专利名称：两步免疫测定法诊断癌症的制作方法该项目的内容是用抗体检测癌症具体方法。具体是对NDP-激酶/Nm23和雌激-受激亮氨酸氨太酶(es-LAPase)特异性抗体的研究及其在诊断乳腺癌以及转移性方面的应用。这两种抗体也可用于检测血清，血浆及活组织中NDP-激酶和LAPase水平。对人类疾病如乳腺癌进行有效检测及设计治疗药物的关键在于能够鉴别危险因素和病理生理改变。对癌症类别和程度的准确诊断是选择最佳治疗方案的关键。而病情的程度取决于肿瘤组织学，血液成分测定及细胞标记物检测等方面的综合分析。广泛应用的乳腺癌诊断方法有影像技术，如超声，X射线法。但是这一技术受到影像分辨率的限制，只能诊断大到一定程度的肿瘤。此外，难以区分纤维瘤，囊肿与恶性肿瘤。Elmore和Goetz的最新研究明确强调了这一局限性。活组织的组织学分析是诊断乳腺癌的另一常用方法。这一方法依赖于可见的细胞类型鉴别。虽然这种方法比较客观，但要靠检测者的技术水平。活组织细胞中DNA流动细胞学分析也常被用来测定与肿瘤有关的细胞DNA含量。但是此法需获得活组织并且需要复杂的样品处理过程和昂贵的仪器。在各种与乳腺癌早期形成有关的危险因素中，雌激素及与雌激素有相似活性的雌激素类似物仍是对乳腺癌早期发现和发展的最重要的被检物。在正常生理条件下，靠雌激素起关键作用的器官包括生殖系统和第二性器官如乳腺。此外，雌激素还可以通过促使靶细胞增殖来参与骨生长调节，肝脏，心血管功能及激素代谢周期。这些组织对雌激素的反应能解释雌激素在不同人类肿瘤特别是乳腺肿瘤的发病和发展方面所起的活性作用。我们认为雌激素是通过参与初期和早期细胞功能来调节各种生理功能。因此，有雌激素参与的细胞早期活动导致细胞增殖，加速细胞由G1期向S期发展的速率，从而缩短细胞周期。最近有报道，在相同浓度下雌激素可以通过共同激活细胞周期蛋白D1-CdK4和E-CdK2这两个密切相关的关键的G1调节太来促进细胞增殖。以雌激素为基础的分子诊断测定广泛应用于活组织细胞中雌激素和孕激素受体检测，从而确定此种肿瘤是否对激素治疗有效。但是，它无法估计肿瘤的发展程度及是否转移。此外该法还需取活组织，并且需要待肿瘤长到足以能够触及或用影像技术检测的程度。NDP-激酶活性与多种生理过程有关，包括DNA和RNA合成，AMP循环周期，超氧化物代谢及DNA修复酶活性。一般说来，NDP-激酶的活性与细胞增殖是平行的。例如，测定细胞液NDP-激酶活性是在细胞增殖过程中进行的。另外可以降低具有高度转移倾向的肿瘤细胞中RNA水平的Nm23基因与NDP-激酶基因非常相似。NDP-激酶帮助细胞内DNA与RNA转换成磷酸化形式。多数NDP-激酶活性是在细胞液中。也存在于其它细胞成分中，例如微管蛋白环，人类及兔血小板分离的血浆膜，牛脑微粒物质。NDP-激酶的广泛分布表明其在核酸，超氧化物代谢，AMP的合成周期等细胞增殖和分化的基本细胞过程中所起的活性作用。
由于NDP-激酶参与细胞增殖和分化，使其成为诊断癌症的一个细胞标记。这一方法是通过肿瘤组织的免疫组织化学分析实现的。然而这一研究并未清楚说明NDP-激酶的存在与肿瘤细胞存在之间的相互关系。
已对与肿瘤特别是乳腺肿瘤有关的细胞标记物进行了研究。其中LAPase与乳腺癌发病有关。血清LAPase水平的变化也与其他癌症或疾病如系统性红斑狼疮，心肌梗塞和病毒感染有关。因此以这种血清酶测定为基础的诊断不具特异性。这种非特异性可能与其它LAPase同工酶存在有关。
显然，迫切需要一种快速，灵敏，较少侵害性的方法来对乳腺癌进行诊断和分期，特别是能够反映肿瘤转移的标记物和指示雌激素活性的标记物。
目前的研究提供了这一方法。这一方法利用对NDP-Kinase和es-LAPase特异性单克隆抗体来检测血液和组织中的这些标记物。这些标记物的酶活性水平与肿瘤特别是乳腺肿瘤的程度和转移有关。这一免疫测定用血液或组织样品。它的另一优点是通过使用两个标记物使假阳性结果大大降低。如果只使用一个标记物，由于这一标记物的水平可能受其它生理条件影响而增加假阳性结果。
发明概述目前的尝试是用抗体检测癌症。具体说是用对NDP-Kinase/Nm23和es-LAPase特异性抗体诊断原位导管癌及乳腺癌的转移。也可用于检测血清，血浆或组织中的NDP-激酶和LAPase水平。
我们可以提供通过测定样品中NDP-Kinase和es-LAPase水平来检测乳腺癌的方法。
也可以通过测定样品中NDP-Kinase和es-LAPase水平来检测病人的转移性癌症。还能用NDP-Kinase抗体与模拟雌激素对es-LAPase特异性抗体检测血清，血浆及组织中的NDP-Kinase和LAPase水平。
图例说明以下用图说明试验特点图一说明含有未变性NDP-Kinase/Nm23的样品的Western Blots中MAb4A12的反应性。未变性PAGE之后的原细胞液(lane1)，HL60细胞中NDP-Kinase/Nm23的纯制剂(lane2)，重组Nm23-H1(Lane3)与MAb 4A12的反应。用MAb 4A12可鉴别出所有样品中相同的蛋白组分具有同样的电泳速度。
