专利名称：转基因大豆gts40-3-2核酸定量检测的质粒标准分子的制作方法转基因生物技术被称为是“应用最为迅速的生物技术”，随着生物技术的不断发展，越来越多的转基因植物应用于农业领域，促进农业生产，帮助农民增收，为解决全球人口增长所带来的粮食问题开辟了新的途径。所谓转基因植物(Genetically modified organism, GM0)是指利用生物技术，将从不同生物中分离或人工合成的基因在体外进行重组，然后导入受体植物细胞，使新的基因在受体细胞内整合、表达、其再生植株能通过无性或有性增殖过程，将外源基因遗传给后代，由此获得的遗传修饰植物类型称为转基因植物。 以转基因植物直接为食品或为原料加工生产的食品称为转基因食品。转基因技术将基因在不同物种之间转移，改造生物的遗传物质，使其在性状、营养品质、消费品质等方面向人类所需要的目标转变，满足人类的各种需求，例如提高产量、表达特殊营养成分甚至获得抗除草剂抗病毒或抗虫害的能力。例如转基因大豆是全世界种植面积最大的转基因作物，转基因大豆主要是导入了抗草甘膦基因EPSPS基因(5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase)该基因编码磷酸烯醇式丙酮酰莽草酸合成酶，使大豆能够耐受除草剂草甘膦的伤害，大大方便大豆农业生产和管理。但是随着转基因作物在全世界范围内的广泛种植，其食用安全和环境安全问题也引起了广大消费者和各国政府及相关机构人员的重视。转基因作物在实验室内产生，是大跨度、跳跃式的转移基因，不同于漫长的自然选择和相近物种的杂交。在理论上，转基因作物的产生是人为的加快了某些物种的生物进化速度。这些物种没有经过长期的自然选择的过程，其本身的安全性未知，并且对已有生物的多样性会产生影响。因此很多国家和地区纷纷制定转基因生物安全管理法规，实施标签制度，并积极发展转基因作物检测监测技术。应用于转基因检测方法主要有两种核酸检测、蛋白质检测。其中核酸检测方法由于检测灵敏度高、适用范围广、操作简便等原因已经成为转基因植物及其产品的主要检测方法。另外核酸由于在生物细胞中含量相对稳定，在产品加工中也相对不容易被破坏，因此常用作转基因植物及其产品的检测目标。荧光定量聚合酶链式反应(real-timeFluorescent Quantitative PCR, FQ-PCR) 方法是聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)技术的一种，是公认的目前核酸检测的最常用定量检测方法。聚合酶链式反应又称体外基因扩增技术，是一项在短时间内体外大量扩增特定的DNA片段的分子生物学技术。近年来出现的核酸定量PCR技术，尤其是实时荧光定量 PCR(real-time fluorescent quantitative PCR，FQ-PCR)技术，实现了 PCR由定性到定量的飞跃。实时荧光定量PCR技术在PCR反应体系中加入能特异标记 PCR产物的荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析。实时荧光定量PCR技术是在PCR定性技术基础上发展起来的一种核酸定量和分析技术，该技术融会了 PCR的高灵敏性、DNA杂交技术的高特异性和光谱技术的高精确定量优点，且操作简便、污染少，已成为分子生物学等许多研究及应用科学中的重要工具。在实际检测中，标准物质十分重要。目前，国内用于转基因生物检测的标准物质还很少，目前只有一种转基因大豆粉末标准物质。