重构、靶向半胱天冬酶基因的制备及其用途制作方法

杨安钢, 王成济, 贾林涛, 许彦鸣, 于翠娟, 张立红, 彭朝晖

2002年5月8日

2001年11月14日

2001年11月14日

中国人民解放军第四军医大学

C12N15/79GK1348005SQ0113179

天冬 靶向 半胱 重构 制备 基因

1.靶向和重构半胱天冬酶基因及其载体的构建，按以下步骤进行(1)基因克隆与载体构建①培养人淋巴瘤Jurkat细胞，反转录PCR获得半胱天冬酶(caspase)-3，-6，-7基因，并经测序证实；②用重组PCR将上述基因改造成活性蛋白形式，即重构半胱天冬酶的基因；③将上述重构caspase基因依次与PE转膜结构域序列及抗HER2抗体基因连接，构建靶向半胱天冬酶基因，分别克隆入真核表达载体pCMV和重组腺病毒载体；(2)体外表达和功能检测实验①将重构半胱天冬酶基因在体外培养的肿瘤细胞中瞬时表达或诱导表达，研究其促凋亡活性；②把肿瘤靶向半胱天冬酶基因导入体外培养的人细胞系，筛选得到阳性克隆；鉴定细胞分泌的肿瘤靶向半胱天冬酶蛋白；③共培养实验观察分泌肿瘤靶向半胱天冬酶的建株细胞对HER-2阳性乳腺癌SKBR-3细胞和卵巢癌SKOV-3细胞的杀伤作用；其用途是用抗肿瘤表面抗原erbB2/HER2的抗体、PE转膜结构域和重构型caspase-3构建治疗分子——靶向半胱天冬酶，通过以下途径应用于HER2阳性肿瘤的治疗①将重构和靶向半胱天冬酶的重组病毒表达载体，直接注射入肿瘤组织内部，产生抗肿瘤作用；②用带有前导肽的靶向半胱天冬酶的基因的逆转录病毒载体转化患者的外周血T淋巴细胞，该细胞回输患者后可以分泌产生靶向重构半胱天冬酶，后者通过血液循环到达肿瘤部位，特异性地杀伤肿瘤细胞，并发挥长期的免疫监视作用；③用与②相似的方法建立能分泌靶向半胱天冬酶的患者肿瘤细胞，通过肿瘤组织局部注射，抑制肿瘤生长；④体外表达和纯化靶向半胱天冬酶蛋白，通过静脉或肿瘤组织局部注射，识别并杀伤肿瘤细胞