图二说明非变性PAGE之后，抗-NDP-Kinase/Nm23 MAb 4A12单克隆抗体对原始细胞提取物的反应。一个是经染色的原始细胞提取物对NDP-Kinase/Nm23活性(lane1)。另一个是转移到醋酸纤维素上并和抗-NDP-Kinase/Nm23 Mab4A12单克隆抗体反应(lane2)。
图三表明抗CD19/抗-NDP-Kinase/Nm23双重标记的健康妇女的外周血细胞的双变量点图分析。双点作图分析是在双重标记的PBMC1s上用羊抗鼠FITC抗体检测作为第二标记物的MAb 4A12。对照样品与预先免疫的控制免疫球蛋白IgG1反应，然后再用羊抗鼠IgG-FITC联合抗体。Section1全部外周血细胞双变量作图分析。Section1ACD19+标记细胞〔LF2〕电控，然后分析它们对抗-NDP-Kinase/Nm23 Mab 4A12单克隆抗体的同时存在的活性。如Section1B所示，〔LF2〕抗-CD19+细胞对〔LF1〕抗-NDP-Kinase/Nm23 4A12单克隆抗体作图表明，大约93％双重标记的B细胞对抗-CD19和抗-NDP-Kinase/Nm23 4A12单克隆抗体都有反应。如Section2所示所有与对照IgG免疫球蛋白反应的淋巴细胞都未起反应，而只有那些与抗-CD19和抗NDP-Kinase都反应的淋巴细胞有选择性地与标记的B细胞反应。
优选实施方案的描述此项发明是用抗体诊断癌症。具体说，是对NDP-Kinase/Nm23和es-LAPase的特异性抗体的研究及其在诊断乳腺原位导管癌(DCIS)及其转移。更进一步，这一检测系统包括用NDP-Kinase/Nm23特异性抗体检测血清，血浆和组织中的NDP-Kinase水平，与es-LAPase特异性抗体联用检测血清，血浆和组织中的NDP-Kinase和LAPase。
早期研究显示可能存在与NDP-Kinase具有相同等电点和分子量的同功酶。相反，对与细胞膜有关的NDP-Kinase和细胞液NDP-Kinase研究表明，两种酶是完全一致NDP-Kinase单一酶形式。这一研究发现由HL60细胞提纯的活性细胞液NDP-Kinase是一种大约67kDa的寡聚物，由两个大约17kDa和33kDa的亚单位组成。细胞液NDP-Kinase是单一酶，所表现的同功酶性质是蛋白磷酸化的答7b度不同所致，而不是NDP-Kinase蛋白水解产物。
在目前的发明中，我们从HL60细胞中制备出纯细胞液NDP-Kinase单克隆抗体。抗体之一Mab 4A12能选择性与NDP-Kinase活性寡聚物反应。该酶变性后的单体组分不能被识别。因此，还需确认本身的NDP-Kinase与Mab4A12抗体的结合。NDP-Kinase既存在于细胞质中又存在于与膜有关的复合物中。NDP-kinase在两种状态中具有完全相同的动力学和物理化学性质。
更进一步，我们也提供对es-LAPase的特异性抗体。这一抗体的制备方法在同时申请的专利中详细介绍。
目前单克隆抗体是根据Campbellde和Lietzke，R，Unsicker，K传统方法制备的。该法将老鼠骨髓瘤细胞经组织培养与抗体结合从免疫老鼠产生杂交细胞，这些细胞产生大量的单一抗体分子。即用抗原免疫动物如小鼠，大鼠，兔，羊，马或牛制备产生抗体的细胞。免疫步骤及抗原浓度取决于能够提供足够量的产生抗体的细胞。这些产生抗体的细胞可以是脾细胞，淋巴细胞，淋巴结细胞或外周血淋巴细胞。
选择适当的融合启动子，使这些产生抗体的细胞与骨髓瘤细胞融合，细胞系来源于各种动物，如鼠，兔及人类。许多小鼠骨髓瘤细胞系是已知并可从医学科学团体获得，如美国分类培养收集机构，Rockville，Maryland所用的这些骨髓瘤细胞对培养基应具有选择性以使未融合的骨髓瘤细胞在选择性介质中不能存活，而杂交细胞则能存活。最常用的细胞系是抗8-氮鸟票呤系，它含有较少的次黄票呤-鸟票呤-磷酸核磷d转移酶，因此不能在HAT培养介质中生长。一般说来，该细胞系应是“非分泌”类，因而不产生抗体。所选的融合启动子是聚乙二醇，其分子量在1000到4000之间。也可用聚乙烯醇，病毒或电场作为融合启动子。
这些存活的细胞(杂交物)需经筛选，找出能分泌特异性抗体的细胞。通常用ELASA进行初选。进一步，将这些杂交物培养上清液加到预先加好抗原的微滴定盘中或硝酸纤维膜上，这里所用的抗原是从HL60细胞提纯的NDP-Kinase/Nm23。培养上清液的特异抗体可用第二标记抗体检测。最常用的第二抗体是用过氧化物酶标记的抗鼠IgG。对NDP-Kinase抗原阳性的培养液用限制稀释法克隆。第二杂交物培养液用上法进行再筛选。通过测定抗体是否与抗原结合来评估培养液并测定抗体结合的动力学参数。对选择的培养液再克隆直到培养液稳定并获得克隆。刚杂交之后的融合产物含有大约80个染色体。克隆过程是选择那些仍保留抗体生产的染色体密码的细胞。克隆过程一直重复到100％的亚群呈现特异性抗体的生产，这代表杂交物“稳定”。此外杂交物培养皿可能含有多种克隆，其中有些可能不产生抗体。克隆过程允许选择从单一细胞衍生的阳性杂交物。
我们的发现之一是用杂交细胞系4A12制备单克隆抗体4A12。这一单克隆抗体对NDP-Kinase/Nm23有特异性。这一细胞系在1994年5月27日存于美国分类培养收集处，序列好为CRL 11634.