国际领先的生物计量单位或者实验室已经开始进行转基因定量PCR检测用标准物质的研制，例如位于比利时的欧盟联合研究中心下属的标准物质与测量研究所(IRMM)，已经配制并提供涉及14种转基因作物的有证标准物质(CRMs)系列标准品60多种，这些标准品已经在市场上销售，但国际有证标准物质的价格居高不下，不能满足日益增多的转基因检测的需求。并且，现有的这些标准物质多是原始农产品植物材料的植株或者种子等组织器官的干燥粉末，在使用中还需要从中提取DNA，制备、贮存和测定过程因素影响众多，很难维持恒定的量，很难保证测量的稳定性，溯源性差。相比之下，质粒分子标准物质在很多方面具有明显优势，质粒分子是指一种含有转基因检测目的外源基因和内标准基因的特异性片段的线性化重组质粒分子。经验证质粒标准分子在GMO鉴定检测中是很好的标准阳性物质替代物。质粒分子的优点主要是可以通过微生物进行大量培养，DNA易于扩增，所以可提供无限稳定量的标准物质，并且纯度较高； 且操作容易，稳定性高，同一个质粒分子可以同时包含多个外源目的基因，经济又高效。但目前质粒分子标准物质的研制还不完善，很多检测实验室使用的阳性标准样品缺乏严格的溯源性考察，因此检测结果一致性、互通性和可靠性不能保证，给检测中的定量带来了较大的不确定性，制约了我国转基因产品检测工作的量值溯源发展。
本发明所要解决的技术问题是为了克服现有的转基因大豆GTS40-3-2的核酸定量PCR检测中阳性品缺乏和阳性标准品配置的难题，提供一种转基因大豆GTS40-3-2的质粒标准分子。本发明人通过对转基因大豆品系GTS40-3-2的外源插入基因序列的分析，设计引物PCR扩增获得其结构特异性序列、品系特异性序列及大豆内标准基因Lectin的特异性片段；通过分子克隆的方法构建到一个质粒分子中而成人工重组质粒分子PXL02 ；用电感耦合等离子体发射质谱(ICP-MQ的方法检测质粒标准分子的含磷量，从而换算出质粒标准分子的浓度。本发明中构建的质粒标准分子完全可以替代转基因大豆品系GTS40-3-2阳性标准品，该质粒标准分子完全适用于对转基因大豆品系GTS40-3-2样品的结构特异性、品系特异性定量PCR分析和检测，彻底解决转基因大豆品系GTS40-3-2检测中标准物质缺乏的难题，并保证了质粒标准分子的溯源性。本发明解决上述技术问题的技术方案之一是一种转基因大豆GTS40-3-2的质粒标准分子，含有转基因大豆GTS40-3-2的结构特异性序列、品系特异性序列及大豆内标准基因Lectin的特异性片段。本发明中，所述的转基因大豆GTS40-3-2的结构特异性序列，是指转基因大豆 GTS40-3-2基因组中外源插入片段的一段序列，这段序列可作为转基因大豆GTS40-3-2的结构特异性序列，较佳的如其基因组中的CTP4序列以及CTP4序列两侧的序列所组成的核苷酸片段，其优选的形式可以是部分35S启动子序列、CTP4序列及部分CP4EPSPS序列。其中，所述的“部分”是50-500bp的长度。有了这“部分”序列，即可形成转基因大豆GTS40-3-2 的结构特异性序列。其更优选的形式是109bp长的35S启动子序列、CTP4序列(共长216bp) 及36^p的CP4 EPSPS序列所组成的核苷酸片段。所述的转基因大豆GTS40-3-2的品系特异性序列，是指转基因大豆GTS40_3_2基因组中的一段序列，这段序列可作为转基因大豆GTS40-3-2的品系特异性序列，较佳的如其基因组中含有的外源插入载体序列以及与该外源插入载体相邻接的大豆基因组序列所组成的片段。所述转基因大豆GTS40-3-2的品系特异性序列优选的形式可以是部分外源插入载体序列和与该外源插入载体相邻接的部分大豆基因组序列所组成的核苷酸片段。其中，所述的“部分”是50-500bp的长度。有了这“部分”序列，即可形成转基因大豆GTS40-3-2 的品系特异性序列。