTGCAGAAC；AACTGCTTCCAGAAC；AACTGCCTCCAGAAC和AACTGCCTGCAGAAC。下游引物为TTTTTTTTTTTTTTTA；TTTTTTTTTTTTTTTG和TTTTTTTTTTTTTTTC。PCR反应体系的组成为5μl 10×Taq buffer，4μl 10×dNTP，1μl 上游引物、1μl下游引物(上下游引物各一个进行不同组合，分开做PCR，共24个PCR反应)，1μl模板(约5ng)，0.5μl Ex-Taq酶，38.5μl H2O。PCR程序为
94℃ 3min 72℃ 5minPCR产物经QIAGEN GEL EXTRACTION KIT(#28704)回收纯化，送上海生工测序部测序。测得的ZmRSPTP1的核苷酸序列如序列表中序列1。ZmRSPTP1的氨基酸序列如序列表中序列2。在GenBank中进行蛋白BLAST，结果玉米ZmRSPTP1与拟南芥中的AtPTPKIS1及番茄中的LePTPKIS1有较高同源性，同源性分别达到62％及59％。
实施例3、在酵母细胞中体外表达ZmRSPTP1及活性检测(1)在酵母细胞中体外表达ZmRSPTP1①PCR扩增ZmRSPTP1编码基因以Upper和Lower为引物，分别在ZmRSPTP1编码基因上引入Sma I/Cla I位点，并在3’-端引入6个组氨酸。引物序列如下Upper5’-CTGCCCGGGATGAACTGCCTCCAGAACC-3’；Lower5’-TCAATCGATGTGGTGGTGGTGGTGGTGGCGCTCGGCGGC-3’。PCR程序为94℃ 3min 72℃ 5min②将回收后的PCR产物用Sma I/Cla I酶切，并回收。
③将酵母表达载体p426GAL1用Sma I/Cla I酶切，并回收。
④将分别酶切并回收后的ZmRSPTP1编码基因与p426GAL1连接，构建成玉米ZmRSPTP1编码基因的表达载体p426GAL1-ZmRSPTP1-6His。
⑤按照Gietz，RD.和RH.Schiestl的方法(Gietz，RD.and RH.Schiestl.(1995)Transforming Yeast with DNA.(Invited chapter)Methods in Molecular andCellular Biology.Vol 5，#5；255-269)转化酵母。
结果如图2所示，在酵母表达的融合蛋白，通过Invitrogen公司的ProBondTMPurification System初步纯化，得到42kD的蛋白带(图2箭头所示)，表明含有6×His标签的重组蛋白不仅在酵母中表达了，而且得到了纯化。图2中，A，B为初步纯化的ZmRSPTP1-His融合蛋白；M为标准分子量。另外通过常规免疫印迹也检测到ZmRSPTP1-DHA(Double Hemagglutinin)融合蛋白在酵母细胞中的表达。其中，检测DHA的一抗用Roche公司高亲和力的单克隆抗体3f10(#1867423)。
(2)ZmRSPTP1的活性检测按照实施例1中2)的④的方法对初步纯化的融合蛋白ZmRSPTP1-His进行PTP酶活性检测。结果如图3所示，表明得到很高酶活性(780nmol Pi mg-1protein min-1)的酪氨酸蛋白磷酸酶，而且酶活可被还原剂1mM DTT(dithiothreitol)抑制至少75％，被PTP专一抑制剂PAO(phenylarsine oxide)100μM抑制至少50％以上。图3中，C为对照；PAO为100μM PAO药剂处理；DTT为1mM DTT药剂处理。体外表达的ZmRSPTP1-His融合蛋白的酶特性与从玉米胚芽鞘中纯化到的还原剂敏感的PTP 42kDa蛋白特性完全一致。
序列表<210>2<211>1122<212>DNA<213>玉米属玉米(Zea mays L.)<400>1atgaactgcc tccagaacct gctcaaggag cctccaatcg tggggtccag gtcgatgagg60cggccctctc cgctgaatct ggcgatggtc cgcggcggca gtcgccgatc aaacaccgtc120aaaactttgc aggcccctgg ggcgtccact tccggtgccg agagcagcgc cgtggagatg180ggcaccgaga agtccgaagt gtacagcact aacatgacgc aggctatggg agcagcgttg240acatatagac atgaactcgg gatgaactac aatttcatac gcccagactt gattgtagga300tcctgcttac agagtccact tgatgttgat aagcttcgga agattggtgt caaaactgta360ttctgcttgc agcaagattc agatcttgaa tattttggag tcgacatccg tgccattcaa420gattattctc tacaattcaa agatattgtg cactgccgtg cggaaattag ggattttgat480gcttttgatt tgcgattgag gcttcctgct gtggttagca aattgcacaa acttatcaac540tgtaatggtg gtgtaacata tatacattgt actgctggac ttggaagagc tcctgctgtt600gcattggctt atatgttctg gattcttggg tacagtctca atgaaggaca tcggctgcta660cagagtaaaa gggcttgctt tccgaagttg gaagccatta agttggcaac tgctgacatt720ctgacaggat tatccaaaaa cacaatcact ttgaagtggg aagctgatgg ttcttcctct780gttgaaattt ctgggctcga cattggctgg ggtcagagaa ttcctttgac atatgatgag840gagaaaggag cttggtttct tgagaaagag ttgcctgaag gacggtatga atacaaatac900gtagtggatg gcaaatggct atgcaacgag catgagctga taacgaaacc gaatgctgac960ggccacgtga acaactatgt tcaggtctcc agagacggca cgagcgatga agagaaggag1020cttagggagc ggttgactgg tcgggaccct gatctcacgg accaggagag gctgatgatc1080agagagtact tggaacagta cgcggatgcc gccgagcgct ag 1122<210>2<211>373<212>PRT<213>玉米属玉米(Zea mays L.)