4A12抗体是IgG2a亚型，能够鉴别NDP-Kinase/Nm23膜及细胞液形式。这一抗体能和许多细胞类型结合，包括hemapoietic系。然而该抗体只对B淋巴细胞有特异性并不识别其它淋巴细胞。在这一方面具有转移性的乳腺癌病人的NDP-Kinase阳性B细胞明显降低。因此这一抗体在诊断转移疾病方面的作用是显而易见的。
另一例子是用杂交细胞系7B6制备7B6抗体。这一单克隆抗体对es-LAPase有特异性。这一杂交细胞于2000年3月23日储存于加拿大国际存放机构中。
此外，还包括任何具有抗体活性结合区域的片段，如Fab，F(ab)2和Fv片段。这些片段可用已知技术从7B6或4A12抗体获得。
更具体的还有一些抗体和片段，它们能够结合相同抗原测定物如7B6或4A12抗体。包括(但并不仅限于)与7A6和4A12抗体有相同抗原性却来源不同或适于不同环境的或具不同结合亲和力的抗体。显然这一类及其抗体的变种可用重组类转换和技术制备，这些技术可在“技术”里找到。
这些单克隆抗体可用生物反应器或从腹水中生产，这两种方法均来自“技术”里。
这些单克隆抗体可用于诊断乳腺癌的转移和程度及其它癌症如glial origin脑癌。这一诊断是用免疫测定系统来测定血液和组织中NDP-Kinase/Nm23及es-LAPase水平。
这一发明的另一方面是免疫沉淀。用类似上皮细胞的母细胞的细胞组分中的MAb 4A12进行免疫沉淀，这些细胞是乳腺肿瘤组织分离的。试验结果表明基质层中NDP-Kinase活性降低，而细胞cytopholic层活性增强。更进一步，用MAb 4A12进行免疫沉淀表明，患DCIS并转移的妇女的NDP-Kinase水平增高。
另一方面MAb 4A12可用于检测与NDP-Kinase/Nm23相关的表面或膜细胞。特别是分析了人外周血中的MAb 4A12反应性和分布。已发现单细胞和颗粒细胞均可与MAb 4A12反应，但是只有淋巴细胞能和抗体反应。进一步分析证实只有B淋巴细胞，更确切地讲是CD19+淋巴细胞与抗-NDP-Kinase/Nm23抗体反应。而且，检测出乳腺及脑肿瘤病人的CD19+B细胞中被MAb4A12所识别的抗原与转移成负相关并增加肿瘤的侵害性。此外，还用MAb 7B6与MAb 4A12共同检测细胞表面和膜的NDP-Kinase/Nm23和es-LAPase.
免疫测定是将组织或血液样品与抗体接触并测定抗原-抗体加合物。也可将样品进行免疫沉淀来测定免疫沉淀酶活性和水平。
有些免疫测定使用双重抗体检测抗原的存在。这些技术在“抗原-抗体反应基本原理”中有介绍。这些系统称为快速形式系统，因为它们适用于快速检测抗原的存在。这一系统要求抗原与抗体有很强的亲和力。
目前试验显示，用一对抗体检测NDP-Kinase/Nm23的存在，每个抗体对NDP-Kinase都有特异性。这对抗体之一指的是“检测抗体”，另一个是指“捕获抗体”。我们所发明的单克隆抗体既可单独用作捕获抗体或检测抗体，也可以在一个测定中同时用作两者。另一方面可用双抗体三明治法测定生物液体样品中的NDP-Kinase。在此法中，抗原是夹在检测抗体和捕获抗体之间的，捕获抗体被不可逆地固定在固体支持物上。检测抗体含有可检测的标记以便测定抗原-抗体复合物从而检测抗原的存在。根据上述的双重抗体三明治法，在各自检测系统中用各自标记的特异抗体测定NDP-Kinase和es-LAPase。
早期使用的固体支持物是在放射免疫学和酶免疫学领域里常用的盘，试管或聚苯乙烯珠。最近，许多多孔性材料如尼龙，硝酸纤维素，醋酸纤维素，玻璃纤维及其它多孔聚合物被用作固体支持物。
方法之一是使用流通免疫测定设备。Valkirs等发明了一种设备，包括对被检抗原特异性抗体结合到多孔性膜或过滤器上，将液体样品加入该膜。当液体流过膜时，被检物与抗体结合。加完样品之后，再加标记的抗体。对所标记抗体的检测能指示样品中被检物的存在。
另一使用流通设备的例子是Kromer等所描述的，一个试剂传送系统包括一个基质，用试剂或分散在水溶性聚合物中的组分来控制放在基质下的传递到反应基质中的试剂的溶解速度。
在迁移类型测定中将膜浸在测定所用的试剂中，产生分析物测定带，该带结合了标记分析物，因此可读取检测标记。例如，见Tom等的专利和Zuk的专利。迁移测定装置通常将试剂与有色标记接触，不需再加其他物质就有可见的检测分析结果。例子见Bernstein。我们所研究的单克隆抗体可用于所有类型的流通设备。这些流通设备也可用于检测单一样品中有多个被检物时的测定。因此，这些流通设备可用于检测es-LAPase和细胞液NDP-Kinase/Nm23.