所述转基因大豆GTS40-3-2的品系特异性序列更优选的形式是包括 192bp的载体序列和127bp与该载体序列相邻接的大豆基因组序列。本发明中，所述的大豆内标准基因Lectin，指的是大豆凝集素基因，其在大豆基因组中高度保守，具有种间特异性、种内非特异性和单拷贝数的特点。本发明中所述的大豆内标准基因Lectin的特异性片段，是指大豆凝集素基因中具有大豆凝集素基因特异性的片段。在大豆凝集素基因中，全长基因的l(^9bp 1579bp的片段是具有特异性的。本发明所述的大豆内标准基因Lectin的特异性片段优选的就是选自Lectin全长基因的第10 位至第1579位的连续的50-550bp的核苷酸片段，最优的就是Lectin全长基因的第10 位至第1579位的片段。本发明的技术方案之二是一种所述的转基因大豆GTS40-3-2的质粒标准分子的制备方法，包括以下步骤①利用引物通过PCR特异性扩增转基因大豆GTS40-3-2的结构特异性序列、品系特异性序列及大豆内标准基因Lectin的特异性片段；②分别依次将PCR扩增得到的转基因大豆GTS40-3-2的结构特异性序列、品系特异性序列及大豆内标准基因Lectin的特异性片段克隆至克隆质粒载体上，得到质粒标准分子PXL02。本发明中，所述的转基因大豆GTS40-3-2的结构特异性序列是部分35S启动子序列、CTP4序列及部分CP4EPSPS序列；所述的转基因大豆GTS40-3-2的品系特异性序列是转基因大豆GTS40-3-2外源插入载体与大豆基因组相邻接的序列；所述的大豆内标准基因 Lectin是大豆凝集素基因。本发明中，所述的PCR引物是长度为的寡核苷酸链，其与转基因大豆 GTS40-3-2的结构特异性序列、品系特异性序列或者大豆内标准基因Lectin的特异性片段完全相同或互补。本发明中，所述的特异性扩增是利用设计的PCR引物特异性扩增转基因大豆 GTS40-3-2的结构特异性序列、品系特异性序列及大豆内标准基因Lectin的特异性片段。本发明中，所述的克隆是将上述PCR扩增得到的转基因大豆GTS40-3-2的结构特异性序列、品系特异性序列及大豆内标准基因Lectin的特异性片段按照设计的限制性内切酶酶切位点依次连接到质粒载体上，获得标准质粒分子PXL02。本发明中，所述的质粒载体可以是任何常规载体，较佳的是克隆载体，更佳的是能够在大肠杆菌中增殖的克隆载体，如pUC19、pUC18，，pUC118，pUC119，pUC19，pBlueScriptII SK或pGEM系列载体。本发明的技术方案之三是一种所述的转基因大豆GTS40-3-2的质粒标准分子的定量方法，包括以下步骤①提取质粒标准分子pXL02 ；②根据步骤①所得的质粒标准分子PXL02的碱基组成和序列长度，计算质粒标准分子pXL02分子中的磷元素的含量；③配制梯度浓度的磷标准溶液，并用此标准溶液作出电感耦合等离子体发射质谱 (ICP-MS)的标准曲线。④ICP-MS检测质粒标准分子PXL02溶液，并根据步骤③所得的标准曲线得出质粒标准分子PXL02溶液的磷含量。⑤根据步骤④所得的质粒标准分子pXL02溶液的磷含量和步骤②所得的质粒标准分子PXL02分子中的磷元素的含量，计算出质粒标准分子PXL02的浓度。本发明中，电感耦合等离子体发射质谱检测的参数优选RF power为1100W，雾化气流量为1. 08L/min，辅助气流量为1. 2L/min，等电子体气流量为16L/min。本发明的技术方案之四是一种转基因大豆GTS40-3-2的核酸定量PCR检测方法， 所采用的标准物质是所述的质粒标准分子。