芒属植物Genic-SSR标记的制备方法及应用制作方法_余作平专利（Genic,SSR,植物）-早鸽网

一种芒属植物Genic-SSR标记的制备方法及应用制作方法

专利名称

一种芒属植物Genic-SSR标记的制备方法及应用制作方法
发明者

余作平, 刁英, 游永宁, 胡中立, 胡小虎, 郑兴飞
公开日

2012年4月25日
申请日期

2011年12月23日
优先权日

2011年12月23日
申请人

湖北光芒能源植物有限公司
文档编号

C12Q1/68GK102424826SQ20111044396
关键字

Genic SSR 植物
权利要求

1. 一种芒属植物Genic-SSR标记的制备方法，其步骤是1)、芒属植物转录组序列的获得选取芒属植物的幼嫩叶片，分别提取总RNA，采用转录组测序方法，得到转录组Reads，去除载体RNA序列污染，利用拼接软件完成序列拼接，最终获得芒属植物五个种的非冗余 Unigene-EST 序列；2)、芒属植物ESR序列中SSR位点的鉴定采用SSR检索软件对上述步骤(1)得到的非冗余Unigene-EST序列进行SSR位点查找，检索的限定条件为重复基序为2-6个碱基，且重复单元数依次大于6次，5次，4次，4次，3 次；对于中间被< 50bp的间隔碱基打断的复合型SSR计为一个SSR位点，获得一系列含有 SSR位点信息的Unigene序列；3)、芒属植物Genic-SSR引物的设计依据上述步骤( 得到的含有SSR位点的Unigene序列，采用引物设计软件进行引物设计，获得一系列Genic-SSR引物，引物设计参数主要包括引物长度为18_2^p，退火温度为50-65°C，GC含量为45-65%，PCR扩增产物长度为90_300bp ；4)、芒属植物Genic-SSR引物的扩增与筛选选取用于转录组测序的五个材料，用于检测芒属植物Genic-SSR标记的扩增状况以及可转移性选取五个材料的幼叶50-100mg置于2. Omi离心管中，液氮冷却后，用研磨棒迅速将样品碾磨成粉末状，基因组提取利用TIANGEN植物基因组DNA提取试剂盒，利用质量体积比的琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA的质量采用上述步骤(3)合成的引物，以五个材料的基因组DNA进行扩增，以检测引物设计的可靠性、扩增模式及其通用性根据扩增结果，筛选可有效扩增的芒属Genic-SSR引物依据扩增结果，筛选出可以稳定扩增的Genic-SSR引物60对，具体如下 ms-It—1FCACCAGTGTTGGATGCTGAC RTGTTGTCTAGCCTCCCGTCT ms-It-2FACACTGTCCCAAATCCTTCC RAAGAAATCTCACTCCTCTCCCC ms-It—3FCTCACAGGACAAGAGAGGGG RGCATTCCAAAAGCATCCAGT ms-It—4FTGGAGCTGTGATCCTCTTCC RCGGCTCAAAAACCACAAAAT ms-It—5FTCCAATCTAACCTCGTTGCC RTGAGGTCTCGAACTGCAAAA ms-It—6FCACCGTCGAGTAGGGTGGRCTGACGAGGGCACCAGAC ms-It-8FACCGGGGTCAGGAAGTAGAA RTGTTCGTCTACAACGCCACT ms-It—9FCCAGCTTCTCCCACACCC RCACCGAAGAGCCCCTCTC ms-It-10F CTTGCAGTGCCTCCGTATG RCCTCATCGTCGACTTCAACA ms-It-12FAGTGATGGAACTGCTGGAGG R CTTTGAGCGTCGATCCATTT ms-It-13F TGATGGTGTTGGTGATTTGG R ATTTGCTGTTGCTGCTGTTG ms-It-18FTGGCTCCCACTATCACTTCC RCTTGCTGCAACAGATGGAAA ms-It-19FCATGGACTCGGATCAGGACT RCGAGGAGGAACTTGGTGGAT ms-It-20FGCAGGTTGCGATCCTAAGAC RGATCACCTGAAAAGGCAAGC ms-It-21FCCAAGCTCTAAACAGGCTCG RGATGGGAGTTTACGTGGGG ms-It-23FCAACCTCCTCTCCCTGATGA RAGACGGAGATGAATCGTTGG ms-It-24F CATGGTTGAGTTCTACGCCC RAGAAGAGGATGGTGGGGAAG ms-It-26FGGTCCATGACGAAGTCGAAG RCCCGGAGTTCTACTGCTACG ms-It-27F AAACATGCGTGCTTTGACTGR TTGCCTCTTTCGTGCTACCT ms-It-28FACCACCAAAACCAAACGAAG RTAGAGGGGAAGAAGGGGAAG ms-It-29FGGTCTAATCGCCCCGTAGAT RCCCTTTACTCCCGAGGAGAC mf-ts-1F