根据目前的试验，直接标记是目前所用的标记方法之一。直接标记被定义为一种实体，其在自然状态下，可用肉眼或借助于光学滤片观察到，或用UV激发产生荧光。在目前这些有色标记例子中，包括金属溶胶微粒，例如Leuvering所描述的金溶胶微粒；GribnauMay所描述的染料溶胶微粒；May，_supra，Snyde所描述的有色胶乳；或Cambell等提出的包胶的脂质体染料。其它直接标记有放射核甘太，荧光或发光。除了这些直接标记方法外，也可用间接酶标法。各种类型的免疫酶联测定都是众所周知的，如硷性磷酸酶，辣根过氧化物酶，溶菌酶，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，乳酸脱氢酶，尿激酶等在酶免疫测定ELISA和EMIT文中有详细介绍。
其它用单克隆抗体测定NDP-Kinase/Nm23和es-LAPase的生物诊断方法在G.Grenner等的专利中有介绍。
在诊断检测试验中常用取样试管从病人身上取血。试管内壁起到单克隆或多克隆抗体载体作用，并且需要试剂或检测方法产生可测量的信号。这一设计是将捕获抗体固定在测定试管壁上。血样从病人体内取出后，只需震摇试管以使内部的检测抗体与血样中的NDP-Kinase/Nm23或es-LAPase反应。这些单克隆抗体或是当作捕获抗体，或是作为检测抗体。必需使用除去红细胞的样品以使红细胞不影响分析结果。如果血样中含有被检物，就会夹在捕获抗体和检测抗体之间，这些抗体含有适当的标记进行直接检测或和试剂反应后进行间接测定。然后清洗固体支持物(试管)以除去未结合的标记物。许多物质都可用作该法的固体支持物，如试管壁，塑料杯，玻璃珠，塑料球，量桶及微滴定盘，纸和玻璃纤维。
当前有几种自动分析装置可对许多样品同时进行快速分析。这些自动装置有连续/随机测定装置。例如PB诊断系统的OPUS及IMX分析仪。总之，样品操作的全部过程，从吸取样品到测定装置，培养，及所得信号的读取均是自动控制。自动测定系统一般包括一系列工作站，每一个工作站完成检测过程的一个步骤。这些检测装置可以用各种方式由一个工作站转到下一个，使检测步骤能够按顺序进行。测定装置还包括试剂储存，液体混合，稀释样品槽。还应有一个开口允许加入已知量的液体，如有必要把所需试剂加入多孔膜。还有一个窗口能够读取多孔膜中样品的荧光或有色光变化例如分光光度计或荧光计。
PB诊断系统的自动检测系统见US专利5051237；5138868；5141871和5147609。
关于IMX分析仪见“Abbott IMX自动操作台免疫化学分析仪系统”及US专利4956148题为“锁架(Locking Rack)及一次性样品盒”，它描述了用与AbbottIMX系统连接携带许多反应细胞的演示。此技术的进一步发展指定给Abbott实验室，在加拿大专利2069531中有说明，这一免疫化学分析仪系统能够用现有的仪器一次分析三到四个样品。用这一系统使用者把一组中三批样品同时测定而不需分三次分析。单克隆抗体可用于自动分析仪。
更进一步，可用于我们发明的单克隆抗体的免疫化学分析仪系统有生物传感器或光学免疫传感器。总之，光学生物传感器是使用光学原理定量把所需的化学和生物化学浓度或活性转换成电信号。这些系统可分为四类；光纤技术和相应的光学设备；反射技术包括多组成反射光度计，及荧光毛细管填充装置。光纤技术包括瞬间场荧光，光纤毛细管和光纤荧光敏感器。一体化光学设备包括计划瞬间场荧光，输入光珊连接免疫敏感器，Mach-Zehnder干涉仪，Hartman干涉仪，示差干涉仪敏感器。这些光学免疫敏感器在综述文章中有概述。
另一免疫化学分析法是流动细胞学分析。该法是用含有抗原的样品与用荧光标记的单克隆抗体反应。样品经过具有一定波长的激光束，该波长能激发抗体的发色团。每一个有抗体结合的微粒或细胞会产生荧光因而可以测定。这一技术能够分析特定的细胞类型尤其是特定的血细胞类型。因此，可用于测定带有NDP-Kinase/Nm23或es-LAPase抗原的B细胞。
NDP-Kinase和LAPase活性也可以用血浆免疫沉淀法测定，通过MAb4A12和MAb7B6与其共价结合到固体载体上进行免疫沉淀。简言之，将血浆或其稀释液加到共价键合的MAbs上，恒温至确保样品中的标记完全与单克隆抗体结合。即可测定单个酶活性。
另一具体实验是用单克隆抗体检测血液，血清，血浆或组织样品。这一检测是在具有检测部分和捕获部分的滤膜或固体支持物的装置中进行的。检测部分含有检测抗体，它将与NSP-Kinase/Nm23反应。检测抗体可逆性固定在固体支持物上，使用时将随样品一起移动。最好标记检测抗体。例如用放射核甘太，酶，荧光组分，发光组分或如前所述的有色标记。捕获部分包括捕获抗体，将其不可逆地固定在固体支持物上。这些捕获和检测抗体及必需试剂用标准技术固定在固体支持物上，如前所述的流通型免疫测定设备。总之，用非极性蛋白亚结构与非极性支持材料之间的相互反应将抗体吸附在固体支持物上。
在两步测定中使用与NDP-Kinase/Nm23反应的抗体和另一个对人体es-LAPase专属抗体结合。乳腺癌病人的血清LAPase较高，有转移的乳腺癌病人的LAPase更高。进一步，曾暴露在雌激素中的乳腺肿瘤细胞培养液的上清液中的es-LAPase更高。因此，在两步测定中同时应用两种抗体检测血样中NDP-Kinase/Nm23和血清es-LAPase水平。这一测定克服了以前旧技术的限制。在这一旧技术中用两种对乳腺癌病人转移都敏感的标记物。因此，可以通过降低假阳性概率而增加对乳腺癌检测的特异性和准确性。两步测定法也可用于检查具有患乳腺癌危险的病人。由于血清es-LAPase和NDP-Kinase/Nm23都受雌激素的影响，因此，危险病人包括服用雌激素类避孕药者，激素治疗病人或具有不正常激素类型的人。在这方面，用雌激素治疗的妇女其血清中的这两种标记可用于测定NDP-Kinase和es-LAPase水平是否增加。NDP-Kinase和es-LAPase水平增加与发展乳腺癌的危险增加有关，这类妇女应减少雌激素的服用量。
可见，NDP-Kinase/Nm23和LAPase的基线水平可由正常病人提供。因此，高于基线水平的NDP-Kinase/Nm23和es-LAPase可以测定。这一测定既可用与正常结果比较的方法也可用调节免疫测定灵敏度以使高于特定限度的值呈阳性结果的方法。
