专利名称：N-甲酰基氨基酸的制备方法及其使用的制作方法 用甲酰基保护氨基的N-甲酰基天冬氨酸、N-甲酰基中性氨基酸等的N-甲酰基氨基酸在食品和药品领域，作为各种肽化合物的合成中间体是非常重要的化合物。特别是N-甲酰基天冬氨酸作为甜味剂、天冬酰苯丙氨酸甲酯的中间体也是非常重要的化合物。作为氨基酸氨基保护基的甲酰基可以通过比较便宜的化学药品得到，例如，脱保护中，与通过使用载钯碳还原进行脱保护的苄氧基羰基等相比，可以以较低的成本进行脱保护。作为N-甲酰基天冬氨酸的合成方法，例如已知有如下述反应过程1所示的使用甲酸和乙酸酐、使天冬氨酸转化成N-甲酰基天冬氨酸酐后进行水解的方法(例如参照欧洲生物化学杂志、1969年、第10期、第318～323页(European Journal of Biochemistry，vol.10，318-323，1969)。)(反应过程1) 天冬氨酸 N-甲酰基天冬氨酸酐 N-甲酰基天冬氨酸但是，本方法必需使用多量的乙酸酐和甲酸，而且还必需进行多段反应，所以作为N-甲酰基天冬氨酸制备方法，是不能满足要求的。此外，有关报导提出了下述反应过程2所示的使用甲酰胺合成N-甲酰基-L-天冬氨酸的方法(参照美国专利第4,789,757号，实施例1。)(反应过程2) L-天冬氨酸 N-甲酰基-L-天冬氨酸前述美国专利第4,789,757号的实施例1中说明了其要点是通过在L-天冬氨酸和5倍摩尔的甲酰胺存在下，于95～100℃下加热搅拌2小时，定量生成N-甲酰基-L-天冬氨酸。但是，当本发明者重复做同样试验的时候发现，生成的N-甲酰基-L-天冬氨酸的收率相对于其出发原料L-天冬氨酸只有大约40％左右。这样也很难说是确立了一种能够充分满足作为工业制备N-甲酰基天冬氨酸要求的方法。接着作为用N-甲酰基-L-天冬氨酸(以下有时简称为“F-Asp”)合成天冬酰苯丙氨酸甲酯前体的N-甲酰基-α-L-天冬氨酰基-L-苯基丙氨酸甲酯(以下有时简称为“F-APM”)的方法，又提出了使L-苯基丙氨酸甲酯(以下有时简称为“L-PM”)和F-Asp在有机溶剂中反应的方法(例如参照美国专利第3,786,039号。)。然而，这种方法生成α和β两种异构体，要除去不需要的β异构体，必需进行分离和精制操作，因此也很难说它是一种有效的工业制备方法。作为不产生上述异构体的方法，特开昭60-164495号公报(EP0149594)中报导了在水溶液中，在用嗜热菌蛋白酶作为酶存在的条件下，通过F-Asp和L-苯基丙氨酸甲酯的缩合反应得到F-APM的方法。如果按照该专利的实施例1，使F-Asp和L-PM以1∶1的摩尔比反应，分离浆液后，使所得固体(鉴定为N-甲酰基-α-L-天冬氨酰基-L-苯基丙氨酸甲酯和L-苯基丙氨酸甲酯的(1∶1)加成物)悬浮在水中，将其pH值调节到1.6，用乙酸乙酯萃取F-APM，但是，按整体计算，收率为12％左右。另外，在实施例3中，使F-Asp和L-PM按1∶2的摩尔比反应，但是相对于F-Asp的缩合收率低，为41％。在实施例2中，使F-Asp和L-PM按5∶1的摩尔比反应，虽然相对于L-PM的缩合收率为90％，但是相对于F-Asp的缩合收率相当低，只有9％，很难说它是一种有效的、工业制备的方法。在特开平10-174597号公报中，公开了在通过使用酶的缩合反应合成F-APM的过程中，连续向酶的水溶液中供给溶解有F-Asp和L-PM的对水非混合性的有机溶剂，从有机层中萃取、并连续取出生成的F-APM的方法。但是在本方法中，丝毫没有公开从有机层中离析F-APM的方法、最终是否能够高效制备F-APM，仍是一个尚不明确的问题。
另一方面如前所述，N-甲酰基中性氨基酸，作为各种肽化合物的合成中间体是非常重要的，例如中性氨基酸亮氨酸的氨基经甲酰基化后的N-甲酰基亮氨酸被用于罗施(Roche)公司出售的食欲调节剂、商品名为“奥利斯达特(Orlistat)”的侧链。作为N-甲酰基氨基酸的合成方法，众所周知的有使用甲酸和乙酸酐，使氨基酸甲酰化的方法(参照美国化学学会杂志，1958年、80期、1154页)，该方法中需要大量使用甲酸和乙酸酐，例如相对于氨基酸的甲酸用量是56倍摩尔、乙酸酐用量是7倍摩尔，所以很难说这种方法是可以满足作为工业化制取N-甲酰基氨基酸要求的方法。
