专利名称：从菠菜叶制备多酚提取物的方法菠菜(Spinacia oleracea)是藜科的一年生或两年生的蔬菜植物。这种植物通常作为正常食物进行种植和食用。在传统使用中，主要是认为菠菜强化、恢复和使肌肉强健，特别是强健心肌。其富含胡萝卜素、维生素(特别是维生素C和E)、矿物质和微量元素(特别是镁、铁、钙和钾)， 意味着它是抗全身性疲劳和抑郁状态的优良指示(indication)。传统上，菠菜还以其防贫血的性能而被使用。菠菜叶含有黄酮醇类的多酚和简单或聚合形式的黄酮醇。这些多酚已知是良好的抗氧化剂和抗炎剂。发明内容因此，本发明旨在提供一种用于制备富含多酚的浓缩菠菜提取物的方法。本发明的另一个目的在于提供一种多酚含量高的菠菜提取物，因此所述提取物意图用来提高人类或动物横纹肌的性能水平。本发明涉及一种用于制备液体或干燥形式的浓缩菠菜提取物的方法，其多酚的滴定度大于或等于50%，该方法包括使用食用油液-液萃取技术纯化液体形式的粗菠菜提取物的步骤。
根据一个优选实施方式，食用油选自橄榄油、葵花籽油、葡萄籽油、鱼油以及它们的混合物。
因此，本发明的方法包括以下步骤
-将食用油添加到液体形式的粗提取物中，以得到添加有食用油的液体粗提取物，
-使所述添加有食用油的液体粗提取物在搅拌下进行真空浓缩的步骤，以得到包含叶绿素和类胡萝卜素色素的上清液油相和包含水溶性化合物(碳水化合物、蛋白质、简单或复合酚化合物…)的水相，和
-分别分离油相和水相。
用食用油萃取本发明的液体粗提取物的步骤使得能够得到具有高含量活性成分的精制提取物。为此，使所述粗提取物进行纯化步骤。通过结合两个步骤来进行该纯化步骤。第一步骤的目的是去除叶绿素型的着色化合物，同时得到用作高质量绿色食物的可回收的产物，色素经保护以避免氧化降解的现象，这种现象通常是在通过这些手段进行浓缩的过程中发生。
向液体形式的粗提取物添加普通食用油，添加橄榄油、葵花籽油、葡萄籽油、鱼油型或具有相同特性的任何其他食用油，根据所需要的多酚浓度按照1 1-1 1000的比例添加。然后利用蒸发器-浓缩器型的设备或球式真空浓缩器在搅拌下真空浓缩添加有油的液体粗提取物。该步骤可以允许减小产物的体积和在利用水-醇混合物萃取的情况下去除醇。所得到的产物为两相混合物的形式，上清液油相含有经保护以避免氧化现象的叶绿素和类胡萝卜素色素，水相包含所有水溶性化合物例如碳水化合物、蛋白质和简单或复合酚化合物。通过添加足够比例的水可以改善混合物的分离。
在本发明方法中，随后回收上面提到的油相，并优选用水进行一个或多个洗涤步骤，且任选地进行干燥以得到粉末着色物质。
上面所述的用水的洗涤步骤允许增加回收的水溶性化合物(其可能与油相一起乳化)。
这种油相可以作为天然的，甚至生物的，绿色食物着色剂直接重新使用，从来自有机农业的菠菜开始。这种油相还可以利用合适的干燥介质例如酪蛋白酸盐、麦芽糊精、卵磷脂通过喷雾干燥使该油相干燥，以得到水分散性的着色粉末。
可以直接将收集到的如上所述的主要含有多酚的水相进行干燥，或使其经受第二次精制。
因此，根据本发明方法的一个特定实施方式，回收食用油萃取步骤后得到的水相， 然后进行干燥以得到干燥形式的浓缩提取物。
根据本发明另一个特定实施方式，回收食用油萃取步骤后得到的水相，然后进行纯化步骤以得到纯化的浓缩提取物。
该补充纯化步骤可以通过使其经过吸附树脂并利用醇类的溶剂进行洗脱或通过使用不与水混溶的溶剂(如乙酸乙酯、丁醇或与酚化合物具有亲和性的任何其他溶剂)的液-液萃取进行。
