专利名称：木聚糖酶SoxB及其编码基因的制作方法木聚糖(Xylan)是一类分子结构变化范围很大的多糖，从仅由β _1，4糖苷键连接的多聚木糖线性分子到高度分支的异聚多糖。木聚糖是植物半纤维素的重要组分，约占植物总糖的三分之一，是自然界中除纤维素以外含量最丰富的再生生物资源。木聚糖酶(E.C3.2.1.8)是一类以内切方式降解木聚糖分子中β_1，4-木糖苷键的酶系。近年来，木聚糖酶在食品、纺织、饲料、能源工业中都显示了广阔的应用前景。特别是在制浆造纸工业中该酶用于纸浆漂白，能够增加纸张白度，改善纸张性能，降低漂白用化学物质的用量，从而有效减轻造纸业对环境的污染。根据木聚糖酶催化区域的氨基酸组成和疏水簇序列分析，可将其归为F/10和G/11两大家族。相比于F/10家族木聚糖酶，G/11家族木聚糖酶具有分子量较小，易于穿透纤维素网状结构以及不含纤维素酶活性的特点，从而更适合应用于纸浆漂白工艺中。热稳定性是木聚糖酶工业生产、储藏、运输以及应用过程中追求的又一重要特性。因此，获得热稳定性的木聚糖酶对于木聚糖酶的应用具有重要的实践价值。
本发明的一个目的是提供一种热稳定性高的木聚糖酶(蛋白质)及其编码基因与应用。 本发明所提供的蛋白质，其氨基酸序列如序列表中序列4所示。本发明所提供的蛋白质的编码基因，为任何编码上述蛋白的DNA，具体为核苷酸序列如序列表中序列3所示的DNA。含有上述任一所述编码基因的重组载体、重组菌、转基因细胞系、重组病毒或表达盒也属于本发明的保护范围。上述任一所述蛋白质在作为木聚糖酶中的应用也属于本发明的保护范围。实验证明，本发明的木聚糖酶，在保持原有木聚糖酶特性的基础上，其半衰期显著延长，Tm值显著增高，最适温度也显著提高。因此，本发明的木聚糖酶在木聚糖应用领域将有广阔的应用前景。
图1 为突变体 SOXB-M2 和 SoxB 热稳定性比较(Α)Τ1/2 70°C (B) T1/2 80°C (C) Tm 值比较⑶最适温度比较。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。撤揽绿链霉菌Streptomycesolivaceovirdis CGMCC N0.4.1430购自中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)。pET-28a(+)购自 Novagen，产品目录号为 69865-3 ；实施例1、热稳定性提高的木聚糖酶SoxB—、木聚糖酶SoxB的制备及热稳定性检测(一)酶制备实验组:1、PCR扩增木聚 糖酶SoxB的编码基因以橄榄绿链霉菌S.0livaceovirdis (CGMCC 4.1430)的基因组DNA为模板，用引物SoxB-PU SoxB-P2 (表I)进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。2、酶切、连接用Nde I和EcoRI双酶切PCR扩增产物，与预先使用Nde I和EcoRI双酶切的pET-28a(+)进行连接，得到重组载体；3、转化、筛选以及测序验证用氯化钙化学转化法将重组质粒转化至大肠杆菌BL21 (DE3)，用含有卡拉霉素(50 μ g/ml)的LB培养基进行筛选培养，挑取单菌落，并进行扩大培养和提取质粒，进行测序验证.结果插入基因的序列(即SoxB编码基因)如序列表中序列I所示；该序列编码序列2所示蛋白(即SoxB蛋白)。证明构建的质粒及重组菌正确。将阳性克隆记作BL21-pET-SoxB,阳性质粒记作 pET-SoxB。4、酶的表达挑取BL21-pET_SoxB单菌落接入含有卡拉霉素(50 μ g/ml)的LB培养基中，于37°C过夜培养。将过夜培养物接种于IL含有卡拉霉素(50 μ g/ml)的LB培养基，37°C剧烈振荡(200rpm)培养，至发酵液的0D_值达到0.6-0.8左右，再向发酵体系中加入IPTG(终浓度0.5mM)，30°C条件下再培养6_8小时。