本发明的有益效果在于，利用PCR扩增和分子克隆的方法构建了含有转基因大豆 GTS40-3-2的结构特异性序列、品系特异性序列及大豆内标准基因Lectin的特异性片段的质粒标准分子，并利用电感耦合等离子体发射质谱(ICP-MQ对其进行定量，保证了其良好的溯源性。本发明的质粒标准分子可以替代转因大豆GTS40-3-2的阳性标准物质，用于转基因大豆GTS40-3-2结构特异性、品系特异性的定量PCR检测。图1是本发明一质粒标准分子pXL02的构建流程图。图2是本发明一质粒标准分子PXL02的图谱。核酸定量PCR检测大豆GTS-40-3-2的原理采用实时荧光PCR技术和可特异性扩增转基因大豆GTS-40-3-2中结构基因或品系特异性基因以及大豆Lectin基因的引物和两端标记荧光的探针，分别扩增测试样品 DNA，并实时监测PCR产物。与此同时，用相同的引物、探针和条件扩增已知浓度的阳性标准物质(或阳性标准分子)，以获得稳定的标准曲线。根据外源基因(结构特异性基因或品系性特异基因)和内源基因的标准曲线可分别计算出样品中对应基因的绝对含量(拷贝数或浓度)，并由绝对含量计算计算转基因大豆GTS-40-3-2在测试样品中的相对含量。如采用阳性标准分子时计算相对含量应使用转换系数。标准物质标准物质是具有一种或多种足够均勻和很好确定了的特性值，用以校准设备，评价测量方法或给材料赋值的材料或物质。转基因植物检测标准物质包括标准阳性物质和质粒标准分子。标准阳性物质是一类用原始植物材料制成的标准物质，是纯合的转基因植物材料，在PCR检测过程中用作阳性对照和配置定量检测的标准品，用于对GMO混合水平进行量化和分析。在转基因定量PCR检测过程中，阳性标准品是必须的，因此阳性标准品的配置要求非常严格，必须经过多个实验室的实验验证方可应用于转基因定量PCR检测。这类来源于农产品的标准物质，其制备、贮存和测定过程受很多因子影响，很难维持恒定的量，而且并非所有的作物转基因品系都存在标准阳性物质。质粒标准分子质粒标准分子是指一种含有转基因检测目的外源基因和内标准基因的特异性片段的线性化重组质粒分子。经验证质粒标准分子在GMO鉴定检测中是很好的标准阳性物质替代物。质粒分子的优点主要是可以通过微生物进行大量培养，DNA易于扩增，所以可提供无限稳定量的标准物质，并且纯度较高；且操作容易，稳定性高，同一个标准分子可以同时包含多个外源目的基因，经济又高效。甚至有学者将质粒标准分子称为“金标准物质”。在转基因定量PCR检测过程中，标准分子根据分子量大小与植物基因组DNA分子换算，从而完成对转基因样品的定量分析。标准分子可以应用到转基因PCR检测，尤其是定量PCR检测中。本发明的质粒标准分子，含有转基因大豆GTS40-3-2的结构特异性序列、品系特异性序列及大豆内标准基因Lectin的特异性片段。本发明中，所述的转基因大豆GTS40-3-2的结构特异性序列，是指转基因大豆 GTS40-3-2基因组中外源插入片段的一段序列，这段序列可作为转基因大豆GTS40-3-2的结构特异性序列，较佳的如其基因组中的CTP4序列以及CTP4序列两侧的序列所组成的核苷酸片段，其优选的形式可以是部分35S启动子序列、CTP4序列及部分CP4 EPSPS序列。其中，所述的“部分”是50-500bp的长度。有了这“部分”序列，即可形成转基因大豆GTS40-3-2 的结构特异性序列。其更优选的形式是109bp长的35S启动子序列、CTP4序列(共长216bp) 及365bp的CP4 EPSPS序列所组成的核苷酸片段。所述的转基因大豆GTS40-3-2的结构特异性序列较佳的如SEQ ID NO. 1所示，其中第1位到109位为部分35S启动子序列，第110 位到3 位为CTP4序列，第327到691位为部分CP4 EPSPS序列。