专利名称：Sars流行性肺组织酵母菌疫苗和菌素及其制造方法SARS流行性肺组织酵母菌疫苗和菌素及其制造方法本发明至2003年4月18日在中国广州历时一个多月，由余国华成功鉴定并确认“非典”、SARS病原体是“流行性肺组织酵母菌”，本病是流行性肺组织酵母菌病，并拟定开发本病原体有关科学研究和生产系列制品(图1～5)图1是动物模型肺组织切片所见的病原体。图2是肺血管平滑肌的病原体，图3是肺组织肺泡中的病原体，图4是肺组织柱状上皮中大量病原体，图5是脑组织中病原体颗粒和球状孢子体，图6是病原体纯培养，也是制造SARS疫苗和菌素的原料。本发明提供一种由SARS流行性肺组织酵母菌(以下简称组织酵母菌)“SARS”流行性肺组织酵母菌疫苗”，(以下简称组织胞酵母疫苗)用上述同一组织酵母菌，制造“SARS流行性肺组织酵母菌素”(以下简称组织酵母菌素)对所检索的全部资料，均未发现与本发明同类或相关技术内容的产品及其生产方法。
SARS流行性肺组织酵母菌和菌素及其制造方法制造的组织酵母菌疫苗，用于预防组织酵母菌病感染，制造组织胞浆菌素，用于特异性诊断组织酵母菌病。本发明流行性肺组织酵母菌可用作科学研究，“非典”、SARS测试、和商业用途。除上述制造疫苗和皮试诊断试剂，亦可用其他方法处理后，制造特异性诊断试剂，以及应用本病原体组织酵母菌测试基因排列绘制基因图谱或其他科学研究、药物实验。1、技术关键组织酵母菌疫苗，主要通过菌株扩增、灭活、脱毒组织酵母菌(死菌)制造而成，其灭活方法是使组织酵母菌在水浴中或相当的加温环境中用100℃5-50分钟，或60-95℃，1-10小时灭活，采用1％-3％甲醛灭活和同时脱毒，达到灭活目的，并保持组织酵母菌疫苗抗原性良好。
2、技术方案组织酵母菌疫苗是用灭活和甲醛脱毒的方法制造组织酵母菌疫苗。同时还可将组织酵母菌营养控制，反复不断传代(在动物或培养基)或用其他人工的方法使组织酵母菌毒力下降，制造组织酵母菌减毒的活疫苗，用于上述组织酵母菌病感染的预防。
组织酵母菌疫苗的临床用量单位按含菌数计算，供皮下或肌肉注射的疫苗每次(瓶)为10×108/ml/支，用于滴鼻和喷喉气雾剂，其剂量为5×109/5ml。并制造组织酵母菌疫苗的系列剂型，气雾剂、滴鼻滴剂(液体)和用于舌下含的片剂、供皮下或肌肉注射针剂，以及冻干粉针剂等。采用组织酵母菌减毒活疫苗的剂量是灭活疫苗减量的2～20倍。
3、技术效果SARS流行性肺组织酵母菌病，当今被认为是一种烈性传染病，本发明研制组织酵母菌疫苗，彻底解决本病的传播漫延和易感者预防的最佳途径。世界公认，疫苗是最有效、最方便、最完全和最经济的预防传染病方法，组织酵母菌疫苗的研制成功，将对于全社会及至全人类的健康作出贡献。
组织酵母菌素其制造方法，是采用上述灭活的组织酵母菌，经反复多次离心洗涤，加入适量无菌溶剂，用超声波粉碎和反复冻溶后，用适当溶剂以1∶100-10000稀释，供特异性诊断组织酵母菌病皮试应用。
对于急性流行病病原学的证确诊断，是消除流行病的传染源和对患者的及时治疗以及预防的关键，组织酵母菌素研制成功，提供一种特异性诊断用品，对组织酵母菌病或疑似本病，快速确诊能使这些患者对症治疗，得到及时救治，早日康服。
为实现上述目标本发明采用技术方案如下组织酵母菌疫苗和组织酵母菌素的制造程序制造组织酵母菌疫苗种子系统生产用菌种采用种子批系统。从原始种子批借代，扩增后冻干保存为主种子批。从主种子批制备工作种子批。主种子批和工作种子批的各种特性与原始种子一致。工作种子批用于生产。
种子批菌种检定形态及培养特性将待检菌种接种于脂、改良沙保罗培养基或其他适宜培养基，均为组织胞浆菌，在血琼脂培养基上，菌落初呈球状，脑形、粉红色至棕色。
菌种传代及保存菌种冻干保存于2-8℃，主种子批自启开后传代不得超过5代。
原液制备生产用种子将工作种子批菌种启开后，接种于改良沙保罗或其他适宜培养基，置37℃培养传代，一般不超过24小时，由此制备适宜数量的生产用工作种子。
生产用培养基用pH7.0-7.4的营养琼脂和营养肉汤或国家药品管理当局批准的基他培养基。培养基中含对人体有害或其他过敏原物质。
菌种接种和培养采用大号玻璃瓶密闭式培养种法，接种后置37℃培养22-24小时，在培养物灭菌取样，涂片染色镜检、如发现杂菌，应废弃。