CAGATGAGACCAGCAGTGGA R ACGCCAGTCAACCATCTCTT mf-ts-2FACAGGGAGAGGGGAGAAGAA RTCCATCGTTTTCTGGTGTGA mf-ts-4FGTGCTCTTCCGCCTGAACTA R TCCTCCTCCTCACCATCATC mf-ts-5FCAAATGGTCGTCCCAAAGAC RAGAGGAAGAATGGGTGGGAG mf-ts-6FATGGCTACCACTCAGTTCGC R GTCGTCGTCCTCTTCAAGG mf-ts-9FACCGTCCATCCATCTGTAGC RGCTTCCTGGACGACTCTGTT mf-ts-10F CTCGAGCGAGCTGTTCATTT RTGAAGATACCGTGGAGGAGG mf-ts-11F CTTGTCCCTCTTCACCAAGC RCCTTTCTTCCAGTGGCTCAA mf-ts-13FCCAGAGGGATAGGAGGAGGA RCACGTGTAGCAGGTCCTGAA mf-ts-14FGCTCTCCGAGGTCGTGTC R CCTGTCTGAGGATGGTCCC mf-ts-15FACGTCCTTCTTTCTGCTGGARCGTCTCTGCTCCTGGCTTTA mf-ts-16F GGAACGGGGAAACCTCTG RTCTCTTCTCTTCTCCGTCGC mf-ts-17FAAAGGGTACGGCACTGAGGT R GCAACGTGAACTCTGTCTGC mf-ts-18FGAGGGGATCTAGATGAGGGC RCCAGCTCGTTTCTTCCTCAG mf-ts-19FCGTCTGCGACACAAGAACAT R ATGATGTTGCTGGCCTTGAT mf-ts-21FGGACACCTACACGGTCACCT RCTGCTGGCTGGTGGTGTT mf-ts-22F CATGGTTGAGTTCTACGCCC RAGAAGAGGATGGTGGGGAAG mf-ts-23FCGCACAAAAGAATGCATCAC RGGAACGCCACTTTCTAGCAC mf-ts-24F ACCAGCACCGTCATCATCAG R GAACAGGTTGCCGGTGTATC mf-ts-25FCTACGACCGCTGCTGCTAGT RTCTCCATACTGCTCTGGGCT mf-ts-28FTTCCGATCTCAAGGACCAAC R AACCCTCCTGTCCATGATGA mf-ts-29FCTGCAAGTTTCTTTGCCCTC RTCTGAAAAGTGGTGGTGTGC mg-1FATCAGAGAGAGGCACCTGGA RGAGTGAGGAGATGACCCGAC mg-2FAGAAACGTGAAACCTGCTGAARAAGCTGACAGCACAACAACG mg-5FGGCGGATAATCAGCAAGTGT RGAAGAGTGGCTGGGTTGAAG mg-6FGGAGAGTGAGAGCAGGGTTG R GTTGCCACAAATCTGGCTG mg-7FACCAAGACCAAATCTGCCAC R ACACAGCTACATCGGGTTCC mg-8FAACTCTTTTACAACGTCAATTTGC RCAGCCTTTGGTTAGAGCACC mg-17FAATAGGAGGCTGGCTGGTTT RGCAATTTGCTCCTGCACATA mg-18F GCAGCAGAGAGGAGAGGAGA R CCCGTCGTGTTGATGTACTG mg-19F TCTCCTCCAGGTTCACCATC RAGGTGCAAATCATCTACCGC mg-21FACAGGAACGGAGGAACTTGA RGATACGCCGTCGCTGAAG mg-22FGATCGCTCCTTCCATTGTGT RAATCTCAAGTCCTCCTCCCC mg-23F TGAGATTCCTCCCTCCATTG RGCGCTCTACTCCAGGAAAAA mg-25FGCCCCTCAGATGGTTGAATA RTGTGGTACATCTCCCTGCAA mg-26F GTCACTCTCCCCTCCCATTC RTGCACCCTTTACGAACTCCT mg-27FCCATGGCTAAGCCTCACTTCRGCGCACACACACACACTACT mg-29F AGCGTAAGAGGGAGGATGGT R GGAGCTCCTCCTCGGTGT mg-30FTTGACGGTGACGATGAGGTA RTCAAATCTCATCAGTTCCCAAA所述的芒属植物为芒、五节芒、荻、南荻、奇岗其中的任意一种2.权利要求1所述的一种芒属植物Genic-SSR标记在芒属植物遗传多样性分析中的应用；所述的芒属植物为芒、五节芒、荻、南荻、奇岗、河八王
技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，更具体涉及一种芒属植物GeniC-SSR标记的制备方法，同时还涉及一种芒属植物Genic-SSR标记的用途
背景技术

