专利名称：一种肿瘤坏死因子受体1前配体装配域缀合物的结构及用途的制作方法肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族的胞外区主要负责与配基的识别与结合，它们的胞外区通常含有1至6个富含半胱氨酸的结构域(CRD)。这些受体通常以三聚体结合配体，发挥受体功能。而上述功能则是由含有至少1个富含半胱氨酸的前配体装配域所介导。TNFR超家族成员，包括TRAIL受体1、CD40、TNFR1和TNFR2都具备这种缔合功能。i^as、 LT3 R、HVEM、RANK、CD40、CD30、CD27、0X40和DR4等其它TNFR超家族成员均含有此前配体装配域。研究发现，在缺少配基的情况下，PLAD对受体聚合体的形成是必须且充分的。虽然PLAD不直接参与对TNF α和TNF β的识别与结合，但删除PLAD或PLAD发生突变，配体与受体的亲和能力会丧失。因此，PLAD对于TNFR多聚体的形成以及配基结合相关，在TNF 相关信号传导途经中起着至关重要的作用。TNFR超家族成员是通过预先形成的聚合体而不是通过配体诱导的单个受体亚基的交联来传递信号的，因此PLAD可以被靶向封闭以阻断这些聚合体的形成并因此阻断受体功能。PLAD的发现以及其介导的配基非依赖型受体组成功能的阐明为相关疾病的治疗提供了新思路和新靶点。目前上市的以TNFa或者TNFR为靶点的治疗类风湿性关节炎的生物药物有 Infliximab ( Remicade ,英夫利昔)、Adalimumab ( Humira ,阿达木单抗)和 Kanerc印t(Enbrel ，依那西普)等。其中英夫利昔和阿达木单抗是TNF α的单抗，而依那西普是可溶性TNFR和Fc片段的融合蛋白。TNFa单抗和TNFR融合蛋白都可以结合过量的可溶性TNF α，从而抑制TNF α弓丨发的信号传导通路。但是由于这种以TNF α为靶点的治疗方法不能区分多种TNFR通路，比如不能区分TNF α和TNFRl和TNFR2的结合，所以在抑制 TNFRl引起的疾病时也会抑制TNFR2介导的生理作用，从而可能引起多种副作用，如狼疮样综合症(lupus-like disease)、分枝杆菌感染以及淋巴瘤发生率的增加。如果以PLAD为靶点，使用PLAD或其功能性突变体等封闭TNFR的PLAD区，可以特异性地抑制某种TNFR的聚合，从而终止TNFR-TNF复合物的形成，达到终止信号传导的目的。由于每种受体只和自身的PLAD区结合，因此这种结合具有特异性。比如使用TNFRl的 PLAD干扰TNFRl的功能的同时，可以避免对TNFR2生理功能的影响，从而避免副作用的产生。聚乙二醇(PEG)是一类无免疫原性、无毒、水溶性好的聚合大分子，聚乙二醇修饰技术是现在被广泛应用于改善蛋白质生物有效性和理化性质的方法。修饰了聚乙二醇的蛋白质分子由于可以降低其被蛋白酶的降解程度、减少肾小球滤过率、增大蛋白的水溶性和降低蛋白质分子的免疫原性，因此可以被赋予更好的生物和理化特性，扩大蛋白质和3多肽的应用范围。其中，由于PEG分子长链的柔性以及其较大的分子量，PEG修饰后的蛋白质在体内的体内半衰期可以得到有效延长，延缓其体内的清除时间，并且可以有效改善蛋白质的生物分布。目前，FDA已批准多种PEG修饰的蛋白质类药物进入生物医药应用领域，如PEG修饰的腺苷脱氨酶(PEG-ADA)、天冬酰胺酶(PEG-L-asparaginase)、干扰素 α -2b (peginterferon alfa-2b)α -2a(peginterferon alfa-2a) ,M^iAUMM集落刺激因子(pegfilgrastim)等。PEG修饰是通过蛋白质分子和活化PEG修饰剂之间发生化学反应而完成的。氨基酸链上有多种可以和PEG部分连接的基团，如-NH2, -NH-, -C00H, -OH, -SH及二硫键等。其中氨基修饰是目前应用最为广泛的PEG修饰手段，包括赖氨酸的ε -NH2和蛋白质N末端的α-NH2是蛋白质和多肽中数量最多的亲核基团，而且常常暴露在分子的表面，因此易于和PEG修饰试剂反应。目前，用于氨基修饰的聚乙二醇修饰剂主要有以下几种PEG-琥珀酰亚胺琥珀酸酯(PEG-SS)、PEG-琥珀酰亚胺碳酸酯(PEG-SC)、PEG-三氟乙基磺酸酯(PEG tresylate)和PEG-醛(PEG aldehyde)等，其PEG多聚链的结构形式也包括直链和分支状。 