另外，还提出了使用甲酰胺的N-甲酰基氨基酸的合成方法(参照美国专利第4,789,757号)，该方法主要报导了通过在5倍摩尔的甲酰胺中，于95～100℃下对氨基酸加热搅拌2小时，定量生成N-甲酰基氨基酸的方法，本发明者对该方法进行重复试验的结果表明，生成的N-甲酰基氨基酸的收率仅为40％左右。因此也很难说这种方法能够满足作为N-甲酰基氨基酸工业制法的要求。
在上述背景情况下，要求有一种高效的、并且可以工业化生产N-甲酰基天冬氨酸和天冬酰苯丙氨酸甲酯的前体N-甲酰基-α-L-天冬氨酰基-L-苯基丙氨酸甲酯和N-甲酰基中性氨基酸的简便的制备方法。
发明要解决的课题本发明要解决的课题在于开发一种有效制备作为甜味剂天冬酰苯丙氨酸甲酯合成中间体的、重要的N-甲酰基天冬氨酸(或其盐)和以此为原料的甜味剂天冬酰苯丙氨酸甲酯的前体N-甲酰基-α-L-天冬氨酰基-L-苯基丙氨酸甲酯和天冬酰苯丙氨酸甲酯的有效的制备方法，更在于开发一种作为肽化合物合成中间体的重要的N-甲酰基中性氨基酸(或其盐)的有效而简便的制备方法。
发明公开为了解决前述诸多课题，本发明者进行了锐意研究，得到了如下多种新认识，以这些认识为基础，完成了包括以下各种方案在内的本发明。
(新认识)1.通过在碱存在的条件下，使天冬氨酸和甲酰胺和/或甲酸甲酯反应，可以高收率制备N-甲酰基天冬氨酸(或其盐)。使天冬氨酸的盐和甲酰胺和/或甲酸甲酯反应可以高收率制备N-甲酰基天冬氨酸(或其盐)。
2.在通过F-Asp和/或其盐和L-和/或DL-苯基丙氨酸甲酯(以下有时简称为“L/DL-PM”)的酶缩合反应制备F-APM的方法中，用掌握F-Asp特定浓度的方法可以高效率制备F-APM。另外，通过使特定的三烷基磷酸酯同时存在的方法，可以以浆液状态得到目的化合物F-APM，再对该浆液进行分离(过滤等)可以很容易地得到目的化合物。
3.把通过前述酶缩合反应得到的F-APM和L-和/或D-苯基丙氨酸甲酯(以下有时简称为“L/D-PM”)加成物悬浮在pH值在特定范围内的水溶液中，通过分离固体，可以得到F-APM。
4.通过在碱存在的条件下，使中性氨基酸与甲酰胺和/或甲酸甲酯反应，可以高收率制备N-甲酰基中性氨基酸(或其盐)。通过使中性氨基酸的盐与甲酰胺和/或甲酸甲酯反应，可以高收率制备N-甲酰基中性氨基酸(或其盐)。
(本发明所包括的各种方案发明)以上述新认识为基础，提出了本发明所包括的下述各方案发明。
1.N-甲酰基天冬氨酸或其盐的制备方法，其特征是在碱存在的条件下，使天冬氨酸和甲酰胺和/或甲酸甲酯反应；以及N-甲酰基天冬氨酸或其盐的制备方法，其特征是使天冬氨酸的盐与甲酰胺和/或甲酸甲酯反应。
上述方法有时也统称为“本发明的甲酰化方法1”。
2.N-甲酰基-α-L-天冬氨酰基-L-苯基丙氨酸甲酯(F-APM)的制备方法(N-甲酰基-α-L-天冬氨酰基-L-苯基丙氨酸甲酯也可以是与苯基丙氨酸甲酯的加成物的形态)，其特征是在N-甲酰基-L-天冬氨酸和/或其盐与L-和/或DL-苯基丙氨酸甲酯的酶缩合反应中，水溶液中的N-甲酰基-L-天冬氨酸的浓度为1.2mol/L以上；以及F-APM的制备方法，其特征是在前述酶缩合反应中，使体系中同时存在三正丁基磷酸酯等三烷基磷酸酯，并对以浆液状态得到的目的产物(该加成物的形态)进行分离。
以上有时统称为“本发明的F-APM制备方法；缩合反应”。
3.N-甲酰基-α-L-天冬氨酰基-L-苯基丙氨酸甲酯的制备方法，其特征是使N-甲酰基-α-L-天冬氨酰基-L-苯基丙氨酸甲酯的苯基丙氨酸甲酯加成物悬浊在pH值为1.0～4.5的水溶液中，然后分离固体。
以上有时统称为“本发明的F-APM的制备方法；分离方法”4.N-甲酰基中性氨基酸或其盐的制备方法，其特征是在碱存在的条件下，使中性氨基酸和甲酰胺和/或甲酸甲酯反应；以及N-甲酰基中性氨基酸或盐的制备方法，其特征是使中性氨基酸的盐和甲酰胺和/或甲酸甲酯反应。
以上，有时统称为“本发明的甲酰化法2”。