所用的色谱树脂例如可以是离子交换型的(阴离子或阳离子)或吸附/解吸型的，例如二乙烯基苯/苯乙烯共聚物，特别是Rohm & Haas或Mitsubishi Chemical销售的聚苯乙烯或聚甲基丙烯酸型的。
本发明的方法可以包括用于获得具有高浓度的活性成分的提取物的额外步骤。
例如，随后可以用真空蒸发或膜纳米过滤将利用色谱法或乙酸乙酯或丁醇的液-液萃取纯化后得到的纯化提取物进行浓缩，从而获得含有15-70%干物质的浓缩物。
最后，该纯化的浓缩物随后可以采用如喷雾干燥器、冻干机或真空干燥器的设备进行干燥。
因此，本发明还涉及干燥形式的纯化浓缩提取物的制备，所述干燥形式通过将液体形式的纯化浓缩提取物干燥获得。
根据一个优选的实施方式，为获得干燥形式所进行的干燥步骤通过喷雾干燥进行。
本发明还涉及如上面限定的方法，其特征在于，采用包括萃取步骤的方法获得液体形式的粗菠菜提取物，其将新鲜或冷冻形式的菠菜置于选自水、乙醇和它们的混合物的溶剂中。
根据一个优选实施方式，本发明方法中所用的菠菜源自新鲜或干燥形式的全植物。
通过将新鲜或冷冻形式的植物置于用于提取步骤的溶剂例如水、乙醇或可能 100 0-0 100比例的水与乙醇的混合物中，分离植物和溶剂以获得液体形式的粗提取物而获得本发明的菠菜粗提取物。为了获得干燥形式的粗提取物，将液体形式的粗提取物进行干燥，例如通过在热空气流中消除水、通过雾化、通过蒸发、通过升华、通过脱水，通过吸附在基质上进行干燥。
本发明还涉及制备着色产物的方法，包括以下步骤
-将食用油添加到如上面限定的液体形式的菠菜粗提取物中，以便得到添加有食用油的液体粗提取物，
-使所述添加有食用油的液体粗提取物在搅拌下进行真空浓缩的步骤，以得到包含叶绿素和类胡萝卜素色素的上清液油相和包含水溶性化合物的水相，
-回收油相，并用水进行一个或多个洗涤步骤，从而获得液体着色产物，且任选地将洗涤的油相干燥以得到着色粉末。
因此，该方法允许获得液体形式或干燥形式的着色产物。
因而，本发明还涉及可以利用如上面限定的方法得到的液体或干燥形式的着色产物。
所述液体形式的着色产物也可用作绿色食用着色剂。
本发明还涉及可根据上面限定的制备方法得到的浓缩菠菜提取物。
本发明的浓缩提取物特征在于它们的总多酚滴定度大于或等于50%。
本发明还涉及总多酚滴定度大于或等于50%、优选在60% -100%之间，更优选在 90% -100%之间的液体或干燥形式的浓缩菠菜提取物。
利用分光光度法和HPLC(例如根据下面描述的方法)分析多酚。
优选地，本发明的提取物主要包含多酚化合物，且优选占到至少70重量％ (相对于提取物的总重量)。
在这些多酚化合物中，主要发现的是类黄酮族的化合物，特别是黄酮醇的化学种类。
因此，进入本发明菠菜提取物的组成中的四个主要的多酚典型化合物是藤菊黄素、菠叶素、棕鳞矢车菊素(jaceidin)和spinatoside (简单或糖化形式)。
更确切地说，本发明的菠菜提取物包括以下的化合物
藤菊黄素-3-葡糖基-(1-6)-芹菜糖基(apiosyl) (1-2)-葡糖苷，
藤菊黄素-3-葡糖基-(1-6)-葡糖苷，
菠叶素-3-葡糖基-(1-6)-芹菜糖基(1-2)-葡糖苷，
菠叶素-3-葡糖基-(1-6)-葡糖苷，
菠叶素-3-阿魏酰(feruloyl)葡糖基-(1_6)-葡糖苷，