本发明所述的转基因大豆GTS40-3-2的品系特异性序列，是指转基因大豆GTS40-3-2基因组中的一段序列，这段序列可作为转基因大豆GTS40-3-2的品系特异性序列，较佳的如其基因组中含有的外源插入载体序列以及与该外源插入载体相邻接的大豆基因组序列所组成的片段。所述转基因大豆GTS40-3-2的品系特异性序列优选的形式可以是部分外源插入载体序列和与该外源插入载体相邻接的部分大豆基因组序列所组成的核苷酸片段。其中，所述的“部分”可以是20-500bp的长度。有了这“部分”序列，即可形成转基因大豆GTS40-3-2的品系特异性序列。所述转基因大豆GTS40-3-2的品系特异性序列更优选的形式是包括192bp的载体序列和127bp与该载体序列相邻接的大豆基因组序列。优选的，所述的转基因大豆GTS40-3-2的品系特异性序列如SEQ ID NO. 2所示，其中第1位到第192位是外源插入载体序列，其中第193位到第319位是相邻接的大豆基因组序列。本发明中，所述的大豆内标准基因Lectin，指的是大豆凝集素基因，其在大豆基因组中高度保守，具有种间特异性、种内非特异性和单拷贝数的特点。本发明中所述的大豆内标准基因Lectin的特异性片段，是指大豆凝集素基因中具有大豆凝集素基因特异性的片段。在大豆凝集素基因中，全长基因的第10 位 第1579位的片段是具有特异性的。本发明所述的大豆内标准基因Lectin的特异性片段优选的就是选自Lectin全长基因的第 1029位至第1579位的连续的50-550bp的核苷酸片段，最优的就是Lectin全长基因的第 1029位至第1579位的片段。优选的，所述的大豆内标准基因Lectin的特异性片段的序列如 SEQ ID NO. 3 所示。本发明所述的质粒标准分子pXL02的序列较佳的如SEQ ID NO. 10所示，其中第 1336位到第20 位为结构特异性序列，第986位到第1305位为品系特异性序列，第413位到第963位为内标准基因Lectin的特异性片段。质粒标准分子构建方法本发明所述质粒标准分子pXL02构建方法，包括以下步骤①利用数据库(比如Genbank、上海市转基因生物安全性检测评估共享服务平台 http://www. shgmo. org/welcome. htm)进行生物信息学分析，获得转基因大豆GTS40-3-2 的结构特异性序列、品系特异性序列、大豆内标准基因Lectin序列。②设计PCR特异性引物；所述的PCR引物，指的是长度为的寡核苷酸链，其与转基因大豆 GTS40-3-2的结构特异性序列、品系特异性序列或者大豆内标准基因Lectin的特异性片段完全相同或互补。较佳的，扩增转基因大豆GTS40-3-2的结构特异性序列的引物对中，一条引物的序列是 SEQ ID N0. 4，另一个是 SEQ ID N0. 5。扩增转基因大豆GTS40-3-2的品系特异性序列的引物对中，一条引物的序列是 SEQ ID N0. 6，另一个是 SEQ ID N0. 7。扩增转基因大豆GTS40-3-2的大豆内标准基因Lectin的特异性片段的引物对中， 一条引物的序列是SEQ ID N0. 8，另一个是SEQ ID N0. 9。③特异性扩增转基因大豆GTS40-3-2的结构特异性序列、品系特异性序列及大豆内标准基因Lectin的特异性片段。所谓的特异性扩增，指的是利用设计的PCR引物特异性扩增转基因大豆 GTS40-3-2的结构特异性序列、品系特异性序列及大豆内标准基因Lectin的特异性片段。
