专利名称：一种黄连木开花基因的克隆及其应用的制作方法化石能源日趋枯竭，加之化石类能源使用过程中产生的有毒气体和温室气体带来的环境影响，开发绿色可再生的清洁能源成为世界各国争相研究的领域。其中生物能源是最有前景的发展方向之一。我国是能源消费大国，60%的石油依赖进口，发展生物柴油替代有限的石油资源意义重大。目前，生物柴油产业的瓶颈问题是原料的供应问题，相关生物柴油生产企业普遍开工率低，只有10%左右；其主要原因是原料油脂供应不足，且油脂成本占企业生产成本比例高，达60-70%。我国人多地少，不能象发达国家一样走利用耕地实现生物柴油原料油供应的路子，利用荒山、荒地等边际性土地种植油料植物实现原料油脂的供应是我国生物柴油产业发展的必由之路。黄连木(Pistacia chinensis Bunge)是一种重要的多年生木本油料植物,分布范围广，可在荒山荒地等边际性土地上种植，适宜大面积造林，而且种子含油率高达40%以上。黄连木种子油脂是生物柴油的优质原料，黄连木被认为是未来生态能源林建设和生物质柴油产业优先发展树种。由于黄连木发展前景看好，目前针对黄连木的研究越来越多，但基本集中在资源调查、育苗、防治、栽培技术等宏观方面的研究，有关遗传基础、丰产技术等方面的研究较少。黄连木为雌雄异株植物，天然次生林中的雌雄株的比例大约为1:1，而10%左右的雄株即可以保证充足的花粉供应，因而天然次生林中雄株过剩，能结果的雌株比例偏低(在天然次生林中偶见有雌雄同株的个体，目前还无法在生产上应用)。而黄连木童期长，8-12年才能开花结果，在开花结果前没有有效的雌雄株的鉴定方法。因而对黄连木开花主控基因的克隆和功能研究，以及稳定实用的黄连木苗期雌雄鉴定技术的研究，对于研发童期短的早结果株系、培育雌株比例高的高产黄连木能源林，从而大幅提高黄连木的单位面积产量具有重要意义。
本发明的目的是用于黄连木不同性别植株的苗期性别鉴定，用于调节黄连木能源林的植株性别比例，从而大幅提高产量。为了实现上述目的本发明采用如下技术方案根据其它植物已知LEAFY基因序列，设计兼并引物，以黄连木雄株、雌株和雌雄同株总RNA为模板，采用RT-PCR方法合成cDNA第一条链，5’RACE和3’RACE方法克隆PcBLFY的cDNA全长序列。根据获得的cDNA序列设计引物，通过RT-PCR的方法从黄连木雄株、雌株、雌雄同株植株中分别获得2个、I个、2个序列存在单碱基位点多态性差异的LEAFY基因。一种黄连木开花基因(PcBLFY)具有如下cDNA核苷酸序列0001 CAAGTGTCAAGTTTCAAACAAACAAAACATCATCAACTCCCCTTTCACTT0051 CTTTAGTTACCCAATCATAAAACAATTAAAACCAGTGACTTAAAGGGCAG0101 TTTTGTGAACCCAAAAACAGTTTGCCTTTATAACAAAGCAACACCAACAC0151 ACAGCTCAAAATYTCAGTTGCTCAGAGAGATGGATCCTGAAGCATTCACG0201 GCGAGCTTGTTTAAGTGGGACCCGCGTGGGSTGGTGCCGCCACAGACCAG0251 GGTGCTGGAACCGGTGGTGCCACTACCGGCAGCGATTTCCGCGGCCACCG0301 CCTTCTCGGTGGTGCGTCCAAGGGAGCTAGGTGGGCTGGAGGAGTTGTTC0351 CAGGCTTATGGGATAAGGTACTACACGGCAGCGAAGATAGCGGAGCTTGG0401 GTTCACGGTGAATACACTTGTGAATATGAAAGATGAGGAGCTTGATGAGA0451 TGATGAACAGCCTGTCTCAGATATTTAGGTGGGAACTCCTTGTTGGAGAG0501 AGGTATGGTATTAAAGCTGCTGTTAGAGCTGAGAGGAGAAGGCTTGATGA0551 GGAGGATTCACGAAGGCGTCACWTACTGTCTGGTGATACTACCAACTCTG0601 TTGATGCTTTGTCCCAAGAAGGGTTATCTGAGGAACCAGTGCAGCAAGAG0651 