spinatoside,
棕鳞矢车菊素-4’ -葡糖苷酸，
5，3，，4，-三羟基-甲氧基-6 :7_亚甲基二氧黄酮_4，-葡糖苷酸，
5，4，- 二羟基-3，3，- 二甲氧基-6 :7_亚甲基二氧黄酮_4，-葡糖苷酸。
在本发明的提取物中还存在酚酸，主要是ο-香豆酸、阿魏酸，ρ-香豆酸和葡糖醛酸。
在本发明的提取物中还存在通常称作植物蜕皮留醇的蜕皮留醇激素(主要是 20-羟基蜕皮酮(20-hydroxyecdyone))。
本发明还涉及一种包含与药物可接受的载体结合的如上面限定的菠菜提取物的药物组合物。
本发明还涉及一种包含与可接受的载体结合的如上面限定的菠菜提取物的食物补充剂。
本发明的菠菜提取物意图用于各种不同的应用，主要是用来提高人类或动物的横纹肌的性能。这样，服用所述提取物使得能够减少因肌肉的氧化代谢作用形成的化合物及恶化肌肉性能和延长恢复时间的衍生代谢物。
本发明还涉及将所述提取物用在施用于人类或动物的不同盖伦氏形式的制剂中， 不论是药物形式或是食品补充剂形式，或是保健品形式。
所述制剂的应用涉及所有人类或动物群体，其中感兴趣的是其对于改进肌肉性能和提高恢复能力的贡献，例如在有经验的运动员、需要在进行运动以后帮助恢复的偶尔参加运动的人、在体力活动以后难以恢复体力的上年纪的人及赛跑动物或上年纪的动物中。
根据一个优选的实施方式，本发明涉及用于提高肌肉性能的如上面所限定的菠菜提取物。
本发明还涉及上面用于治疗和预防肌骨骼障碍的如所限定的菠菜提取物。
本发明还涉及用于治疗和预防进行运动后的肌肉障碍的如上面所限定的菠菜提取物。


图1表示用本发明方法得到的纯化菠菜提取物(1号纯化提取物-参见实施例) 的280nm UV色谱图。

多酚的分析方法
下面是用于总多酚分析的方法。
所用的色谱系统的商标是Agilent Technologie系统1100系列。
利用配备有相同类型的预柱的Kromasil C18柱，250mm χ 4. 6mm_5 μ m分离不同的多酚。
试剂
溶剂超纯净微孔(Ultra-PureMillipore)水，乙腈(chimie Plus，产品号 AC03902500)，甲醇(chimie Plus，产品号:ME03102500)，85%正磷酸(Fisher Scientific, 产品号:0/0450/PB15)和冰乙酸(Fisher Scientific，产品号:A/0400/PB15)。
分析标准品没食子酸(Extrasynthese，产品号4993S)，儿茶素 (Extrasynthese，产品号0976S)，表儿茶素Extrasynthese，参考:0977S)，表儿茶素没食子酸酯(Extrasynthese，参考0978S)，原花青素Bl (Extrasynthese，产品号098 和原花青素 B2 (Extrasynthese，产品号0984)。
操作方式
1.色谱条件
洗脱溶剂是
-溶剂A用正磷酸酸化成pH 2. 5的HPLC级水，
-溶剂B:乙腈/乙酸90 10。
流动相的流速为ImL/分钟。
柱的温度等于25°C。
注射体积是20 μ L，且在^Onm的UV中检测50分钟的分析时间。
利用下面的梯度


本发明涉及一种用于制备液体或干燥形式的且具有大于或等于50％的多酚滴定度的浓缩菠菜提取物的方法，包括通过使用食用油的液-液萃取技术纯化液体形式的粗菠菜提取物的步骤。