④分别依次将PCR扩增得到的转基因大豆GTS40-3-2的结构特异性序列、品系特异性序列及大豆内标准基因Lectin的特异性片段克隆至克隆质粒载体上，得到质粒标准分子pXL02 ；所述的克隆，指的是将上述PCR扩增得到的转基因大豆GTS40-3-2的结构特异性序列、品系特异性序列及大豆内标准基因Lectin的特异性片段按照设计的限制性内切酶酶切位点依次连接到质粒载体上，获得标准质粒分子PXL02。所述的质粒载体可以是任何常规载体，较佳的是克隆载体，更佳的是能够在大肠杆菌中增殖的克隆载体，如 pUC19、pUC18，，pUC118，pUC119, pUC19, pBlueScript II SK 或 pGEM系列载体。⑤测序验证质粒标准分子pXL02的序列。⑥质粒标准分子pXL02的定量PCR检测方法验证。所述的定量PCR检测方法验证，是指检测质粒标准分子PXL02在进行定量PCR分析时的特异性、灵敏度、重复性和重演性等特性，以鉴定该质粒标准分子替代转基因大豆 GTS40-3-2阳性标准物质的能力，以及实际应用于定量PCR检测转基因大豆GTS40-3-2的测定有效性。质粒标准分子的定量方法本发明所述质粒标准分子pXL02的定量方法，包括以下步骤①提取质粒标准分子pXL02 ；②根据质粒标准分子PXL02的碱基组成和序列长度，计算质粒标准分子PXL02的磷元素的含量；③配制梯度浓度的磷标准溶液，并用此标准溶液作出ICP-MS的标准曲线。④ICP-MS检测质粒标准分子PXL02，并根据标准曲线得出质粒标准分子pXL02的
磷含量。⑤据质粒标准分子pXL02的磷含量计算出质粒标准分子PXL02的浓度。下面对本发明的实施方式作详细说明。本实施例在本发明技术方案的前提下进行实施，给出了详细的实施方式和过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。下列实施例中未注明具体条件的实验方未能，通常按照常规条件操作，如可参照Sambrook等编著分子克隆实验室手册(New York =Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。本发明中所述的“室温”是指进行试验的操作间的温度， 一般为25 °C。实施例1质粒标准分子的构建一、实验试剂限制性内切酶Kpnl、Hindlll、XbaI,以及限制性内切酶对应缓冲液购自上海皓嘉科技发展有限公司。pUC19 载体、Taq DNA 聚合酶、T4DNA 连接酶、dNTP、DL2000 Marker购自上海皓嘉科技发展有限公司；DNA引物由上海生工生物技术有限公司合成。其它生化试剂均为进口分装或国产分析纯。二、实验仪器
DY-501型核酸电泳仪(上海精密科学仪器有限公司)PTC-100 型 PCR 扩增仪(MJ Research Inc.)DNA电泳分析系统，包括暗箱、数码照相机、计算机、扫描仪、喷墨打印机、光敏打印机、Tanon UV-2000紫外分析仪、Gis凝胶图像分析软件(上海天能公司)其它仪器包括离心机、恒温水浴锅、培养箱、天平等。三、实验方法和过程1、在GenBank中搜索大豆内标准基因Lectin ；在上海市转基因生物安全性检测评估共享服务平台(http://www.shgmo.org/welcome.htm)上查询获得转基因大豆 GTS40-3-2的外源插入载体在转基因作物中的具体插入方式和拷贝数，并查阅外源插入载体中主要元件的序列信息。2、构建质粒标准分子pXL02的PCR引物序列设计构建质粒标准分子pXL02的示意图见图1。根据获得的转基因大豆GTS40-3-2外源插入序列信息，利用软件I^rimer 5.0设计两对PCR引物。一对引物用于扩增转基因大豆 GTS40-3-2的结构特异性基因，一条引物位于35S启动子序列上，一条位于CP4 EPSPS基因序列上；另一对引物用于扩增转基因大豆GTS40-3-2的品系特异性基因，一条引物位于大豆基因组上，另一条位于转基因大豆GTS40-3-2的外源插入载体上。另外设计一对引物用于扩增大豆内标准基因Lectin特异性序列。各引物的两端加上分子克隆所需的酶切位点及保护碱基。在引物设计过程中，力求使构建的质粒适用于更多的转基因大豆GTS40-3-2的检测，质粒中包含的序列既可适用于结构特异性序列扩增，也可适用于品系特异性序列扩增， 同时要兼顾检测结果的特异性。具体的引物序列见表1。 表1.构建质粒标准分子pXL02的PCR引物序列