(关于本发明的甲酰化法1)如前所述该项发明在于在碱存在的条件下，使天冬氨酸与甲酰胺和/或甲酸甲酯反应；或者是使天冬氨酸的盐与甲酰胺和/或甲酸甲酯反应制备N-甲酰基天冬氨酸或其盐的方法。
对于所用碱的种类没有特别限制，作为碱可以列举氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠、碳酸钾、氨等，可以从中选择使用1种或数种物质。
关于碱的用量没有特别限制，相对于1当量天冬氨酸可以使用0.15～2.5当量左右的碱。
关于天冬氨酸的旋光物没有特别限制，可以使用L-体、D-体和DL-体中的任意一种。当用于天冬酰苯丙氨酸甲酯的前体时，优选使用L-天冬氨酸。
优选使用反应溶剂，这时可以使用水、极性溶剂、或者是水与极性溶剂的混合溶剂。
关于甲酰胺和/或甲酸甲酯的用量没有特别限制，相对于天冬氨酸可以使用0.5～6倍摩尔左右的甲酰胺和/或甲酸甲酯。
本发明中，可以以单体或盐的形态制备得到N-甲酰基天冬氨酸。例如，如果想得到单体时，通过对生成的N-甲酰基天冬氨酸的盐进行一般脱盐工序，就能够很容易制备得到其单体，这些均包括在该项发明范围之内。
按照上述操作，得到N-甲酰基-L-天冬氨酸(和/或其盐)后，使该N-甲酰基-L-天冬氨酸(和/或其盐)与苯基丙氨酸甲酯(L-体、DL-体等)进行缩合得到N-甲酰基-α-L-天冬氨酰基-L-苯基丙氨酸甲酯，再将该N-甲酰基-α-L-天冬氨酰基-L-苯基丙氨酸甲酯转化成天冬酰苯丙氨酸甲酯，由此制备天冬酰苯丙氨酸甲酯。这种N-甲酰基天冬酰苯丙氨酸甲酯(天冬酰苯丙氨酸甲酯的前体)和天冬酰苯丙氨酸甲酯的制备方法也包括在该项发明之内。
(关于本发明的F-APM的制备方法；缩合反应)该项发明在于在使N-甲酰基-L-天冬氨酸和/或其盐与L-和/或DL-苯基丙氨酸甲酯的酶缩合反应中，水溶液中的N-甲酰基-L-天冬氨酸的浓度在1.2mol/L以上、优选在2.7～27mol/L、更优选在3.5～17mol/L、进行酶反应，制备N-甲酰基-α-L-天冬氨酰基-L-苯基丙氨酸甲酯的方法，这时N-甲酰基-α-L-天冬氨酰基-L-苯基丙氨酸甲酯的形态也可以是与苯基丙氨酸甲酯的加成物形态。
在酶的反应体系中，可以把N-甲酰基-L-天冬氨酸和/或其盐与L-和/或DL-苯基丙氨酸甲酯的摩尔比调节到相对于1摩尔N-甲酰基-L-天冬氨酸的L-和/或DL-苯基丙氨酸甲酯的摩尔数为0.5～3左右，更优选为1.7～2.3左右。
关于所用的酶，只要是能使N-甲酰基-L-天冬氨酸和L-和/或DL-苯基丙氨酸甲酯进行酶缩合反应的酶，则无特别限制，但优选使用蛋白酶。
这里所用的N-甲酰基-L-天冬氨酸和/或其盐，可以优选使用前述本发明甲酰化法1中所制备的物质。因此优选在实施前述本发明的甲酰化法1之后，接着实施该项发明。
使用对水非混合性的液态三烷基磷酸酯作为三烷基磷酸酯，优选三个烷基是各自独立的、碳数为4～6的烷基的三烷基磷酸酯。特别优选三正丁基磷酸酯。
关于该三烷基磷酸酯的用量，相对于1重量份水溶剂的三烷基磷酸酯的用量可以优选为2～30重量份左右，更优选5～20重量份左右。
(关于本发明的F-APM的制备方法；分离方法)该项发明在于通过使N-甲酰基-α-L-天冬氨酰基-L-苯基丙氨酸甲酯的苯基丙氨酸甲酯加成物悬浊在pH值为1.0～4.5、优选为2～3左右的水溶液中，分离固体的方法制备N-甲酰基-α-L-天冬氨酰基-L-苯基丙氨酸甲酯的方法。
该加成物可以使用通过本发明的F-APM制备方法；缩合反应中得到的加成物。因此，优选在实施本发明的F-APM的制备方法；缩合反应之后，继续实施本发明的F-APM的制备方法；分离方法。
如上所述，可以通过在得到N-甲酰基-α-L-天冬氨酰基-L-苯基丙氨酸甲酯之后，除去甲酰基制备α-L-天冬氨酰基-L-苯基丙氨酸甲酯(天冬酰苯丙氨酸甲酯)，这种天冬酰苯丙氨酸甲酯的制备方法也属于该项发明的范畴。
(关于本发明的甲酰化法2)该项发明在于在碱存在的条件下，使中性氨基酸与甲酰胺和/或甲酸甲酯反应；或使中性氨基酸的盐和甲酰胺和/或甲酸甲酯反应，制备N-甲酰基中性氨基酸或其盐的方法。