以上的发明还需改进以便区分细胞液和与膜相关的NDP-Kinase/Nm23。
为更好地理解我们的研究结果，特举例说明。以下例子只帮助理解，并不说明我们的研究仅限于此。
示例例一从HL60细胞中分离和提纯细胞液NDP-Kinase从HL60细胞中提纯细胞液NDP-Kinase的方法见Pulido-Cejudo等(FASEB J3608a，1989)。简言之，这一细胞提取成份来自用15g(湿重)PBS缓冲液洗涤HL60细胞微粒，将其加到磷酸葡萄糖柱上(P11)(1。6cm×28.0cm)，该柱预先用磷酸缓冲液(50mM磷酸钾pH7.0，2mMMgCl2，1mMPMSF，，1mMDTT和10％glycerol)。平衡过。再用300ml同样的缓冲液以0.1ml/min.的流速洗涤。未结合的蛋白质经高速离心浓缩成10ml，高速离心浓缩用YM5膜(5000M.W.cutoff，AmiconDiv.，Danvers，MA.，USA)。该浓缩物加到DEAE葡聚糖柱(2.6cm×28.5cm)上，该柱预先用Tris-缓冲液(50mM Tris-HCl pH7.5；2Mm MgCl2；1mM PMSF；1mM DTT和10％(v/v)glycerol)平衡并洗涤。用线性洗脱剂(含有0到1M NaCl的Tris缓冲液)洗脱NDP-Kinase/Nm23，洗脱速度为0.50ml/min.。用G.Pulido-Cejudo等所描述的方法(J.Chromatogr.B 660(1994)37-47)测定经提纯的NDP-Kinase/Nm23的活性。即通过测定以dADP作为磷酸盐受体的dATP消耗量及一定量的酶来测定NDP-Kinase/Nm23活性。在NDP-Kinase/Nm23调节的磷酸盐转移到未标记的dADP上之后，用DEAE离子交换试纸(DE81)从剩余的3HdADP中分离3HdATP。在使用之前所有的脱氧核甘酸和核甘酸需经离子交换色谱纯化。将23mM每一种核甘酸分别加到Partisil 10SAX分析柱上，该柱需用0.4M NH4H2PO4，pH3.9进行平衡。两个样品的等度洗脱为1700至1800psi(Waters HPLC system Model 510)。纯化后的样品用氨调pH至7.0，用分光光度法在260nm测定最终浓度。将含有NDP-Kinase/Nm23活性的组分集中并用超速离心浓缩。将NDP-Kinase/Nm23浓缩物加到Sephacryl S-200柱(2.6×51cm)上，该预先柱用Ttris缓冲液平衡。经这一纯化步骤后便可得到所需的活性物质。每一步提纯后都要用Pulido-Cejudo(J.Chromatogr.B 660(1994)37-47)的方法测定其浓度。简言之，100-200ul样品用去离子水透析，然后把每个样品2-20ul放入聚乙烯管中。样品在110℃干燥60分钟。接著用250ul冰醋酸中和。然后使样品与500ul下列印三酮-还原印三酮溶液反应，该溶液组成为2g印三酮，150mg还原印三酮(Sigma)溶于65ml 2-甲氧基乙醇，然后加入35ml 4M醋酸钠(pH5.5)。将试管于110℃恒温15分钟。加入2.5ml 5％(v/v)乙醇，然后在570nm测定其吸收度。蛋白质含量可由吸收曲线得到，该曲线是由1-10ug BSA的样品得到的。由HL60细胞提纯细胞液NDP-Kinase/Nm23的摘要见表1。表1从HL60细胞中提纯NDP-Kinase简介Total SpecificstepProtein1Activity2Activity2Fold Yield(mg) (nmol/min.) (nmol/min.) (％)Homogenate 875 125 0.141 100Supernatant 623 102 0.16 1.1581.60CellulosePhosphate135 100 0.74 5.1280.00CelluloseDEAE 1.18 1411.86 83.52 11.20SephacrylS-2000.006 6 1000 70.42 4.801.蛋白含量是在硷性水解后测定的，对水解产物定量印三酮测定。
2.用first-order测定法检测。
例2es-LAPase的分离和提纯人类肿瘤组织的乳腺癌母细胞用100nm 17-B-Estradiol刺激24小时，或用培养介质作对照。细胞介质为RPMI 1640培养介质+10％FCS+100U/ml青霉素+100ug/ml链霉素。经在无缝葡聚糖试管(MV 12,400)中用PBS降解24小时(4℃)后收集上清液。然后用HPLC-凝胶渗透色谱与DEAE-纤维素和Bestatin-琼脂糖凝胶亲和色谱从降解的细胞上清液中纯化LAP。简言之，将细胞上清液倒入Bio-Sil SEC-250柱(600×7.5mm)上，该柱子用含有100mM磷酸钠(pH6.8)，100mMNa2SO4，1uM ZnCl2，和10％甘油缓冲液预先平衡。然后用300ml同样的缓冲液以0.5ml/min.的流速洗涤柱子。用YM5膜高速离心将蛋白浓缩至10ml。浓缩液再经DEAE纤维素柱(2.6×28.5cm)，此柱先用50mM Tris-HCl缓冲液(pH7.5)；1uMZnCl2；和10％(v/v)甘油平衡并洗涤。Bestatin-亲和柱的制备是根据厂家提供的方法，用Ultralink EDC/DADPA Amide结合基质通过用100mg纯Bestatin和EDC/DADPA基质反应制备的。在加入含LAP的洗涤液之前，将Bestatin亲和柱用10ml Tris-HCl(pH8.0)含1uM ZnCl2缓冲液平衡，再用300ml该结合缓冲液洗涤。LAPase用蠕动pump以0.10ml/min.的流速通过这一系统进行再循环两小时。再循环后用八倍柱容量的结合缓冲液洗涤柱子。用线性洗脱液(0-0.5M NaCl)(含有1uM ZnCl2的10nM Tris-HCl pH 8.0)洗提Bestatin键合的LAPase。在280nm测定洗脱下来的键合LAP。提纯的LAPase分装成500ul储存于50mM Tris-HCl pH 7.8和50uMZnCl2溶液中。每一步提纯后都要用Pulido-Cejudo(J.Chromatogr.B 660(1994)37-47)的方法测定其浓度。简言之，100-200ul样品用去离子水透析，然后把每个样品2-20ul放入聚乙烯管中。样品在110℃干燥60分钟。接著用250ul冰醋酸中和。然后使样品与500ul下列印三酮-还原印三酮溶液反应，该溶液组成为2g印三酮，150mg还原印三酮(Sigma)溶于65ml 2-甲氧基乙醇，然后加入35ml 4M醋酸钠(pH5.5)。将试管于110℃恒温15分钟。加入2.5ml 5％(v/v)乙醇，然后在570nm测定其吸收度。蛋白质含量可由吸收曲线的到，该曲线是由1-10ug BSA的样品测得的。