目标序列引物引物序列(5’ 3、)扩增片段大小(bp)结构特异性序列正向CCCAAGCTTGATGACGCACAATCCCACTATCC709反向CCCAAGCTTGTCGCCGATGAAGGTGCTGTC品系特异性序列正向TGCTCTAGAGATCGGAGTTTCTCCTCCTGC337反向TGCTCTAGACAATTGCGTGGTGAACTTTCTGLectin正向CGGGGTACCTTGGTACTGGTGCTACTGACC570反向CGGGGTACCGGTGGAGGCATCATAGGTAA3、转基因大豆GTS40-3-2的结构特异性序列、品系特异性序列及大豆内标准基因序列的扩增根据表1的引物，以转基因大豆GTS40-3-2基因组DNA为模板，对其结构特异性序列、品系特异性序列及大豆内标准基因序列进行PCR扩增(反应体系和条件见表2、3)，得到 709bp的结构特异性序列、337bp的品系特异性序列和570bp的大豆内标准Lectin基因序列。对扩增产物进行回收纯化。表2.构建质粒标准分子PXL02的PCR扩增体系
反应试剂用量(UL)IOXbuffer2dNTP(2. 5mM)1上游引物(IOnM)1下游引物(IOnM)1Taq酶(2. 5单位/反应)1DNA模板1續20补足至20 μ L 表3.构建质粒标准分子PXL02的PCR扩增条件
循环数温度(°c)时间1955分钟309535秒5735秒7240秒1725分钟4、将PCR产物克隆至质粒载体PUC19上分别用限制性内切酶HindIII消化扩增得到的结构特异性序列与载体pUC19，回收酶切后的结构特异性序列及线性质粒PUC19，T4连接酶进行连接，连接产物转化大肠杆菌DH5 α，得到中间质粒分子pUC19_l。分别用限制性内切酶^CbaI消化扩增得到的品系特异性序列与中间质粒分子pUC19_l，回收酶切后的品系特异性序列及线性中间质粒pUC19_l， T4连接酶进行连接，连接产物转化大肠杆菌DH5ci，得到中间质粒分子pUC19_2。用限制性内切酶KpnI消化扩增得到的Lectin基因特异性序列与中间质粒分子pUC19_2，回收酶切后的Lectin序列及线性中间质粒pUC19_2，T4连接酶进行连接，连接产物转化大肠杆菌DH5 α，得到质粒标准分子pXL02，见图2。酶切反应体系及连接体系见表4、5。表4.酶切反应体系


本发明公开了一种适用于转基因大豆GTS40-3-2定量检测的质粒标准分子，其含有转基因大豆GTS40-3-2的结构特异性序列、品系特异性序列及大豆内标准基因Lectin的特异性片段。通过对转基因大豆GTS40-3-2的外源插入基因序列的分析，设计引物PCR扩增获得其结构特异性序列、品系特异性序列及大豆内标准基因Lectin的特异性片段；通过分子克隆的方法构建到一个质粒分子中形成人工重组质粒分子pXL02；用电感耦合等离子体发射质谱(ICP-MS)的方法检测质粒标准分子的含磷量，从而换算出质粒标准分子的浓度。本发明中构建的质粒标准分子完全可以替代转基因大豆GTS40-3-2阳性标准品，该质粒标准分子完全适用于对转基因大豆GTS40-3-2样品的结构特异性、品系特异性定量PCR分析和检测。