对于该项发明中使用的碱，没有特别限制，例如可以列举氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠、碳酸钾、氨等。可以从中选择使用1种或数种物质。
在该反应中，相对于中性氨基酸的碱的用量可以是0.1～10倍摩尔左右。
对该项发明中所使用的中性氨基酸盐，没有特别限制，例如可以列举钠盐、钾盐、铵盐等，可以从中选择使用1种或数种物质。
对所用中性氨基酸的种类没有特别限制，例如，作为中性氨基酸可以列举亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸。可以从中选择任意1种或数种用作本发明的原料。
在该反应中，相对于中性氨基酸的甲酰胺和/或甲酸甲酯的用量可以是0.5～6倍摩尔左右。
在该项发明中可以以单体或盐的形态制取N-甲酰基中性氨基酸。例如，要制取单体时，通过对生成的N-甲酰基中性氨基酸的盐进行一般的脱盐工序就很容易制取其单体，这些全部包括在该项发明的范畴之内。
对用于原材料的中性氨基酸的旋光物没有特别限制，可以使用L-体、D-体、DL-体中的任意一种。
实施方案以下详细说明本发明的实施方案。由于是以优选的代表例为中心进行说明，所以本发明不应该局限于这些代表例之中。
(本发明的甲酰化法1)该项发明在于在碱存在的条件下，通过使天冬氨酸和甲酰胺和/或甲酸甲酯反应制备N-甲酰基天冬氨酸和/或其盐的方法；以及通过使天冬氨酸的盐和甲酰胺和/或甲酸甲酯反应制备N-甲酰基天冬氨酸或其盐的方法。
对该项发明中所用的天冬氨酸的光学异构没有特别限制，可以使用DL-天冬氨酸、L-天冬氨酸或D-天冬氨酸中的任意一种。在本发明的制备方法中，如果按照一般的反应条件，很难发生外消旋，所以可以通过使用旋光性天冬氨酸得到作为旋光物的N-甲酰基天冬氨酸或其盐。
优选该项发明的反应在溶剂中进行，也可以不使用溶剂进行反应。使用溶剂时，对溶剂没有特别限制，只要是对反应呈惰性的物质即可，优选使用水、极性溶剂、或水与极性溶剂的混合溶剂。
作为极性溶剂，优选使用能与水混合的极性溶剂，例如可以列举甲醇、乙醇、二甲基亚砜等等。其中，这些极性溶剂可以混合使用1种以上。
对于所用的碱的种类没有特别的限制，作为优选物质，例如可以列举氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠、碳酸钾、氨等。特别优选氢氧化钠、氢氧化钾、氨。这些碱中，也可以混合使用一种以上的物质。
对于天冬氨酸的盐没有特别限制，例如可以列举天冬氨酸单钠盐、天冬氨酸二钠盐、天冬氨酸单钾盐、天冬氨酸二钾盐、天冬氨酸单铵盐、天冬氨酸二铵盐等，可以从中选择使用1种或数种盐。
使用溶剂时，对所用溶剂的量没有特别限定，只要是原料天冬氨酸或其盐和碱能够溶解到不影响该项发明效果的程度即可。如果是本行业人员，能够很容易设定适宜的优选条件。
作为所用甲酰胺或甲酸甲酯的用量也没有特别限定，相对于天冬氨酸或其盐的甲酰胺或甲酸甲酯的用量可以掌握在0.5～6倍摩尔左右、优选掌握在1.5～3倍摩尔左右。当不使用溶剂进行反应时，通常可掌握在2～10倍摩尔左右、优选掌握在3～5倍摩尔左右。
也可以同时使用甲酸甲酯和甲酰胺，这时，可以把甲酰胺和甲酸甲酯的总量控制在上述用量范围之内。
使用碱时，相对于1当量所用天冬氨酸的碱的用量通常是0.2～10当量左右、优选0.3～5当量左右。这里所说的“当量”是指酸碱当量。例如，相对于1当量天冬氨酸，添加1当量氢氧化钠时，如果天冬氨酸是1mol，则需要添加2mol氢氧化钠。
如果碱的量太少，则有反应速度变慢的倾向，所以是不理想的。如果碱的量太多，则有产生副反应的倾向，也是不理想的。
作为反应温度，没有特别限制，通常的温度范围是30～130℃、优选范围是40～100℃。如果温度太高，则会出现产生外消旋等副反应的倾向；如果温度太低，则会出现反应速度变慢的倾向，所以是不理想的。另外，反应优选在搅拌下进行。