例3单克隆抗体MAb 7B6(抗-LAPase)和MAb 4A12(抗-NDP-Kinase)的生产和纯化这一方案中的方法如免疫抗原的制备，免疫动物脾细胞的制备，脾细胞与骨髓瘤细胞的融合，及融合细胞在选择性HAT介质中的涂铺均来自Campbell所描述的及Lietzke和Unsicker所详细描述的方法。与标准方法不同，我们用于生产单克隆抗体的方法是用高纯度的NDP-Kinase(7000倍纯度-见表1)进行第一免疫，而不是粗提物和部分提纯的酶制剂。腹水液的制备是在注射3×106骨髓瘤细胞之前一周，通过用500l去甲植烷启动BALB/C小鼠而获得的。20天之后收集腹水液。从腹水液中提纯IgG免疫球蛋白是根据厂家的说明用3ml蛋白G琼脂糖凝胶4FT柱上进行亲和色谱法。
对NDP-Kinase单克隆抗体的筛选是用在硝酸纤维素上的点图免疫染色法。即将0.5-1ug NDP-Kinase(5ul)点在硝酸纤维素膜上，在37C与PBS/3％BSA(固定溶液)干燥，并固定。在固定溶液中制备的鼠单克隆抗体(1/100和1/500倍稀释)与固定的NDP-Kinase一起于37C恒温17小时，然后用免疫过氧化物酶法测定。
单克隆抗体MAb 4A12于1994年5月27日存放在American Type CultureCollection，标号为CRL 11634。
制备分泌对17-B-雌二醇-响应物LAPase的鼠单克隆抗体，免疫抗原制备方法，免疫动物脾细胞的制备，脾细胞与骨髓瘤细胞的融合，及融合细胞在选择性HAT介质中的涂铺均来自Campbell所描述的及Lietzke和Unsicker所详细描述的方法。
总之，基本的免疫反应是用提纯的es-LAPase经脱盐后进行的。在14，35和56天用提纯的es-LAPase进行促进。在24和45天筛选BALB/C小鼠。小鼠在第59天杀死，将最好的脾细胞与骨髓瘤细胞融合。通过在硝酸纤维素上的点图免疫染色进行筛选。
用限制稀释单细胞克隆获得杂交瘤克隆7B6。准备四个系列稀释试管，其中含有杂交瘤细胞及20％FBS +2X OPI。将每个稀释液100ul加到96孔的盘中，并在个孔中加入50ul脾喂养细胞，放于37℃ 5％ CO2恒温箱。第七天，从个孔中取上清液并用在硝酸纤维素上的点图免疫染色进行筛选。
把杂交瘤克隆7B6细胞由96孔盘中转移到0.5ml培养液中，该培养液含有20％FBS +1X OPI+ 1X HAT放于24孔的盘中。一旦细胞浓缩，将其5mls转移至60mm盘，然后再成10ml转移至100mm盘中。当60mm盘中的细胞被认为没有次黄票呤，胸腺密定脱氧核甘，氨基票呤，7B6杂交瘤细胞将继续生长直到成指数级生长。抗-LAPase，MAb 7B6从收集的杂交瘤7B6细胞上清液中用免疫纯的IgG亲和色谱分离。用在硝酸纤维素上的点图免疫染色进行筛选。
MAb 4A12与MAb 7B6类型用Sigma的免疫分类试剂测定。即单克隆与预涂分类硝酸纤维膜结合，然后用灵敏的生物素-抗生物素蛋白-酶检测系统进行免疫测定。MAb 4A12的类型是IgG2a，MAb 7B6为IgG1a。
例4雌激素对细胞液与乳腺癌母细胞系的Stromal细胞部分中NDP-Kinase/Nm23活性作用乳腺肿瘤细胞系母细胞与100nM 17-B-雌二醇一起恒温24小时。用只与细胞培养液一起恒温的细胞作对照。细胞液和基质细胞组分用G.Pulido-Cejudo提出的方法分离。每种细胞组分的NDP-Kinase/Nm23活性用例子交换-HPLC测定。
分离的细胞液和stromal细胞及由HL60提纯的NDP-KI-inase/Nm23，重组Nm23-H1在不变性条件下进行电泳。将胶电转移到硝酸纤维膜上。膜与Tris缓冲液(TBS)在37℃反应一小时，然后用1∶100倍稀释(TBS)的NDP-Kinase/Nm23(MAb4A12)探针测定。用1∶500倍稀释(TBS)的羊-抗0鼠-硷性磷酸酶反应，则有可见带出现，然后用BCIP和NBT为底物的硷性磷酸酶底物缓冲液进行比色测定。
含有NDP-Kinase/Nm23的胶在不变性条件下进行电泳，并用Lam和Packham的方法染色测定NDP-Kinase/Nm23活性。含有NDP-Kinase/Nm23的样品用预先吸收在蛋白-A-琼脂糖凝胶微珠上的MAb 4A12单克隆抗体进行免疫沉淀。首先蛋白-A-琼脂糖凝胶-MAb 4A12免疫亲和系统用10％FCS-RPMI 1640反应2小时，用10mMTris-HCl(pH8.0)洗涤。已知NDP-Kinase/Nm23活性的样品(100pl)与未反应的蛋白-A琼脂糖凝胶-微珠或蛋白-A-琼脂糖凝胶MAb 4A12系统一起在搅拌下于4℃培养过夜。培养后用Larn和Packham的方法测定上清液中的NDP-Kinase/Nm23活性。
如表2所示，经雌激素刺激后的细胞液组分中的NDP-Kinase/Nm23活性几乎是空白的40倍。然而，雌激素暴露可以增加细胞液中NDP-Kinase/Nm23活性，在膜结合的NDP-Kinase/Nm23活性则相反。
表2在stromal和细胞液的细胞组分中NDP-Kinase/Nm23活性NDP-Kinase/Nm23活性(umoles dATP/ug)Condition Stromal CytosolicControl 6.5±0.2×10-11.8±0.2Estrogen1.1±0.1×10-244.8±2.1(100nM)NDP-Kinase/Nm23酶活性用G.Pulido-Cejudo等的方法测定。
