丹参总酚酸的制备方法及其用途制作方法

魏峰, 岳洪水, 李德坤, 孙江晓, 叶正良, 李旭

2003年12月3日

2002年5月23日

2002年5月23日

天津天士力制药股份有限公司

A61P1/16GK1459448SQ0211792

酚酸 丹参 用途

1.一种丹参总酚酸的制备方法，其特征在于，包括如下步骤，(a)丹参用水提取，(b)提取液用聚酰胺层析柱分离，(c)洗脱液用大孔吸附树脂层析柱分离2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(a)中还包括，提取液调pH至酸性后，过滤；步骤(b)中还包括，滤液通过聚酰胺层析柱，用水冲洗至pH值为中性，再用弱碱性水溶液洗脱，收集碱洗脱液；步骤(c)中还包括，步骤(b)中的碱洗脱液，调PH值到酸性后，通过大孔吸附树脂层析柱，先用水冲洗至pH值为中性，再用含水或无水低级醇洗脱，收集洗脱液，洗脱液减压浓缩至无醇，干燥3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(a)中用水加热提取2～4次，每次0.5小时～2小时4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(a)中水提取的温度为60～100℃5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(a)中水提取的温度为90～100℃6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(a)中提取液用酸调pH值至4以下，步骤(c)中的碱洗脱液用酸调pH值至4以下7.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(a)中提取液用酸调pH值至2以下，步骤(c)中碱洗脱液用盐酸或硫酸调pH值至2以下8.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(b)中用0.01％～2％弱碱水溶液洗脱9.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(b)中用0.08％～0.5％碳酸氢钠水溶液洗脱10.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(c)中所述大孔吸附树脂为苯乙烯型11.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(c)中用含水C1～C5低级醇洗脱12.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(c)中用含水乙醇洗脱13.根据权利要求11或12所述的制备方法，其特征在于，含水C1～C5低级醇或乙醇的洗脱液浓度为40％～95％14.根据权利要求11或12所述的制备方法，其特征在于，含水C1～C5低级醇或乙醇的洗脱液浓度为60％～95％15.根据权利要求11所述的制备方法，其特征在于，洗脱液乙醇的浓度为95％16.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(c)中用无水C1～C5低级醇洗脱17.根据权利要求16所述的制备方法，其特征在于，步骤(c)中用无水乙醇洗脱18.用权利要求2所述方法制备的丹参总酚酸19.以权利要求18的丹参总酚酸为活性成分的可以制成任何一种药剂学上所说的剂型的药物组合物20.根据权利要求18的丹参总酚酸，其特征在于，其中的总酚酸含量大于或等于80％，其中的丹酚酸B含量大于或等于50％21.根据权利要求18所述的丹参总酚酸在制备治疗心脑血管疾病、肾病、肝病、肺炎、肺心病、胰腺炎、糖尿病、颈椎病、眼底血管性疾病、眼底神经性疾病、偏头痛、慢性胃炎、眩晕、骨伤科疾病、高原疾病、老年痴呆症的药物中的应用