在该项发明中，碱和天冬氨酸发生中和反应，生成相应的天冬氨酸盐。因此在本发明中，也可以通过用天冬氨酸盐替代天冬氨酸，在不添加碱的条件下，使其反应。这时，其它反应条件可以与前述条件相同。同时与前述情况一样，对于天冬氨酸盐的光学异构也没有特别限定，可以使用DL-天冬氨酸盐、L-天冬氨酸盐或D-天冬氨酸盐中的任意一种天冬氨酸盐。
通过该项发明得到的N-甲酰基天冬氨酸，当反应结束时，在溶液中是以相应盐的形态存在的。可以通过普通方法，对反应溶液任意进行中和、萃取、结晶析出等操作，另外，还可以利用必要的脱盐工序和成盐工序，以N-甲酰基天冬氨酸(单体)的形态或其盐的形态离析精制应该制备的目的物质。
如上所述，调制制备的N-甲酰-L-天冬氨酸，可以通过已知方法，例如按照特公昭60-164495号公报中实施例1所述的方法，使其与L-苯基丙氨酸甲酯进行酶缩合，调制天冬酰苯丙氨酸甲酯的重要中间体(前体)N-甲酰基-α-L-天冬氨酰基-L-苯基丙氨酸甲酯；但是，如果按照本发明的F-APM制备方法，通过与L-苯基丙氨酸甲酯进行酶缩合，可以更有效地获得上述N-甲酰基-α-L-天冬氨酰基-L-苯基丙氨酸甲酯。
用这种方法得到的N-甲酰基-α-L-天冬氨酰基-L-苯基丙氨酸甲酯，可以利用已知的方法，例如按照特开昭58-185545号实施例10中所述的方法，在盐酸存在的条件下，使用甲醇-水的混合溶剂，对甲酰基进行水解后，用碳酸钠中和等方法，可以使其转化成天冬酰苯丙氨酸甲酯。
在该项发明方法中，特别在低温下进行反应时，反应过程中有时会出现结晶析出。这时，可以一边对反应溶液加强搅拌，一边进行反应。搅拌可以采用捏合机和高速搅拌器等搅拌装置进行。
(本发明的F-APM的制备方法；缩合反应)该项发明在于N-甲酰基-α-L-天冬氨酰基-L-苯基丙氨酸甲酯(F-APM)的制备方法(N-甲酰基-α-L-天冬氨酰基-L-苯基丙氨酸甲酯的形态也可以是与L-和/或D-苯基丙氨酸甲酯的加成物[以下，有时简称为“F-APM·L/D-PM”]的形态)，其特征是在使N-甲酰基-L-天冬氨酸和/或其盐(F-Asp)与L-和/或DL-苯基丙氨酸甲酯和/或其盐(L/DL-PM)的酶缩合反应中，把水溶液中F-Asp浓度控制为1.2mol/L以上。
另外，本发明酶缩合反应中的N-甲酰基-L-天冬氨酸，可以采用其单体，也可以采用其钠盐等盐的形态。同样，L-和/或DL-苯基丙氨酸甲酯也可以使用单体、也可以使用其盐酸盐等盐的形态。
水溶液中的F-Asp浓度的优选范围是2.7～27mol/L，更优选范围是3.5～17mol/L。象这样，通过把水溶液中的F-Asp浓度控制在1.2mol/L以上，优选控制在2.7～27mol/L、更优选控制在3.5～17mol/L、以高转化率进行酶缩合反应，可以使相对于F-Asp的F-APM收率达到50％以上，还可优选达到60％以上。
作为酶缩合反应的溶剂，一般可以单独使用水。在不影响酶缩合反应的范围内，还可以在水中混合甲醇、乙醇等能很好与水混合的有机溶剂，但是一般没有必要这样做。此外，本发明中的“水溶液”不仅是指酶缩合反应中的溶剂只是水的情况，还包括甲醇、乙醇等能很好与水混合的有机溶剂与水的混合溶剂的情况。
酶缩合反应的水溶液中的F-Asp和L/DL-PM的比率范围以摩尔比计算一般设定为1∶0.5～1∶3。本发明中，通常是在酶缩合反应进行的同时，反应生成物N-甲酰基-α-L-天冬氨酰基-L-苯基丙氨酸甲酯以与L-和/或D-苯基丙氨酸甲酯为1∶1的加成物形态析出(该加成物，当用HPLC分析时，可以观察到F-Asp和L/D-PM各自的峰。)。因此为了提高反应收率，更优选将上述比率范围以摩尔比计算设定为1∶1.7～1∶2.3。实际上，可以将上述比率设定为以摩尔比计算为约1∶2，进行酶缩合反应。以该比率进行酶缩合反应，可以减少未参加反应的物质，可以省略除去未参加反应物质的复杂的精制工序。
另外，除反应开始时存在的水之外，如果进行缩合反应，则作为副产物会生成水。当采用分批式方法进行酶缩合反应时，可以在反应开始时将水溶液中的F-Asp浓度和F-Asp与L/DL-PM的比率设定在上述范围；当采用连续式方法进行酶缩合反应时，可以把反应中反应槽的F-Asp浓度和F-Asp与L/DL-PM的比率设定在上述范围。