对未反应的NDP-Kinase/Nm23的细胞表面分布进行分析。如

图1所示，对原细胞液制剂(lane1)和由HL60细胞提纯的NDP-Kinase/Nm23(lane2)和重组Nm23-H1(lane3)在未变性PAGE上进行Western Blots，结果表明用NDP-Kinase/Nm23MAb 4A12单克隆抗体，所有的样品的电泳结果都有相同带。
进一步的试验来鉴别蛋白带的一致性，用MAb 4A12对未变性PAGE的原细胞提取物进行鉴定并转移到硝酸纤维素上。如图2所示，一个样品对NDP-Kinase/Nm23活性染色(lane1)，第二个与抗-NDP-Kinase/Nm23 MAb 4A12单克隆抗体反应(lane2)。含有NDP-Kinase/Nm23活性的蛋白带(lane1)，与用MAb4A12单克隆抗体的Western blot(lane2)具有完全相同的位置。总的说来，这些结果证实了单克隆抗体MAb 4A12的专属性，并提示后一抗体能够识别活性NDP-Kinase/Nm23细胞液单聚物。最后，这一抗体用于研究NDP-Kinase/Nm23在外周血细胞中的分布，这些外周血细胞是从正常人和患有转移性癌症(肺和脑)的病人的到的。
例5正常人和患有转移性乳腺癌妇女病人外周血细胞中NDP-Kinase/Nm23的流动细胞学细胞分布将正常妇女和患病妇女的全血在4℃以1500rmp速度离心10分钟。吸去上清液，用等体积的PBS稀释，加到FIcoll-Paque上。继续以1500rmp速度离心30分钟，在界面上收集PBMC。用PBS洗涤细胞三次。
用两种免疫荧光方法将全血细胞染色。即，将20ul MAb 4A12抗体(200ug/ml)或对照IgG1，加到100ul血样中。恒温30min.后用100ul冷PBS洗涤并溶解细胞，然后，加入羊-抗-属IgG-FITC-结合抗体。将混合物恒温20分钟，再洗涤，用100ulPBS溶解细胞。血细胞进一步和20ul下列phycoerthrin-结合的鼠抗体之一培养IgG-PE(对照)，Leullc-PE(anti-CD16)，Leu 19-PE(anti-CD56)。在恒温15分钟后，在自动Q-prep工作站处理红细胞，这一工作站能够连续输送红细胞溶解试剂，一种白细胞稳定剂和固定剂。在erythrocyte水解后再用PBS洗涤细胞两次并用1ml 2％低聚甲醛固定。样品用带有空气冷却的氩离子激光(10mwatt)流动细胞学分析仪分析。固定激发波长在488nm同时得到了FITC和PE的激发光。依据在双波长显示器上前光束(FAS)和侧光束(SS)，淋巴细胞与单细胞和粒细胞有明显区别。在细胞周围有一个电子门用于分析，此电子门具有对粒细胞，单细胞，和淋巴细胞有光色散性质。
在细胞周期中，提出膜键合的NDP-Kinase/Nm23可能调节腺甘酸循环酶活性，这一调节是通过调节G蛋白(Gs和Gl)活性所需要的GTP水平，而蛋白G又可调节腺甘酸循环酶的激和和抑制。这一观察为我们提供了测定抗-NDP-Kinase抗体(MAb 4A12)对外周血细胞(PBMC)的反应性。用MAb 4A12抗体，许多藻红蛋白-结合单克隆抗体进行两个有色免疫荧光研究，认识到了有不同的淋巴细胞亚种(subset)所表达的特征性epitopes。发现有健康妇女的PBMS能同时用抗-CD19(图3，1A)和MAb 4A12单克隆抗体(图3，1B)标记，这些PSMC中只有淋巴细胞带有B-细胞(CD19+B细胞)的CD19同一的膜糖蛋白特性。在这一方面，只有93％的CD19+B-淋巴细胞(图3，1A)表达健康妇女PBMC中被MAb 4A12识别的抗原。相反，观察到在患病妇女双标记的CD19+NDP-Kinase-B-淋巴细胞中明显减少(见表3)。表3外周血循环B-细胞双标记抗-CD19/抗-NDP-Kinase的百分比％ of anti-CD19/anti-NDP-KinaseDouble labelled B-lymphocytes(B-gate)Normal Subjects 93.30±1.02Women with MetastaticDisease(lung/brain) 2.91±0.82没有其他淋巴细胞能被对细胞液中NDP-Kinase的单克隆抗体有选择性标记。基于这一分析，NDP-Kinase/Nm23单克隆抗体只标记B-淋巴细胞，很可能通过与膜相关的NDP-Kinase/Nm23单聚体反应而标记。
例6人类乳腺癌母细胞的ELASA分析人类乳腺癌母细胞进行ELASA分析说明MAb 4A12和7B6对NDP-Kinase和LAPase相应的活性。简言之，在96孔的盘上，每孔加入在RPMI 1640培养液中的50000母细胞+10％FCS+100U/ml青霉素+100ug/ml链霉素，于37℃，5％CO2培养24小时。除去上清液，用PBS洗涤细胞，随后用1％gluteraldehydrade的PBS溶液室温下固定1小时。用PBS洗涤，然后用casein在37℃，5％CO2封闭一小时。用PBS洗涤后，在孔里加入MAb 4A12或MAb 7B6的系列稀释液并在37℃，5％CO2培养2小时。在加入第二抗体，抗-(IgG+IgM)过氧化物酶结合的羊-抗-鼠IgG+IgM(H+L)和OPD之后，能够显示MAb 4A12和MAb7B6反应性。用MAb 7B6对人LAP在490nm测得的读数总结如下(表4)。