本发明涉及中药提取物，更具体地说，涉及从中药丹参中提取精制而成的丹参总酚酸本发明的丹参总酚酸的制备方法，基本上是由丹参用水热提，聚酰胺柱分离，大孔吸附树脂柱分离几个步骤组成本发明通过下述技术方案予以实施(a)丹参去杂质、切成小块或粉碎成粗粉，用水热提，提取液调pH至酸性后，滤过；(b)滤液上聚酰胺柱，用水冲洗至pH值为中性，再用弱碱性水溶液洗脱，收集碱洗脱液；(c)碱洗脱液调PH值到酸性后，上大孔吸附树脂柱，先用水冲洗至pH值为中性，再用含水或无水低级醇洗脱，收集洗脱液；(d)洗脱液减压浓缩至无醇，干燥，即得丹参总酚酸其中步骤(a)中，用水加热提取2～4次，每次0.5小时～2小时，提取的温度为60～100℃(最佳为90～100℃)；提取液用酸调pH值至4以下(最佳为2以下)步骤(b)中，洗脱液弱碱性水溶液的浓度优选范围为0.01％～2％(最佳范围为0.08％～0.5％)；聚酰胺材料为聚己内酰胺(尼龙-6)步骤(c)中，大孔吸附树脂为苯乙烯型；碱洗脱液用酸调pH值到4以下(最佳为2以下)；低级醇的碳原子范围为C1～C5，如甲醇、乙醇等，其洗脱浓度为40％～95％(最佳为60％～95％)，从工业化生产的安全、低成本和工艺简化上考虑，采用95％乙醇进行洗脱，实际效果也令人满意依本发明的方法制成的丹参总酚酸，可制成任何一种药剂学上所说的剂型，也可配合其他药物或组分一起制成制剂使用本发明与现有技术相比有如下优势1.易于产业化本发明克服了现有技术中需要大量浓缩水即不易产业化的难点，在不加热、不减压的情况下就可以祛除大量水，优化了工艺步骤和条件，不消耗能源，不污染环境，无论从技术条件还是从绿色环保来看，均使产业化易于实现2.有效成分损失少本发明避免了现有技术中因醇沉而造成有效成分的部分损失；也避免了现有技术中因水溶液浓缩而对丹参酚酸化合物稳定性的影响，减少了有效成分的分解、损失，保证了产品的稳定性3.产率高现有技术的成品(丹参总酚酸干粉)收率一般为生药量的2～3％；而本发明的成品收率一般在4％以上，明显高于现有技术所采用的方法，且成品中的总酚酸百分含量80％以上，杂质少，质量高4.成本低本发明不需要在加热、减压的情况下浓缩大量的水，有效降低了能耗，降低了生产成本；本发明的丹参总酚酸产率高，且丹参总酚酸含量与现有技术的含量相近或高于现有技术的含量，即同样的生药量可生产出更多质量相同或质量更高的产品成本的降低，不仅使产业化更加容易，而且能为患者带来更多的利益，从而产生巨大的社会效益5.动物实验研究也说明了依本发明的方法制备的丹参总酚酸的有益效果实验例丹酚酸对大脑中动脉凝闭大鼠脑缺血的保护作用1.试验材料1)动物Wistar大鼠，购自北京医科大学动物所，雄性，体重200～220克，许可证编号SCXK(京)2002-0032)试剂水合三氯乙醛，中国辽宁沈阳试剂厂生产，批号，920401红四氮唑(TTC)，北京化工厂生产，批号，8109113)仪器高频电刀，北京医用电子仪器厂SXP-1B手术显微镜，上海医用光学仪器厂4)被测药物总丹酚酸(天士力)，按本发明方法制备；总丹酚酸(药物所)，中国医学科学院药物所提供，按中国专利(申请号01142288.2，申请日2001年9月)的方法制备；香丹注射液，雅安三九药业有限公司生产，批号，010901，作为对照药品5)被测药物配制方法及给药途径总丹酚酸，香丹注射液均用灭菌生理盐水稀释，配成所需浓度，总丹酚酸10mg/kg和20mg/kg舌下静脉给药，香丹注射液1ml/kg(相当于1g/kg)，舌下静脉给药以上药物均于缺血后30分钟舌下静脉给予6)试验组的设置假手术对照组，缺血对照组，总丹酚酸(药物所)10mg/kg和20mg/kg组，总丹酚酸(天力士)10mg/kg和20mg/kg组，2.