发酵完毕后，5000rpm离心15分钟，收集菌体；用pH6.0的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液重悬菌体，超声波破碎后12，OOOrpm离心15min。收集上清液，即为含有目的蛋白的粗酶液。5、酶的纯化采用镍柱亲和层析进行纯化，在Amersham公司的AKTA FPLC系统中用Iml装量的HiTrap chelating HP column(镍柱)纯化上清。非变性镍柱结合缓冲液I用于平衡纯化柱体和上样。蛋白上样量为10ml，流速设为lml/min。用20%非变性镍柱洗脱缓冲液(即非变性镍柱结合缓冲液I和非变性镍柱洗脱缓冲液II的混合溶液，非变性镍柱结合缓冲液I和非变性镍柱洗脱缓冲液II的体积比为80: 20)进行洗涤，去除非特异性结合的杂蛋白。用80%非变性镍柱洗脱缓冲液(即非变性镍柱结合缓冲液I和非变性镍柱洗脱缓冲液II的混合溶液，非变性镍柱结合缓冲液I和非变性镍柱洗脱缓冲液II的体积比为20: 80)进行洗脱，收集含洗脱峰的洗脱液，SDS-PAGE检测洗脱液中样品纯度。非变性镍柱结合缓冲液1:0.02M磷酸盐缓冲液，0.5M氯化钠，pH7.4 ；非变性镍柱洗脱缓冲液I1:0.02M磷酸盐缓冲液，0.5M氯化钠，0.5M咪唑，pH7.4。
6、目的酶液的酶活检测木聚糖酶酶活的测定:木聚糖酶酶活的测定采用DNS法。取40 μ I适当稀释的酶液，加入360 μ 11 %木聚糖(Sigma birchwood xylan)溶液,50 °C温育IOmin,加入600 μ IDNS溶液后，99°C温育15min，冷却到室温后540nm处测定吸光值。酶活定义:每分钟水解木聚糖产生I μ mo I木糖的酶量定义为一个酶活单位。1%木聚糖(Sigma birchwood xylan)溶液的组成:Ig木聚糖溶于100mL20mM朽1檬酸-柠檬酸钠缓冲液(PH6.0)中。DNS溶液的组成:50g 3，5_ 二硝基水杨酸溶于4L水中，不断搅拌，缓缓加入80gNa0H,使之完全溶解，继续搅拌，将1500g酒石酸钾钠分数次加入，并小心加热，溶液最高温度不超高45°C。冷却至室温后定容至5L。如果溶液不澄清，用Whatman I号滤纸过滤，然后棕色瓶室温贮藏。制作DNS标准曲线，将酶 液测定结果与DNS标准曲线比对，得到酶液中酶活量。对照组:同时将空载体pET_28a(+)转化至大肠杆菌BL21 (DE3)，筛选验证，得到含有空载体pET-28a(+)的阳性克隆，记作BL21-pET-28a(+)，作为对照菌。按照上述步骤将对照菌进行酶的表达和纯化，对纯化得到的液体进行酶活检测。实验设3次重复，实验组检测均具有木聚糖酶活性，而对照组均未检测到木聚糖酶酶活。(二)酶热稳定性的检测取在特定温度下处理不同时间的木聚糖酶酶液进行剩余酶活的测定。根据剩余酶活曲线计算其半衰期(t1/2)。剩余酶活) = P/PmaX*100%。其中P为木聚糖酶在70°C或80V条件下分别处理不同时间，取样后迅速置于冰上，在50°C，pH6.0条件下测定的酶活。Pmax为木聚糖酶未进行热处理在50°C，pH6.0条件下测定的酶活。半衰期(t1/2)的定义:酶失活至原来活性一半时所需时间。实验设3次重复。(三)Tm值测定差示扫描量热仪[Nano DSC (TA instruments)]测定木聚糖酶Tm值。酶蛋白的变性温度(Tm值)定义:是在连续升温的过程中，50%蛋白发生变性时所对应的温度。DSC测定的升降温速率为1°C/min,木聚糖酶蛋白浓度为1.0mg/mL。为防止在升温过程中样品的蒸发，所有的DSC实验均维持3atm的压力。实验数据用Nano DSC自带的DSCRun软件进行分析处理。蛋白质DSC曲线的吸热峰所指征的温度即为该蛋白的Tm值。实验设3次重复。(四)最适温度比较木聚糖酶在不同温度下的酶活，测定其最适温度。最适温度的测定是在20mM柠檬酸缓冲液(PH6.0)中于不同温度下(30-90°C )进行酶促反应，测定木聚糖酶酶活。实验设3次重复。二、含有五个氨基酸突变位点的木聚糖酶突变体(SoxB-M2)的制备及热稳定性检测(一 )木聚糖酶突变体(SoxB_M2)的制备