酶，优选使用中性蛋白酶。例如可以使用“萨摩阿塞(サモア一ゼ)PS160”(大和化成制造)或“萨摩阿塞C160”(大和化成制造)这样的市场上出售的类嗜热菌蛋白酶的金属蛋白酶。在一般的酶缩合反应中，这种萨摩阿塞最适宜的pH值范围是6～8，而本发明酶缩合反应中的pH值范围通常设定为5～6，更优选设定为5.2～5.8。如果在该范围以外的pH值下进行酶缩合反应，则转化率降低，是不理想的。pH值可以采用氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸氢钠等碱或盐酸、硫酸等酸进行调节。
如果以F-Asp作为1，酶的用量范围按重量比计算通常是0.025～4，优选范围是0.05～2。众所周知，这些酶一般是通过在少量钙离子(II)存在的条件下酶具有稳定性和有利于酶作用的效果，优选使该项发明酶缩合反应中也存在有钙离子(II)。作为使反应溶液中(水溶液中)存在钙离子(II)的化学药品可以使用碳酸钙、氯化钙、乙酸钙等钙盐。存在于水溶液中的钙离子(II)相对于所用酶基的量按重量比计，一般设定在0.15～0.5的范围内。
在酶作用下产生的缩合反应的反应温度设定范围通常是10～60℃，优选设定范围是30～50℃。对于反应时间，没有特别限定，一般可以设定为30分钟～24小时左右。
在本发明的酶缩合反应中，由于反应基质是在高浓度状态下进行反应，所以，通常随着反应进行，生成N-甲酰基-α-L-天冬氨酰基-L-苯基丙氨酸甲酯与L和/或D-苯基丙氨酸甲酯的加成物，反应容器内反应溶液丧失流动性而形成固化状态。但是，通过在对水非混合性的特定三烷基磷酸酯存在的条件下，进行酶缩合反应，可以使反应溶液形成浆液状态，从该浆液中过滤固体(该加成物的结晶)，再通过离心分离等已知分离方法进行分离，可以有效获得该加成物的结晶。这时，为了得到浆液状反应物，优选在搅拌状态下进行反应。而且，酶缩合反应，如果在反应开始时，对原料进行充分而均匀的混合，那么在反应体系中，在不施加任何力学作用的状态下，例如即使在静止放置的状态下，反应也能很好地进行，所以即使丧失流动性、搅拌困难的时候，从酶反应转化率的角度看，也是没有问题的。
作为本发明中所用的三烷基磷酸酯，可以使用对水非混合性的液态烷基磷酸酯。优选使用构成三烷基磷酸酯的三个烷基是各自相互独立的、碳数为4～6烷基的三烷基磷酸酯。特别优选使用容易得到的三正丁基磷酸酯。三甲基磷酸酯、三乙基磷酸酯等与水具有混合性的三烷基磷酸酯具有使酶失活的倾向，所以是不理想的。
三烷基磷酸酯的用量，当使用水作为酶缩合反应的溶剂时，以水的量为1，相应的三烷基磷酸酯的用量按重量比计算优选为2～30、更优选为5～20。如果使用能与水很好混合的有机溶剂和水的混合溶剂作为溶剂时，可以以混合溶剂中的水量为1按重量比计算，设定三烷基磷酸酯的用量在上述值的范围之内。
除了反应开始时存在的水以外，如果进行缩合反应，作为副产物会生成水。如果是分批式进行酶缩合反应，那么可以以反应开始时的水量为1设定三烷基磷酸酯的用量比。如果连续进行酶缩合反应时，可以以反应中反应容器内的水量为1进行设定。
此外，在酶缩合反应中，具有L和/或DL-苯基丙氨酸甲酯向三烷基磷酸酯相中移动的倾向，所以从提高酶缩合反应收率的观点考虑，优选预先使L和/或DL-苯基丙氨酸甲酯(单体)溶解在所使用的三烷基磷酸酯中，更优选使L和/或DL-苯基丙氨酸甲酯以饱和状态溶解于三烷基磷酸酯中。另外，也可以从使反应体系中存在的三烷基磷酸酯的基团估算出向三烷基磷酸酯相中移动的L/DL-PM的量，预先在水溶液中，溶解比相应量多的L/DL-PM，但是，在水溶液中，L/DL-PM有水解的倾向，另外当使用L-和/或/DL-苯基丙氨酸甲酯的盐时，有时，在反应中会有无机盐积存、对酶反应产生不良影响，所以从反应收率和回收、再利用L/DL-PM的观点考虑，预先使L和/或DL-苯基丙氨酸甲酯的盐溶解在三烷基磷酸酯中也是一个理想的方法。溶解有L-和/或DL-苯基丙氨酸甲酯(单体)或L-和/或DL-苯基丙氨酸甲酯达到饱和的三烷基磷酸酯，可以通过如把L/DL-PM溶解在水中，然后添加三烷基磷酸酯，进行萃取、分离有机层的方法得到。