实验方法1)大鼠大脑中动脉阻断(电凝闭)脑缺血法进入试验的雄性大鼠腹腔注射三氯乙醛350mg/kg麻醉，左侧位固定在鼠板上，在手术显微镜下沿外耳道与眼眦连线中点切开皮肤，暴露出颧弓，用咬骨钳咬去颧弓，并沿颅骨剪断筋膜，暴露出颥前窝，用小牵张器将磷状骨和下颌骨间距撑开，于颅骨底开颅窗，暴露出大脑中动脉，用高频电刀烧断，以阻断血流，造成局部脑缺血30分钟后进行舌下静脉给药后回笼饲养室温严格控制在24～25℃2)脑梗塞体积测定大鼠中脑动脉阻断24小时后断头取脑将剥离完整的大脑放入4℃冰箱内盛有生理盐水的小杯中10分钟后去嗅球、小脑及低位脑干，沿冠状面切为五片，立即放入含有1.5ml 4％红四氮唑(TTC)及0.1ml 1mol/L磷酸氢二钾的5ml染色液中，避光在37℃水浴中温孵30分钟取出脑片放入10％福尔马林中固定正常组织为玫瑰红色；缺血组织呈白色用重量求积法测量梗塞面积，计算梗塞区域占大脑半球面积的百分比3)脑水份含量的测定大鼠中脑动脉阻断后24小时，处死动物，取出全脑，将剥离完整的大脑去嗅球、小脑及低位脑干后称重(此为脑湿重)再放于烤箱中105℃烤至恒重(约48小时)，再称重(此为脑干重)脑水含量＝(脑湿重-脑干重)/脑湿重×100％4.实验结果丹酚酸对大脑中动脉凝闭大鼠脑缺血的保护作用 注(1)**P＜0.01，*P＜0.05，双侧检验，与缺血对照比较#P＜0.05，单侧检验，与缺血对照比较(2)对照药品香丹注射液1ml/kg相当于含生药量1g/kg；丹酚酸(天力士)10mg/kg相当于含生药量0.25g/kg(以收率为4％计算)；丹酚酸(天力士)20mg/kg相当于含生药量0.5g/kg(以收率为4％计算)5.结论采用大脑中动脉凝闭的方法造成大鼠脑缺血损伤，观察中国医学科学院药物研究所生产的丹酚酸与天津天士力制药股份有限公司生产的丹酚酸对脑缺血损伤的保护作用结果显示，脑缺血后30分钟静脉给药，10mg/kg和20mg/kg，两种丹酚酸均可以明显改善缺血引起的脑水肿和脑梗塞、并且在相同剂量下两种药物作用相同表明两种丹酚酸具有相同的抗脑缺血损伤作用用本发明方法所制备的丹参总酚酸，可制成任何一种药剂学上所说的药物剂型，这些药物剂型可以是，片剂、胶囊、颗粒剂、口服液、缓释制剂、控释制剂、凝胶剂、软膏剂、油膏剂、霜剂、栓剂、注射剂、粉针剂、贴剂、滴丸、混悬剂等用本发明方法所制备的丹参总酚酸，可应用于制备治疗心脑血管疾病、肾病、肝病、肺炎、肺心病、胰腺炎、糖尿病、颈椎病、眼底血管性疾病、眼底神经性疾病、偏头痛、慢性胃炎、眩晕、骨伤科疾病、高原疾病、老年痴呆症等的药剂中对比例按专利申请文献(中国专利，申请号01142288.2，申请日2001年9月)的方法制备丹参总酚酸丹参5kg粉碎成粗粉，加去离子水在100℃加热提取3次第一次加30L水，加热1小时；第二、三次各加15L水分别加热1/2小时提取液在50℃减压浓缩至5L，冷却后加95％乙醇14L，静置过夜，过滤滤液在50℃减压回收乙醇，所得浓缩液通过RA型大孔吸附树脂(以苯乙烯，二苯乙烯为主体，干树脂量2kg)，用去离子水洗至流出液无α-萘酚反应，继续用50％乙醇洗脱至洗脱液加三氯化铁铁氰化钾试剂无明显的酚羟基反应洗脱液在50℃减压浓缩后置于冰箱过夜，滤过即得丹参总酚酸提取液，以2％氢氧化钠溶液调节pH值至6.5后冷冻干燥，即得丹参总酚酸干粉114g成品收率为生药量的2.3％，经检测其成品含总酚酸83.72％，丹酚酸B为54.41％丹参总酚酸和丹酚酸B的检测方法按专利申请文献(中国专利，申请号01142288.2，申请日2001年9月)的方法进行测定(1)丹酚酸B用HPLC法测定，检测波长288nm，标准品丹酚酸B由天津天士力集团现代中药研究所提供，纯度98.0％(2)丹参总酚酸含量＝F(A-B)+B其中A为分光光度法测定以丹酚酸B为对照计算的总酚酸含量B为高效液相色谱法测定的丹酚