<400>2Met Asn Cys Leu Gln Asn Leu Leu Lys Glu Pro Pro Ile Val Gly Ser15 10 15Arg Ser Met Arg Arg Pro Ser Pro Leu Asn Leu Ala Met Val Arg Gly20 25 30Gly Ser Arg Arg Ser Asn Thr Val Lys Thr Leu Gln Ala Pro Gly Ala35 40 45Ser Thr Ser Gly Ala Glu Ser Ser Ala Val Glu Met Gly Thr Glu Lys50 55 60Ser Glu Val Tyr Ser Thr Asn Met Thr Gln Ala Met Gly Ala Ala Leu65 70 75 80Thr Tyr Arg His Glu Leu Gly Met Asn Tyr Asn Phe Ile Arg Pro Asp85 90 95Leu Ile Val Gly Ser Cys Leu Gln Ser Pro Leu Asp Val Asp Lys Leu100 105 110Arg Lys Ile Gly Val Lys Thr Val Phe Cys Leu Gln Gln Asp Ser Asp115 120 125Leu Glu Tyr Phe Gly Val Asp Ile Arg Ala Ile Gln Asp Tyr Ser Leu130 135 140Gln Phe Lys Asp Ile Val His Cys Arg Ala Glu Ile Arg Asp Phe Asp145 150 155 160Ala Phe Asp Leu Arg Leu Arg Leu Pro Ala Val Val Ser Lys Leu His165 170 175Lys Leu Ile Asn Cys Asn Gly Gly Val Thr Tyr Ile His Cys Thr Ala180 185 190Gly Leu Gly Arg Ala Pro Ala Val Ala Leu Ala Tyr Met Phe Trp Ile195 200 205Leu Gly Tyr Ser Leu Asn Glu Gly His Arg Leu Leu Gln Ser Lys Arg210 215 220Ala Cys Phe Pro Lys Leu Glu Ala Ile Lys Leu Ala Thr Ala Asp Ile225 230 235 240
Leu Thr Gly Leu Ser Lys Asn Thr Ile Thr Leu Lys Trp Glu Ala Asp245 250 255Gly Ser Ser Ser Val Glu Ile Ser Gly Leu Asp Ile Gly Trp Gly Gln260 265 270Arg Ile Pro Leu Thr Tyr Asp Glu Glu Lys Gly Ala Trp Phe Leu Glu275 280 285Lys Glu Leu Pro Glu Gly Arg Tyr Glu Tyr Lys Tyr Val Val Asp Gly290 295 300Lys Trp Leu Cys Asn Glu His Glu Leu Ile Thr Lys Pro Asn Ala Asp305 310 315 320Gly His Val Asn Asn Tyr Val Gln Val Ser Arg Asp Gly Thr Ser Asp325 330 335Glu Glu Lys Glu Leu Arg Glu Arg Leu Thr Gly Arg Asp Pro Asp Leu340 345 350Thr Asp Gln Glu Arg Leu Met Ile Arg Glu Tyr Leu Glu Gln Tyr Ala355 360 365Asp Ala Ala Glu Arg370


本发明公开了一种玉米酪氨酸蛋白磷酸酶基因及其编码蛋白与应用。其目的是提供一种参与调控ABA生物合成的玉米酪氨酸蛋白磷酸酶及其编码基因与应用。本发明所提供的玉米酪氨酸蛋白磷酸酶编码基因ZmRSPTP1，是下列核苷酸序列之一1)序列表中的SEQ ID №1；2)编码SEQ ID №2蛋白质序列的核苷酸序列；3)与序列表中的SEQ ID №1限定的DNA序列具有90％以上同源性的DNA序列。本发明还提供了该基因的编码蛋白即玉米酪氨酸蛋白磷酸酶ZmRSPTP1。本发明的酪氨酸蛋白磷酸酶基因ZmRSPTP1在植物抗旱领域具有广阔的应用前景，可用于培育抗旱植物特别是抗旱玉米，其经济效益潜力巨大。