表4MAb 7B6对人类乳腺癌母细胞LAP反应性的总结MAb 7B6Cell Line 1 OD 490nm- Cell Line 2 OD 490nm-(ng/well)Blank OD490nm Blank OD490nm200 0.707-0.054＝0.653 0.6-0.005＝0.595100 0.57-0.021＝0.549 0.446-0.003＝0.4350 0.489-0.042＝0.447 0.327-0.003＝0.32425 0.38-0.047＝0.333 0.24-0＝0.2412.5 0.294-0.05＝0.244 0.165-0＝0.1656.25 0.225-0.05＝0.176 0.1-0.003＝0.0973.1250.155-0.044＝0.111 0.068-0.003＝0.0651.56 0.107-0.05＝0.057 0.043-0.002＝0.0410.78 0.094-0.005＝0.039 0.023-0.001＝0.0220.39 0.067-0.073＝0 0.015-0＝0.0150.2 0.061-0.052＝0.009 0.008-0＝0.0080.1 0.053-0.046＝0.007 0-0＝0例7初期乳腺癌妇女血浆中NDP-Kinase/Nm23和es-LAPase活性初期乳腺癌病人与相同年龄的健康妇女血浆中NDP-Kinase/Nm23和es-LAPase活性用HPLC测定进行比较，用亮氨酸-B-奈氨作为底物用荧光光度法测定NDP-Kinase/Nm23和es-LAPase活性。在100℃煮沸10分钟来终止反应，然后在4℃以780Xg离心10分钟。所得值代表每一试验组中16个病人三次测定的平均值。用血浆免疫沉淀法测定NDP-Kinase/Nm23和es-LAPase活性，免疫沉淀用的是共价MAb 4A12(IgG2a)-蛋白G和LAPaseMAb 7B6(IgG1a)-蛋白基质.简言之，将血浆在4℃，500xg离心10分钟。吸出血浆，继续在4℃，500xg离心5分钟。最后，用PBS将血浆按1∶10稀释，把800ul血浆稀释液加到共价MAb 4A12(IgG2a)-蛋白G和LAPaseMAb 7B6(IgG1a)-蛋白基质，其中含有5ug抗体在200ul预先用封闭缓冲液(50mMTris-HCl；0.5％非脂肪牛奶)培养过的珠粒上。样品放在预涂0.5％BSA的Eppendorf试管中在不断轻轻旋转下，室温下培养15分钟。
经培养后的样品于250xg，室温下用Eppendorf离心机离心，除去上清液。含有NDP-Kinase/Nm23或es-LAPase活性的珠粒用PBS，0.5％NFDM洗涤两次。最后用无钙的Hank′s溶液再溶解使最终体积为600ul及182uM 1-亮氨酸-B-奈氨。用MAb4A12(IgG2a)-ProteinG和LAPase MAb 7B6(IgG1a)-PtoteinG-珠粒(涂有0.5％NFDM)作为相应的空白。
用MAb 4A12(抗-NDP-Kinase/Nm23)和MAb 7B6(抗-LAPase)进行血浆免疫沉淀结果显示，患有非浸润性导管癌和转移癌的病人血液中的雌激素依赖性标记水平高于正常健康妇女。实验结果见表5和表6。
表5患乳腺癌妇女血浆中的es-LAPase水平Patient Population LAPase Levels(n＝100per group) (ug/ml)Normal 5-10DCIS(non-invasive)450-600Metastatic(Lung/Brain)1200-3700表6患乳腺癌妇女血浆中的NDP-Kinase/Nm23水平Patient PopulationNDP-Kinase/Nm23 Levels(n＝100per group) (ug/ml)Normal 0.2-0.8DCIS(non-invasive) 15-25Metastatic(Lung/Brain) 500-890例8流动细胞学测定肿瘤组织的乳腺上皮癌母细胞中膜结合的es-LAPase和NDP-Kinase-Nm23肿瘤组织上皮细胞间接免疫荧光染色法是将吸附了MAb 4A12或MAb7B6抗体的人血清与附著细胞一起培养。即，用PBS洗涤融合的细胞，与20ul MAb 4A12或MAb 7B6抗体(200ug/ml)或对照小鼠IgG1于37℃培养，最终体积为2ml。经20分钟培养后，立即用PBS洗涤细胞。再与鼠-抗-IgG-PE或鼠-抗-IgG-FITC结合物一起培养15分钟。用PBS洗涤细胞三次，取一部分用夷蛋白酶处理并用流动细胞仪分析，仪器备有气体冷却的氩离子激光，其操作功率为10mwatt。在激发波长为488nm时，可同时测得FITC和PE结合物的激发。
用ELISA法使用单克隆抗体MAb4A12和MAb 7B6测定患早期乳腺癌妇女血浆中NDP-Kinase/Nm23和es-LAPase水平与相同年龄健康妇女比较。
在将单克隆抗体MAb4A12和MAb7B6提纯后，其相应的IgG2a(Anti-NDP-Kinase/Nm23)和IgG1(Anti-es-LAPase)通过DSS交叉连接系统固定，这一系统来自与Pierce(Rockford，IL，USA)。
MAb4A12和MAb 7B6蛋白G基质用于由血浆或细胞膜键合组分(预先测定酶活性)中选择性免疫沉淀NDP-Kinase/Nm23和es-LAPase。结果见表7。
表7乳腺癌妇女肿瘤组织分离的上皮母细胞中NDP-Kinase/Nm23在stromal和细胞液部分的活性与患良性囊肿和纤维瘤病人的比较NDP-Kinase/Nm23活性(umole dATP/ug)Condition Stromal CytosolicFibroadenomas/cysts 80.24±1.22 3.18±DCIS(non-invasive)3.22±0.12 25.34±Metastatic(Ling/Brain) 0.15±0.04 102±2.3这里所用的参考文献，专利及专利申请见本文的参考文献。
我们以例子解释我们的发明，但是我们的研究并不限制于这些解释。对我们发明的全面解释见下列说明。


对人类疾病如癌症进行有效检测及设计治疗药物的关键在于能够鉴别危险因素和病理生理改变的分子联系。在正常生理条件下,雌激素对多个器官起关键性的作用。这些组织对雌激素刺激的反应能够部分解释其在各种人类疾病的发生和发展中所起的活性作用,尤其是对乳腺癌。对早期乳腺癌肿瘤组织母细胞中能对雌激素响应的细胞因子的研究,发现了两种标示物。一种是来自早期乳腺癌肿瘤组织母细胞的假定的LAPase的同功酶,另一种是来自HL60细胞的细胞液NDP－Kinase.Nm23。生产出了对每一种细胞标记物的单克隆抗体。单独或一起测定这两种标记物的存在,可用于检测乳腺癌特别是与转移有关的癌症。因此,这一发明指的是LAPase和NDP－Kinase/Nm23两个单克隆抗体在固体基质中一起使用,来确认对乳腺癌的血液测定的免疫测定方法。