AAGGAGGCAGCAGGGAGCGGAGGAGGAGGAACGTGGGACTTAGCGGTGGC0701 AGTGACGGAGAGGAAGAAACAGCGGCGGAGGAAGGGGCAAAGGAAGATAG0751 TGGATGTTAATCACTATGATGAAAATGAAGAYGATGAGAATGCTGAAGGC0801 AGTGAGAGACAACGAGAGCACCCCTTCATAGTGACGGAGCCTGGTGAAGT0851 GGCACGTGGCAAAAAAAACGGCCTTGATTACCTGTTCCATCTCTATGAGC0901 AATGCCGTGATTTCTTGATCCAGGTCCAGAACATCGCCAAGGAGCGTGGC0951 GAAAAATGCCCAACCAAGGTGACAAATCAGGTGTTTAGGTATGCAAAGAA1001 GGCTGGTGCAAGCTACATTAACAAGCCAAAGATGAGACACTATGTGCACT1051 GCTATGCGTTGCACTGCCTGGACGAGGAGGCATCAGATGCACTGAGGAGG1101 GTTTTCAAGGAAAGAGGAGAGAACGTGGGGGCTTGGAGACAGGCTTGTTA1151 TAAGCCACTTGTGGGCATTGCAGCACGGCAAGGCTGGGATATTGATGCCA1201 TTTTCAATGCGCATCCTCGTCTGGCCATTTGGTATGTGCCCACGAAGCTG1251 CGTCAACTTTGTCATGCTGAGCGCAATAGTGTCRCTGCTTCTAGCTCTGT1301 GTCTGGCGGGGCTGATCAGCTGCCTTTCTAAATTAAAGCCTCACTGAATG1351 ACCGATTTGCCTAGTGATTAATCCTATTTATGGTGTCTGTTAGCAGTGTT1401 TATTCGTGAATGTTTGTAATCTCACTTCATTTAGACTTATAGCAACTAAT1451 TAATCACARTATTATCACATCAATCGTACGTGTTCTTTAATATTTCTTTT1501 ATCTTATTTGATTTATTATCCATAAAACATTTCCGTAGAAAAAAAAAAAA1551 AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA其中，R:A或G; Y:C或T; S:G或C; W:A或T(以黑体显示)黄连木开花基因的制备方法包括如下步骤(a)提取黄连木雌雄株和两性株总RNA，并以其为模板，通过RT-PCR方法合成CDNA第一链；(b)采用5’ RACE和3’ RACE的方法克隆获得全长cDNA。分别提取黄连木雄株、雌株、雌雄同株植物总RNA，扩增三种类型植株编码区序列；(a)黄连木雄株中获得两种LEAFY基因(PcBLFYMl、PcBLFYM2) ； (b)雌株中获得一种LEAFY基因(PcBLFYF) ；(c)雌雄同株植物中获得两种LEAFY基因(PcBLFYF, PcBLFYM3)。上述LEAFY基 因的核苷酸序列为PcBLFYMl 0001 ATGGATCCTGAAGCATTCACGGCGAGCTTGTTTAAGTGGGACCCGCGTGG0051 GGTGGTGCCGCCACAGACCAGGGTGCTGGAACCGGTGGTGCCACTACCGG0101 CAGCGATTTCCGCGGCCACCGCCTTCTCGGTGGTGCGTCCAAGGGAGCTA0151 GGTGGGCTGGAGGAGTTGTTCCAGGCTTATGGGATAAGGTACTACACGGC0201 AGCGAAGATAGCGGAGCTTGGGTTCACGGTGAATACACTTGTGAATATGA0251 AAGATGAGGAGCTTGATGAGATGATGAACAGCCTGTCTCAGATATTTAGG0301 TGGGAACTCCTTGTTGGAGAGAGGTATGGTATTAAAGCTGCTGTTAGAGC0351 