本发明涉及生物技术领域的基因工程，具体涉及构建具有自发活性的靶向、重构半胱天冬酶基因及其用途，用于杀伤肿瘤细胞截至2001年2月，世界各国共批准基因治疗临床方案532项，涉及病人3436人，其中60％以上是针对肿瘤的许多治疗方案在I期临床实验中取得了显著疗效，有少数已进入II期甚至III期临床但是，这些方案远不能满足临床治疗的需要，迄今仍然没有成熟的基因治疗产品问世目的基因和受体细胞的选择是肿瘤基因治疗的关键环节目前用于肿瘤基因治疗的基因包括细胞因子基因，肿瘤抑制基因，“自杀”基因，以及外源毒素基因等将上述基因转化肿瘤细胞并回输患者，或通过基因修饰淋巴细胞等免疫功能细胞，以增强机体的抗肿瘤免疫反应，或者直接杀伤肿瘤细胞随着人们对细胞凋亡机理认识的深入，已有越来越多的研究者试图通过诱导肿瘤细胞凋亡的途径治疗肿瘤基因治疗中常用的基因转移载体分为病毒载体和非病毒载体两类，前者包括逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒以及单纯疱疹病毒、痘苗病毒等，而后者则有脂质体法、磷酸钙法、电穿孔法和显微注射法等可供选择一般而言，病毒载体的危险性较大，容易造成非特异性感染，以及基因组插入突变等，而非病毒载体转化效率较低，因此，将现有病毒载体进行重组改造，降低其毒性和免疫原性，以及提高非病毒载体的基因转移效率已成当务之急另外，基因治疗的特异性问题也倍受关注，如何使治疗局限于肿瘤组织和细胞，而尽可能少地对正常组织带来损害，将直接决定基因治疗的效率和成败目前多采用两种方法，一是对基因转移载体进行修饰，使之特异地将治疗基因带入肿瘤细胞；二是使治疗基因在肿瘤特异性基因表达调控元件的调控下，专一表达于肿瘤细胞中但这两种方法在实际应用中均不理想总之，目前尚缺乏能够高效、特异地杀伤肿瘤细胞，而且尽可能小地对系统带来毒副作用的基因治疗方案细胞凋亡是机体细胞在生长发育中或病理状态下存在的一种自发的程序化的死亡过程半胱天冬酶(caspase)的切割活化是不同细胞凋亡途径中共同的下游事件Caspase在细胞中以酶原形式存在，活化后作用于多种蛋白质底物，引起细胞凋亡Caspase-3，-6，-7是细胞凋亡最重要的执行分子，它们的活化可以高效地不可逆地诱导细胞凋亡研究表明，将caspase-3，-6，-7的大小亚基颠倒可以得到具有天然活性的caspase分子人原癌基因erbB2/neu/HER2编码一种1255个氨基酸残基构成的受体酪氨酸蛋白激酶，属表皮生长因子样受体家族ErbB2蛋白在乳腺癌、卵巢癌及胃癌等多种恶性肿瘤中，由于基因放大、转录激活等原因表达水平高出正常细胞上百倍，成为一种重要的肿瘤标记物绿脓杆菌外毒素(Pseudomonas exotoxin A，PE)是目前已知的毒性最强的细菌外毒素之一，由假单孢菌属细菌分泌，分子为包含613个氨基酸的单链多肽，由三个主要功能结构域构成Ia(1-252位氨基酸)，主要起细胞识别和结合的作用；其中的第II结构域(253-364位氨基酸)，或253-412位氨基酸，能够使结合在细胞表面的分子内化进入细胞本发明采取的技术方案是1.靶向和重构半胱天冬酶基因及其载体的构建，按以下步骤进行(1)基因克隆与载体构建①培养人淋巴瘤Jurkat细胞，反转录PCR获得半胱天冬酶(caspase)-3，-6，-7基因，并经测序证实；②用重组PCR将上述基因改造成活性蛋白形式，即重构半胱天冬酶的基因；③将上述重构caspase基因依次与PE转膜结构域序列及抗HER2抗体基因连接，构建靶向半胱天冬酶基因，分别克隆入真核表达载体pCMV和重组腺病毒载体；(2)体外表达和功能检测实验①将重构半胱天冬酶基因在体外培养的肿瘤细胞中瞬时表达或诱导表达，研究其促凋亡活性；②把肿瘤靶向半胱天冬酶基因导入体外培养的人细胞系，筛选得到阳性克隆；鉴定细胞分泌的肿瘤靶向半胱天冬酶蛋白；③共培养实验观察分泌肿瘤靶向半胱天冬酶的建株细胞对HER-2阳性乳腺癌SKBR-3细胞和卵巢癌SKOV-3细胞的杀伤作用； 其用途是用抗肿瘤表面抗原erbB2/HER2的抗体、PE转膜结构域和重构型caspase-3构建治疗分子——靶向半胱天冬酶，通过以下途径应用于HER2阳性肿瘤的治疗①将重构和靶向半胱天冬酶的重组病毒表达载体，直接注射入肿瘤组织内部，产生抗肿瘤作用；②用带有前导肽的靶向半胱天冬酶的基因的逆转录病毒载体转化患者的外周血T淋巴细胞，该细胞回输患者后可以分泌产生靶向重构半胱天冬酶，后者通过血液循环到达肿瘤部位，特异性地杀伤肿瘤细胞，并发挥长期的免疫监视作用；③用与②相似的方法建立能分泌靶向半胱天冬酶的患者肿瘤细胞，通过肿瘤组织局部注射，抑制肿瘤生长；④体外表达和纯化靶向半胱天冬酶蛋白，通过静脉或肿瘤组织局部注射，识别并杀伤肿瘤细胞由于被immunocasp-3基因修饰的淋巴细胞本身功能正常，回输这种细胞将可以持续分泌效应蛋白，加之caspase是细胞凋亡的直接执行者，因此对肿瘤细胞的杀伤作用效率更高；Immunocasp-3效应分子通过抗体特异性地识别肿瘤细胞，同时，2种immunocasp-3均在N端融合长的抗体和PE序列，而且它们之间没有可能发生切割断裂的位点，因而推测融合蛋白在通过血液转移过程中和进入肿瘤细胞前，由于不能正确折叠而不具有caspase-3的活性另外，immunocasp-3主要由人源化抗体和人自身蛋白构成，不会诱发体内强烈的排异反应，而且细胞发生凋亡时不引起炎症反应，所以治疗的毒副作用较小本研究可望为HER2阳性肿瘤的靶向基因治疗提供一种新思路对淋巴细胞进行基因修饰，使之分泌产生能特异性地识别和杀伤肿瘤细胞的效应分子，这一兼具细胞免疫和体液免疫特点的基因治疗策略同其它策略相比，具有明显的优势首先，它具有长期持续性，目前采用的基因治疗策略，无论是体外修饰并回输肿瘤细胞，还是病毒载体体内直接感染，都存在治疗物在体内半寿期短、治疗持续时间有限的缺点由于基因修饰不影响淋巴细胞的功能，因此回输这种细胞，将可以持续分泌产生效应分子，从而可以长期发挥免疫监视和杀伤作用其次，这种治疗策略的作用较彻底，将肿瘤特异性杀伤淋巴细胞回输患者后，细胞能通过血液和淋巴循环到达肿瘤周围并进入到肿瘤组织内；另外，由于归巢的作用，这种特异性杀伤细胞能不断循环到淋巴结中定居，这对于手术无法清除的、经血行转移到远处的少量肿瘤细胞，也能有效地识别和杀伤