专利详情
全文pdf
权力要求
说明书
法律状态

专利名称：一种芒属植物Genic-SSR标记的制备方法及应用的制作方法芒属植物属于禾本科C4多年生草本植物，主要包括芒、五节芒、荻、南荻、奇岗，集中分布在亚洲东部及东南部。芒属植物具有生命力强、光合利用效率高、抗逆性强等特点，可用于制药、造纸、水土保持和生态修复等。随着人类对能源需求的不断提高，全球能源储量的不断减少，芒属植物作为一种潜在的能源植物越来越受到人们的高度关注。目前，在欧美实现广泛种植的奇岗，年产可达每年10 40吨/公顷，被用于火力发电和燃料乙醇生产。随着芒属植物的遗传多样性研究、遗传选育改良及遗传图谱绘制等工作的不断深入，对芒属植物分子标记的需求也越来越大。通过遗传改良或重要基因的挖掘可有效提高芒属能源植物的产量、抗逆性、广适性。因此，挖掘芒属植物的分子遗传标记，对芒属植物研究意义重大。简单序列重复(simple sequence repeat, SSR)是一类l_6bp核苷酸基序构成的重复序列，广泛分布于真核生物基因组的编码区、非编码区，SSR标记利用简单序列重复的侧翼保守序列设计引物，经过PCR扩增，根据条带的大小来反映DNA序列的多态性。与其它分子标记如RFLP、AFLP, ISSR等相比，SSR标记具有多态性高、共显性遗传、重复性好、特异性强等特点，近年来成为遗传多样性研究、遗传作图、重要功能基因定位、分子辅助育种等领域应用最多的一种标记。传统SSR标记的开发，一般使用文库筛选法、磁珠富集法以及利用NCBI中已有EST数据库信息挖掘等。其中，前两种方法费时费力、开发成本高，第三种方法又依赖于现有NCBI中EST数据，对于EST测序少的物种其应用很有限。截止到2011年11月21日，在NCBI数据库中可以检索到的芒属植物EST序列仅有5条，难以满足开发EST-SSR标记的需要；而现有研究中，芒属植物分子标记开发只局限在利用磁珠法或建立文库挖掘，无法满足现今芒属植物研究需求，因此，通过转录组测序获得大量EST序列信息，利用生物信息学挖掘SSR标记成为了一种高效的技术手段。
本发明的目的是在于提供了一种芒属植物Genic-SSR标记的制备方法，方法易行，操作简便，通过转录组测序获得EST序列，挖掘SSR位点信息、设计引物，构建芒属植物特异性Genic-SSR标记体系，为重要能源植物芒草的遗传学研究及分子改良等奠定基础。本发明的另一个目的是在于提供了一种芒属植物Genic-SSR标记在芒属植物遗传多样性研究中的应用，由于Genic-SSR标记的数量多且稳定性好，分析结果准确可靠。本发明通过以下技术方案实现一种芒属植物Genic-SSR标记的制备方法，其步骤是1)、芒属植物转录组序列的获得选取芒属植物五个种(芒、五节芒、荻、南荻、奇岗)的幼嫩叶片，分别提取总RNA，采用转录组测序方法(Illumina Solexa HiSeq2000)，得到转录组Reads，去除载体等RNA 序列污染，利用拼接软件(如S0AP、iASSembler等)完成序列拼接，最终获得芒属植物五个种的非冗余Unigene-EST序列。所述的芒属植物为芒、五节芒、荻、南荻、奇岗其中的任意一种。2)、芒属植物ESR序列中SSR位点的鉴定采用SSR检索软件(如可选择SSR hunter,BatchPrimer3. 0、MISA等)对上述步骤(1)得到的非冗余Unigene-EST序列进行SSR位点查找。检索的限定条件为重复基序为2-6个碱基，且重复单元数依次大于6次，5次，4次，4次，3次；对于中间被< 50bp的间隔碱基打断的复合型SSR计为一个SSR位点，从而获得一系列含有SSR位点信息的Unigene 序列(请见表1)。表1测序产生的Unigene-EST统计信息本发明公开了一种芒属植物Genic-SSR标记的制备方法及应用，其步骤是A、芒属植物转录组序列的获得选取芒属植物的幼嫩叶片，分别提取总RNA，得到转录组Reads，去除载体RNA序列污染，拼接，获得芒属植物转录组序列；B、芒属植物ESR序列中SSR位点的鉴定采用SSR检索软件对得到的非冗余Unigene-EST序列进行SSR位点查找，重复基序为2-6个碱基，获得一系列含有SSR位点信息的Unigene序列；C、芒属植物Genic-SSR引物的设计依据得到的含有SSR位点的Unigene序列，采用引物设计软件进行引物设计，获得一系列Genic-SSR引物。方法简单，效率高，操作简便，获得的标记数量巨大，通过转录组测序获得EST序列，为重要能源植物芒草的遗传学研究及分子改良等奠定基础。

查看更多专利详情

下载专利文献

下载专利