实验组:1、重叠延伸PCR扩增SoxB_M2基因(I)以pET-SoxB质粒为模板，以Pl和SoxB_P2为引物扩增SoxB_M2基因上游片段，以P2和SoxB-Pl为引物扩增SoxB-M2基因下游片段。(2)胶回收步骤(I)中扩增的上下游片段，并以回收的上下游片段为模板，以Pl和P2为引物，PCR扩增得到SoxB-M2全长基因片段。2、酶切、连接用NdeI和EcoRI双酶切重叠延伸PCR扩增产物，与预先使用NdeI和EcoRI双酶切的pET-28a(+)进行连接，得到重组载体；3、转化、筛选以及测序验证用氯化钙化学转化法将重组质粒转化至大肠杆菌BL21 (DE3)，用含有卡拉霉素(50 μ g/ml)的LB培养基进行筛选培养，挑取单菌落，并进行扩大培养和提取质粒，进行测序验证，结果获得序列表中序列3所示基因(编码序列4所示蛋白)，表明得到插入基因序列正确的阳性克隆；将阳性克隆记作BL21-pET-SoxB-M2，将阳性质粒记作pET-SoxB-M2。序列4所示蛋白(即SoxB木聚糖酶5个氨基酸共同突变体)与序列2所示蛋白(即SoxB木聚糖酶)相比，存在以下差别:序列4自N端起第11位氨基酸突变成Y、自N端起第12位氨基酸突变成H，自N端起第13位氨基酸突变成D，自N端起第15位氨基酸突变成Y，自N端起第16位氨基酸突变成F。也可按照其他常规方法制备得到序列3所示基因，具体如人工合成。

4、酶的表达挑取BL21-pET-SoxB_M2单菌落接入含有卡拉霉素(50 μ g/ml)的LB培养基中，于37°C过夜培养。将BL21-pET-SoXB-M2过夜培养物接种于IL含有卡拉霉素(50 μ g/ml)的LB培养基，在37°C剧烈振荡(200rpm)培养，至发酵液的0D_值达到0.6-0.8左右，再向发酵体系中加入IPTG(终浓度0.5mM)，30°C条件下再培养6_8小时。发酵完毕后，5000rpm离心15分钟，收集菌体；用pH6.0的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液重悬菌体，超声波破碎后12，OOOrpm离心15min。收集上清液，即为含有目的重组蛋白的粗酶液。5、酶的纯化方法与实验一中所述相同。6、目的酶液的酶活检测。方法与实验一中所述相同。对照组:同时将空载体pET_28a(+)转化至大肠杆菌BL21 (DE3)，筛选验证，得到含有空载体pET-28a(+)的阳性克隆，记作BL21-pET-28a(+)，作为对照菌。按照上述步骤将对照菌进行酶的表达和纯化，对纯化得到的液体进行酶活检测。实验设3次重复，实验组检测均具有木聚糖酶活性，而对照组均未检测到木聚糖酶酶活。(二)酶热稳定性的检测方法与实验一中所述相同。实验设3次重复。(三)Tm值测定
方法与实验一中所述相同。实验设3次重复。(四)最适温度方法与实验一中所述相同。实验设3次重复。上述实验一和实验二的结果表明SoxB_M2的热稳定性显著提高。在70°C条件下，SoxB-M2的半衰期提高至509min，是SoxB热稳定性的140倍(图1A和表2)。在80°C条件下，SoxB-M2的半衰期为23min，而SoxB由于在80°C条件下迅速失活，从而无法测定其在80°C条件下的半衰期(图1B)。DSC实验也表明，SoxB-M2的Tm值高达84.5°C，比SoxB的Tm值高15.4°C (图1C和表2)。同时，SoxB-M2的最适温度高达80°C，较SoxB提高15°C (图1D)。表I用于克隆木聚糖酶及其突变基因的引物


本发明公开了一种木聚糖酶SoxB及其编码基因。该木聚糖酶SoxB为氨基酸序列如序列表中序列4所示的蛋白质。实验证明，本发明木聚糖酶，在保持原有木聚糖酶特性的基础上，其半衰期显著延长，Tm值显著增高，最适温度也显著提高。因此，本发明的木聚糖酶在木聚糖应用领域将有广阔的应用前景。