但是，若蛋白质或者多肽的氨基修饰包括赖氨酸的末端的Ci-NH2，酸酯类活化基团的修饰常会得到多种不同修饰位点和修饰程度的反应产物。而蛋白质与PEG-醛的还原烷化反应则可以克服这一不足，由于蛋白质N末端α-NH2 WpKa值低于赖氨酸的ε-NH2 的PKa值，因此在弱酸性环境中，PEG-醛更易与末端氨基酸残基的α -NH2发生还原烷化反应，从而实现N-末端氨基的定点修饰。另外，通过基因工程技术引入非天然氨基酸，如对乙酰苯丙氨酸或者对叠氮苯丙氨酸，再针对非天然氨基酸上的特殊基团，采用具有相应的活化基团的聚乙二醇衍生物对其进行偶联也是目前较为常用的定点修饰的策略。
本发明的目的在于获得一种肿瘤坏死因子受体1前配体装配域蛋白缀合物。为达到上述目的，本发明采用了以下技术路线和步骤一、技术路线1.化学合成肿瘤坏死因子受体1前配体装配域蛋白缀合物；或者根据相应宿主密码子偏爱性合成肿瘤坏死因子受体1前配体装配域蛋白的基因。2.基因重组入表达载体，克隆入宿主菌后进行诱导表达。3.分离纯化得到目的蛋白。4.肿瘤坏死因子受体1前配体装配域蛋白与聚乙二醇分子的偶联。5.从偶联反应混合物中分离纯化得到肿瘤坏死因子受体1前配体装配域蛋白缀合物。6.肿瘤坏死因子受体1前配体装配域蛋白缀合物的鉴定和应用。本发明所述的肿瘤坏死因子受体1前配体装配域蛋白，是来自于肿瘤坏死因子受体1胞外区的PLAD结构域及其功能性变体，突变体至少大约90%的氨基酸序列与天然人源的肿瘤坏死因子受体1前配体装配域蛋白具有同一性。本发明所涉及的肿瘤坏死因子受体1前配体装配域蛋白的获得可以通过化学合成或者蛋白质重组技术表达得到。本发明所采用的蛋白质重组表达系统可以是原核细胞表达系统或者真核细胞表达系统。优选原核细胞表达系统，通过和可溶性蛋白质标签融合表达以及蛋白酶如肠激酶酶切去除融合标签，大量获得肿瘤坏死因子受体1前配体装配域蛋白。含有非天然氨基酸如对叠氮苯丙氨酸或对乙酰苯丙氨酸的肿瘤坏死因子受体1 前配体装配域蛋白的获得可以遗传密码扩充技术定点弓I入非天然氨基酸实现。上述聚乙二醇可以为直链结构或者支链结构。分子量范围为2000-40000Da。本发明所述的肿瘤坏死因子受体1前配体装配域蛋白缀合物的制备方法是使用缓冲液，调节PLAD蛋白溶液pH值至3. 0到9. 0，然后按比例加入具有活化基团的聚合物如 mPEG-醛以及催化剂(如氰基硼氰化钠)，静置或搅拌反应一定的时间，将反应混合液稀释或调节PH值使反应停止，采用离子交换或者凝胶过滤色谱纯化PEG-PLAD分子。上述的缓冲液可以是醋酸-醋酸钠缓冲液、硼酸-硼砂缓冲液、磷酸缓冲液、碳酸-碳酸钠缓冲液，三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液，磷酸盐缓冲液或柠檬酸钠缓冲液等。 蛋白质与聚乙二醇的摩尔比为1 1到1 10之间，反应温度为0-37摄氏度，反应时间为 15分钟以上。本发明的目的在于获得一种肿瘤坏死因子受体1前配体装配域蛋白缀合物，与 PLAD原型分子相比，缀合物具有较好的稳定性和较长的体内半衰期，可以克服PLAD原型分子易被酶解和清除的不足，同时与PLAD原型分子一样，具备拮抗TNF α等TNFR相关配基的活性，由于TNFa是引起人类多种免疫性炎症的重要因子，因此该缀合物有望应用于治疗如类风湿性关节炎等人类的炎性疾病。图1显示Trcine-SDS-PAGE分析纯化后得到的TNFR1-PLAD蛋白纯度图中序号说明1.蛋白质分子量标准；2.纯化后得到的TNFR1-PLAD蛋白图2显示HPLC分析纯化后得到TNFR1-PLAD蛋白纯度图3显示SDS-PAGE分析mPEG_ALD20000修饰PLAD后得到的产物图中序号说明1. mPEG-ALD20000修饰PLAD的反应液；2.蛋白质分子量标准



本发明属生物技术领域，具体涉及一种肿瘤坏死因子受体1前配体装配域蛋白缀合物分子结构及其制备方法和应用。肿瘤坏死因子受体1前配体装配域蛋白缀合物分子是肿瘤坏死因子受体1的前配体装配域(PLAD)通过共价键与聚乙二醇(PEG)等分子连接组成。其中PLAD部分可以由蛋白质重组表达技术制备获得。本发明旨在获得一种具有较长血清半衰期的PLAD分子，用于人类炎性疾病的治疗。