酸B含量F为校正因子0.626实施例一丹参5kg粉碎成粗粉，加去离子水在100℃微沸状态下加热提取3次第一次5.5倍水，加热1小时；第二、三次各加3倍量水分别加热0.5小时提取液用10％盐酸调PH值为2后，滤过，滤液上聚酰胺柱(干树脂量为生药量2/3)用5倍量去离子水洗，继续用0.1％碳酸氢钠水溶液洗脱，用量为柱体积的5倍收集洗脱液，用10％盐酸调PH到2后上D101大孔吸附树脂，用去离子水冲洗至中性，继续用95％乙醇洗脱，待色带下来即收集此色带减压浓缩收集液至尽干，用适量水溶解后冰箱冷藏过夜，通过0.3μm混合纤维素微孔滤膜过滤即得丹参总酚酸提取液，以2％氢氧化钠调节PH值到6.0后立即冷冻干燥，得丹参总酚酸原料冻干粉221g，成品收率为生药量的4.4％按专利申请文献(中国专利，申请号01142288.2，申请日2001年9月)的方法进行测定，成品含总酚酸83.94％，丹酚酸B为53.73％实施例二丹参5kg粉碎成粗粉，加去离子水在80℃加热提取3次第一次5.5倍水，加热2小时；第二、三次各加3倍量水分别加热1小时提取液用5％硫酸调PH值为1后，滤过，滤液上聚酰胺柱(干树脂量为生药量2/3)用5倍量去离子水洗，继续用0.2％碳酸氢钠水溶液洗脱，用量为柱体积的4倍收集洗脱液，用5％硫酸调PH到1后上AB-8大孔吸附树脂，用去离子水冲洗至中性，继续用60％乙醇洗脱，待色带下来即收集此色带减压浓缩收集液至无醇味，冰箱冷藏过夜，通过0.3μm混合纤维素微孔滤膜过滤即得丹参总酚酸提取液，以2％氢氧化钠调节PH值到6.0后立即冷冻干燥，得丹参总酚酸原料冻干粉227g，成品收率为生药量的4.5％按专利申请文献(中国专利，申请号01142288.2，申请日2001年9月)的方法进行测定，成品含总酚酸83.15％，丹酚酸B为54.03％实施例三丹参5kg粉碎成粗粉，加去离子水在100℃微沸状态下加热提取3次第一次5.5倍水，加热1小时；第二、三次各加3倍量水分别加热0.5小时提取液用10％盐酸调PH值为2后，滤过，滤液上聚酰胺柱(干树脂量为生药量2/3)用5倍量去离子水洗，继续用0.1％碳酸氢钠水溶液洗脱，用量为柱体积的5倍收集洗脱液，用10％盐酸调PH到2后上RA大孔吸附树脂，用去离子水冲洗至中性，继续用60％甲醇洗脱，待色带下来即收集此色带减压浓缩收集液至无醇味，冰箱冷藏过夜，通过0.3μm混合纤维素微孔滤膜过滤即得丹参总酚酸提取液，以2％氢氧化钠调节PH值到6.0后立即冷冻干燥，得丹参总酚酸原料冻干粉224g，成品收率为生药量的4.5％按专利申请文献(中国专利，申请号01142288.2，申请日2001年9月)的方法进行测定，成品含总酚酸84.02％，丹酚酸B为54.17％实施例四丹参总酚酸胶囊剂处方丹参总酚酸 240g微晶纤维素菜 40g滑石粉 1.4％3％聚维酮乙醇溶液 适量共制成 1000粒取丹参总酚酸与微晶纤维素混合均匀，加3％聚维酮乙醇溶液制软材，过18目筛制颗粒，60℃干燥30-45分钟，整粒，加入滑石粉，混匀，充于1号胶囊中，即得每粒含240mg胶囊实施例五丹参总酚酸片剂处方丹参总酚酸 240g微晶纤维素菜 40g滑石粉 1.4％3％聚维酮乙醇溶液 适量共制成 1000粒取丹参总酚酸与微晶纤维素混合均匀，加3％聚维酮乙醇溶液制软材，过18目筛制颗粒，60℃干燥30-45分钟，整粒，加入滑石粉，混匀，压片实施例六丹参总酚酸颗粒剂处方丹参总酚酸 240g微晶纤维素菜 40g滑石粉 1.4％3％聚维酮乙醇溶液 适量共制成 500袋取丹参总酚酸与微晶纤维素混合均匀，加3％聚维酮乙醇溶液制软材，过18目筛制颗粒，60℃干燥30-45分钟，整粒，装袋实施例七丹参总酚酸粉针剂处方丹参总酚酸100g甘露醇30g依地酸钙钠5g蒸馏水5ml上述组分混匀后，冷冻干燥，分装1000支