收集和杀菌培养结束后，收取菌液，直接加热杀菌或加入终浓度为1.0-％-1.2％的甲醛溶液，置37℃，7天，取样种于改良沙保罗培养基和虎红琼脂做无菌试验，4℃离心洗涤去甲醛后，加无菌PBS到原量，置2-8℃保存。
半成品配制单批或多批检定合格的原液合并，用PBS稀释(磷酸缓冲液)，与原液混合，使每1ml含1-5×109。
组成及用途本品系用组织胞浆菌培养后，经加热灭活、脱毒处理，制成每瓶含菌1-5×108ml，不含防腐剂，用于预防组织酵母菌感染的生物制剂。
取未分装的组织酵母菌原液，用超声滤粉碎和反复冻溶后，以1∶100-10000的稀释，制造成为“组织酵母菌素”供组织酵母菌感染患者作皮试之用。“组织酵母菌疫苗”和“组织酵母菌素”的具体制造方法如下；组织酵母菌疫苗和组织酵母菌素制造方法1.定义、组成及用途本品系用组织酵母菌培养后，经甲醛溶液灭活、脱毒处理、制成每瓶含菌1-5×109/ml，不含防腐剂制成。用于SARS流行性肺组织酵母菌病的预防。
2.制造2.1基本要求2.1.1设施与生产质量管理按中国《药品生产质量管理规范》要求实施。中国化学制药工业协会，化学工业出版新，2001年P14-3796-105。
2.1.2原料及辅料符合现行《中国生物制品主要原辅材料质控标准》的要求。未纳入上述标准的化学试剂，不低于化学纯。中国生物制品标准化委员会，化学工业出版新2000年版P49-62。
2.1.3生产用水生产用水符合国家饮用水标准，纯化水及注射用水符合现行《中国药典》2000年版标准。《中国生物制品主要原辅材料质控标准》2000年版，中国生物制品标准化委员会编，P1-2。
2.1.4生产用器具直接用于生产的金属或玻璃等器具，严格清洗及去热源处理或灭菌处理。
2.15生产及检定用动物家兔、小鼠、豚鼠符合清洁级。
2.2菌种2.2.1菌种名称及来源制造用菌种由当地直接检样分离获得并冻干保存或国家指定的单位保管和分发。
2.2.2种子批的建立生产用菌种采用种子批系统。从原始种子批传代，扩增后冻干保存为主种子批。从主种子批制备工作种子批。主种子批和工作种子批的各种特性与原始种子批一致。工作种子批用于生产。
2.2.3种子批菌种检定2.2.3.1形态及培养特性将待检菌种接种于改良沙保罗琼脂或其他适宜培养基，为组织酵母菌，在血琼脂培养基上菌落初呈球状、脑形、粉红色至棕色。
2.2.3.2生化反应所用菌种均用细菌生化鉴定系统，鉴定为组织酵母菌。
2.2.3.3血清凝集试验用37℃培养20-24小时的培养物，以1％甲醛灭活，用无菌生理氯化钠溶液稀释，使其含菌10×108ml，与组织酵母菌免疫诊断血清，充分混合后，置37℃过夜，以肉眼见到凝集之血清最高稀释度为凝集反应效价。凝集效价应不低于原血清效价之半。
2.2.3.4毒力试验采取组织酵母菌分别用37℃培养20-24小时的改良沙保罗液体培养物，以无菌生理氯化钠溶液稀释成含菌1.2×109/ml、8×108ml、4×108/ml、2×108/ml等浓度菌液，腹腔注射体重14-16g小鼠，同性或雌雄各半，每个浓度菌液使用至少5只小鼠，每只0.5ml，观察3-7天，计算LD50。
2.2.3.5毒性试验分别采用37℃培养20-24小时的改良沙保罗液体培养物混悬于生理氯化钠溶液内，70℃加温2小时(或其他方法)杀菌，不加防腐剂。杀菌试验合格后，按一定比例混合，稀释成每1ml含菌4.0×109、2.0×109及1.0×109共3个浓度，每个浓度菌悬液0.5ml腹腔注射体重16-18g小鼠5只，观察3天，注射1.0×109至2.0×109个死菌体的小鼠应全部生存。
2.2.3.6抗原性试验选体重2kg左右之家兔至少3只，以上述免疫力试验用菌液注射家兔，注射8次，末次注射后7-10天，采血做定量凝集试验，测定效价。2/3家兔血清凝集价应不低于1∶2560。
2.2.3.7免疫力试验用终浓度不超过1.1％±0.1％的甲醛溶液杀菌，以不加防腐剂的菌液稀释，使其含菌2.0×109ml。选体重14-16g小鼠至少30只，每次皮下注射菌液0.5ml，间隔5天注射1次，共注射3次，末次免疫后7-10天，用2个MLD毒菌，观察3天，对照组小鼠死亡数应不低于80％，免疫组小鼠保护率应不低于70％。
2.2.4菌种传代及保存2.2.4.1菌种冻干保存于2-8℃，主种子批自启开后传代不得超过5代。
2.2.4.2生产前检查菌种特性，合格后用于生产。