TGAGAGGAGAAGGCTTGATGAGGAGGATTCACGAAGGCGTCACATACTGT0401 CTGGTGATACTACCAACTCTGTTGATGCTTTGTCCCAAGAAGGGTTATCT0451 GAGGAACCAGTGCAGCAAGAGAAGGAGGCAGCAGGGAGCGGAGGAGGAGG0501 AACGTGGGACTTAGCGGTGGCAGTGACGGAGAGGAAGAAACAGCGGCGGA0551 GGAAGGGGCAAAGGAAGATAGTGGATGTTAATCACTATGATGAAAATGAA0601 GACGATGAGAATGCTGAAGGCAGTGAGAGACAACGAGAGCACCCCTTCAT0651 AGTGACGGAGCCTGGTGAAGTGGCACGTGGCAAAAAAAACGGCCTTGATT0701 ACCTGTTCCATCTCTATGAGCAATGCCGTGATTTCTTGATCCAGGTCCAG0751 AACATCGCCAAGGAGCGTGGCGAAAAATGCCCAACCAAGGTGACAAATCA0801 GGTGTTTAGGTATGCAAAGAAGGCTGGTGCAAGCTACATTAACAAGCCAA0851 AGATGAGACACTATGTGCACTGCTATGCGTTGCACTGCCTGGACGAGGAG0901 GCATCAGATGCACTGAGGAGGGTTTTCAAGGAAAGAGGAGAGAACGTGGG0951 GGCTTGGAGACAGGCTTGTTATAAGCCACTTGTGGGCATTGCAGCACGGC1001 AAGGCTGGGATATTGATGCCATTTTCAATGCGCATCCTCGTCTGGCCATT1051 TGGTATGTGCCCACGAAGCTGCGTCAACTTTGTCATGCTGAGCGCAATAG1101 TGTCACTGCTTCTAGCTCTGTGTCTGGCGGGGCTGATCAGCTGCCTTTCT1151 AAPcBLFYM2 0001 ATGGATCCTGAAGCATTCACGGCGAGCTTGTTTAAGTGGGACCCGCGTGG0051 GCTGGTGCCGCCACAGACCAGGGTGCTGGAACCGGTGGTGCCACTACCGG0101 CAGCGATTTCCGCGGCCACCGCCTTCTCGGTGGTGCGTCCAAGGGAGCTA0151 GGTGGGCTGGAGGAGTTGTTCCAGGCTTATGGGATAAGGTACTACACGGC0201 AGCGAAGATAGCGGAGCTTGGGTTCACGGTGAATACACTTGTGAATATGA0251 AAGATGAGGAGCTTGATGAGATGATGAACAGCCTGTCTCAGATATTTAGG0301 TGGGAACTCCTTGTTGGAGAGAGGTATGGTATTAAAGCTGCTGTTAGAGC0351 TGAGAGGAGAAGGCTTGATGAGGAGGATTCACGAAGGCGTCACTTACTGT0401 CTGGTGATACTACCAACTCTGTTGATGCTTTGTCCCAAGAAGGGTTATCT0451 GAGGAACCAGTGCAGCAAGAGAAGGAGGCAGCAGGGAGCGGAGGAGGAGG本发明公开了一种黄连木开花基因PcBLFY，本发明还公开了一种黄连木开花基因的克隆，根据其它植物已知LEAFY基因序列，设计兼并引物，以黄连木雄株、雌株和雌雄同株总RNA为模板，采用RT-PCR方法合成cDNA第一条链，5’RACE和3’RACE方法克隆PcBLFY的cDNA全长序列。根据获得的cDNA序列设计引物，通过RT-PCR的方法从黄连木雄株、雌株、雌雄同株植株中分别获得2个、1个、2个序列存在单碱基位点多态性差异的LEAFY基因。本发明公开的内容可供创造早开花结果的转基因育种使用。本发明的重要应用前景是用于黄连木不同性别植株的苗期性别鉴定，用于调节黄连木能源林的植株性别比例，从而大幅提高产量。