这时，优选在实际进行酶缩合反应的温度下进行萃取。这样进行萃取操作时，有时三烷基磷酸酯中含有某种程度的水，但是在上述F-Asp的浓度计算中，水溶液中的水量不包括该三烷基磷酸酯中所含的水量。三烷基磷酸酯中所含的水量，可以通过如卡尔-费希尔法等方法测定。也可以在实际反应温度下，通过上述萃取操作，在与三烷基磷酸酯中使L和/或/DL-苯基丙氨酸甲酯及水达到饱和时相同的饱和状态下，测定所含水(以及L和/或/DL-苯基丙氨酸甲酯)的量，预先在水溶液中添加比使所用三烷基磷酯达到饱和时所需的水过量的水。这时，添加的过量的水不包括在上述F-Asp浓度计算的水溶液的水量之中。
本发明中，F-APM通常是以L-/D-PM为1∶1的加成物形态得到的，可以通过已知的分离方法或后文将叙述的本发明的F-APM制备方法分离方法分离得到F-APM单体。还可以进一步把单体转化成任意的盐。
(本发明的F-APM的制备方法分离方法)该项发明在于N-甲酰基-α-L-天冬氨酰基-L-苯基丙氨酸甲酯的制备方法，其特征是使N-甲酰基-α-L-天冬氨酰基-L-苯基丙氨酸甲酯的L-和/或D-苯基丙氨酸甲酯加成物，例如使其比例为1∶1的加成物悬浊在pH值为1.0～4.5、优选为2～3的水溶液中，然后分离固体。并且本发明中所用的该加成物(即F-APM·L/D-PM)可以使用通过前述本发明缩合反应得到的该加成物、优选使用通过前述在三烷基磷酸酯存在下进行缩合反应，作为结晶得到的该加成物。
通过本发明酶缩合反应得到的N-甲酰基-α-L-天冬氨酰基-L-苯基丙氨酸甲酯的L-和/或/D-苯基丙氨酸甲酯加成物(通常是其比例为1∶1的加成物)，通过使其悬浊在上述pH值的水溶液中，由于L-和/或/D-苯基丙氨酸甲酯溶解于水溶液中，所以可以有选择性地以固体形式分离出N-甲酰基-α-L-天冬氨酰基-L-苯基丙氨酸甲酯。水溶液的pH值，可以在使该加成物悬浊之前，预先调节至上述pH值范围。也可以在悬浊之后调节pH值。作为水溶液的溶剂通常只使用水。也可以在水中混合甲醇、乙醇等能与水很好混合的有机溶剂，但是一般没有这个必要。这里所说的“水溶液”不仅是指只用水作溶剂的情况，还包括使用甲醇、乙醇等能够与水很好混合的有机溶剂和水的混合溶剂的情况。
水溶液的量，只要是能够达到上述目的，则没有特别限制，本行业者可以设定适宜的优选条件，例如，水溶液相对于1份该加成物的量，按重量比计算的范围可以设定为7～10。对反应温度也没有特别限制，通常可以在室温下进行反应。为了进一步提高纯度，根据需要可以反复进行这种操作。
这样得到的N-甲酰基-α-L-天冬氨酰基-L-苯基丙氨酸甲酯，可以用本行业已知的方法、例如在盐酸存在的条件下，使用甲醇-水的混合溶剂除去甲酰基的方法等(例如，参照特开昭58-185545号公报、实施例10)得到α-L-天冬氨酰基-L-苯基丙氨酸甲酯(天冬酰苯丙氨酸甲酯)。
在天冬酰苯丙氨酸甲酯的制备中，对“本发明的甲酰化法1”、“本发明F-APM的制备方法；缩合反应”(优选在三烷基磷酸酯存在的条件下进行的该方法)和“本发明F-APM的制备方法；分离方法”的各工艺流程，可以任意进行组合，可以优选组合使用所有工艺流程的方法，更简便地、有效地实现工业化制备天冬酰苯丙氨酸甲酯。
(本发明的甲酰化法2)该项发明在于以在碱存在的条件下，使中性氨基酸和甲酰胺和/或甲酸甲酯反应为特征的N-甲酰基中性氨基酸或其盐的制备方法；和以使中性氨基酸的盐和甲酰胺和/或甲酸甲酯反应为特征的N-甲酰基中性氨基酸或其盐的制备方法。
该项发明的原料物质，使用中性氨基酸或中性氨基酸的盐，但是作为反应的具体方案也可以使用中性氨基酸(单体)、中性氨基酸的盐、以及这些中性氨基酸单体和盐的混合物作为原料。该中性氨基酸，可以单独使用一种氨基酸、也可以使用多种氨基酸的混合物，该氨基酸盐同样也可以单独使用一种氨基酸盐、也可以混合使用多种氨基酸盐，从工业上控制反应的角度考虑，最好使用1种氨基酸或其盐(1种)。