2.3原液制备2.3.1生产用种子将工作种子批菌种启开后，接种于改良沙保罗培养基或其他适宜培养基，置37℃培养传代，一般不超过24小时，由此制备适宜数量的生产用工作种子。
2.3.2生产用培养基用pH7.2-7.4的改良沙保罗培养基或国家药品管理当局批准的其他培养基。培养基中不含对人体有害或其他过敏原物质。
2.3.3菌种接种和培养采用密封三角烧瓶种法，接种后置37℃摇床培养22-24小时，在培养过程中灭菌前取样做纯菌试验，涂片染色镜检、如发现杂菌，应废弃。
2.3.4收集和杀菌培养结束后，立即加热100℃，10-30分钟灭菌，然后加入终浓度为1.0％-1.2％的甲醛溶液，置37℃，7天，取样种于改良沙保罗培养基做无菌试验，4℃离心洗涤去甲醛后，加无菌PBS洗二次PBS补至原量，置2-8℃保存。
2.4原液检定按3.1项进行。
2.5半成品配制单批或多批检定合格的原液合并，用PBS稀释，与原液混合，使每1ml含组织胞浆菌1×109。
2.6半成品检定按3.2项进行。
2.7分批按本版规程通则<生物制品分批规程>进行。《中国生物制品规程》2000年版，生物制品标准化委员会编，P132.8分装或冻干。
按本版规程通则<生物制品分装规程>进行。《中国生物制品规程》2000年版，生物制品标准化委员会编，P14
2.9规格本品规格为每小瓶1-5×109/ml，内含适量保护剂。
2.10包装按本版规程通则<生物制品包装规程>进行。《中国生物制品规程》2000年版，生物制品标准化委员会编，P163检定3.1原液检定3.1.1无杂菌。
3.1.2无菌试验按本版规程通则<生物制品无菌试验规程>A项进行。《中国生物制品规程》2000年版，生物制品标准化委员会编，P29-343.1.3浓度测定参考“中国细菌浊度标准”进行浓度测定，相当每1毫升含菌应为1×109稀释时按此浓度计算，误差不超过10％。
3.1.4原液保存原液静置保存于2-8℃。
原液采集保存期，自原液合并之日起不超过4个月。保存期自采集灭菌之日起不超过6个月。
3.2半成品检定3.2.1无菌试验按本版规程通则<生物制品无菌试验规程>A项进行。《中国生物制品规程》中国生物制品标准化委员会编，P29-343.2.2制剂浓度每1ml含组织胞浆菌1×109。
3.3成品检定3.3.1鉴别试验与本菌的特异性免疫血清进行玻片凝集试验，应呈明显凝集反应。
3.3.2外观为白色混悬液或白色冻干粉针剂、溶解后应为乳白色混悬液，不应含有摇不散的凝块或异物。
3.3.3化学检定按本版规程附录<生物制品化学及其他检定方法>进行。《中国生物制品规程》中国生物制品标准化委员会编，P669-696。
3.3.3.1PH值为6-7。
3.3.3.2游离甲醛含量不应高于0.1g/L。
3.3.3.3乳糖按现行《中国药典》2000年版，中国生物制品标准化委员会编P600-603进行。含乳糖。
3.3.4无菌试验按本版规程通则<生物制品无菌试验规程>A项进行。《中国生物制品规程》2000年版，中国生物制品标准化委员会编，P29-34。
3.3.5异常毒性试验按本版规程通则<生物制品异常毒性试验规程>进行。小鼠注射0.5ml，豚鼠注射5ml。《中国生物制品规程》2000年版，中国生物制品标准化委员会编，p40
3.3.6浓度测定用“中国细菌浊度标准”进行浓度测定，每小瓶含组织酵母菌1-5×109/ml。
3.3.7质量标准适应症接种后能提高机体特异性免疫，用于预防组织酵母菌病感染。
组织酵母菌素的制造方法在完成组织酵母菌疫苗的(3、1、4)制造程序基础上，取上述合并后的组织酵母菌原液离心洗涤三次，用超声波充分粉碎，并同时在-100℃以下反复冻溶三次，取出，4℃ 12000次/分离心一小时，弃沉淀，取上清，用注射用水1∶100～10000稀释，通过无菌试验，异常毒性试验，调pH6-7，供SARS流行性肺组织酵母菌病或凝似组织酵母菌病患者皮肤试验之用，每次0.1ml，皮内注射。


本发明提供一种采用SARS流行性肺组织酵母菌为原料通过菌种扩增、灭活、脱毒等程序，制成SARS流行性肺组织酵母菌气雾剂、片剂、注射用针剂预防疫苗。用于SARS流行性肺组织酵母菌感染特异性预防。采用上述同源的SARS流行性肺组织酵母菌原液、经洗涤、超声粉碎和反复冻溶以制成1∶100～10000组织酵母菌素，供SARS流性肺组织酵母菌病或疑似患者特异性诊断之用。本菌或作科学研究、“非典”基因序列测试等用途。