如前所述，对于本发明中所用中性氨基酸的光学异构没有特别限制，可以使用L-体、D-体或DL-体中的任何一种。本发明的N-甲酰化反应中，不容易引起外消旋，所以通过使用具有旋光性的中性氨基酸(或其盐)作为原料，在反应后，可以作为旋光物得到N-甲酰基中性氨基酸或其盐。
该项发明的甲酰化反应中，除前述本发明的特征部分以外，作为氨基的N-甲酰化方法，可以利用其自身具有的已知方法和今后将研制的方法。
该项发明的甲酰化反应可以在不使用溶剂的条件下进行。当使用溶剂时，只要是溶剂对反应呈惰性，则无特别限制，但是优选使用水、极性溶剂、或水与极性溶剂的混合溶剂。
作为极性溶剂，优选使用能与水混合的溶剂，例如甲醇、乙醇等醇类和二甲基亚砜等。当然也可以混合使用1种以上的此类极性溶剂。
对于所用碱的种类没有特别限制，可以优选使用氢氧化钠、氢氧化钾等氢氧化物，碳酸钠、碳酸钾等碳酸盐，氨、三乙基胺等胺类物质。特别优选使用氢氧化钠、氢氧化钾、氨等物质。当然也可以混合使用这些碱。
当使用溶剂时，对所用溶剂的量没有特别限制，只要是原料物质的中性氨基酸(或其盐)以及碱能够溶解到不影响本发明效果的程度即可。如果是本行业的从业人员，都能够很容易地适当选择设定优选条件。
关于所用的甲酰胺或甲酸甲酯的用量，没有特别限制，其相对于原料物质所使用的中性氨基酸或其盐的用量，当以单体和盐的混合物形态使用时，相对于该混合物的用量，优选为0.5～6倍摩尔左右、更优选为1.5～3倍摩尔左右。另外，如果不使用溶剂进行反应时，优选为2～10倍摩尔左右、更优选为3～5倍摩尔左右。如前所述，也可以使用甲酰胺和甲酸甲酯的混合物作为甲酰化剂，这时，该混合物相对于前述原料物质的量优选为0.5～6倍摩尔左右、更优选1.5～3倍摩尔左右，此外，当不使用溶剂进行反应时，可以优选使用2～10倍摩尔左右，更优选使用3～5倍摩尔左右。
关于该项发明中的碱的用量，可以使相对于原料物质中性氨基酸的碱用量优选为0.1～10倍摩尔左右、更优选0.2～5倍摩尔左右、进一步优选0.2～2.5倍摩尔左右。
如果碱的用量太少，则反应速度有变慢的倾向，是不理想的。另外，如果碱的用量太多，则有发生副反应的倾向，也是不理想的。
作为该项发明中所用的反应温度，没有特别限制。如果反应温度太高，则存在有发生外消旋等副反应的问题；如果反应温度太低，则存在有反应变慢的倾向，所以优选的反应温度范围是30～130℃左右、更优选范围是40～100℃左右。
在该项发明中，可以使用中性氨基酸(单体)作为原料物质，也可以使用中性氨基酸的盐作为原料物质。作为反应的具体方案，也可以使用其混合物。即使是使用中性氨基酸的盐作为原料物质，反应条件也与前文叙述的条件相同，根据前文中的说明很容易实施。此外，本发明中，当使用单体的中性氨基酸作为原料物质时，在该反应中，碱和中性氨基酸发生中和反应，生成相应的盐。因此，也可以把这样生成的盐称为原料物质的中性氨基酸的盐，也可以把调制或准备用于其它方面原料的中性氨基酸盐称为前文中叙述的中性氨基酸盐。
作为中性氨基酸的盐，可以列举钠盐、钾盐、铵盐等。
通过本发明得到的N-甲酰基中性氨基酸通常在反应结束时，是以对应盐的形态存在的。因此，可以按照常规方法，对反应液任意进行中和、萃取、结晶析出等操作，根据需要还可以进行脱盐工序和成盐工序以N-甲酰基中性氨基酸(单体)或其盐的形态得到需要的目的物质。
优选的实施方案以下，通过实施例、比较例和参考例详细说明本发明的情况。但是，这些实施例并不能限定本发明的内容。
(本发明的甲酰化法1)<实施例1>
在反应容器中，顺次添加L-天冬氨酸1.0g(7.5mmol)、甲酰胺0.30ml(7.5mmol)、水0.21ml，然后加入氢氧化钠水溶液0.78ml(9.6M、7.5mmol)将pH值调节到8.7。在50℃下使其反应22小时后，用高速液相色谱(HPLC)对生成物进行分析，结果表明生成了N-甲酰基-L-天冬氨酸0.45g(36.8％相对L-天冬氨酸)。
<实施例2>
在反应容器中，顺次添加L-天冬氨酸1.02g(7.7mmol)、甲酰胺0.61ml(15.0mmol)、水0.19ml，然后加入氢氧化钠水溶液0.80ml(9.6M、7.7mmol)将pH值调节到8.4。在50℃下使其反应22小时后，用高速液相色谱对生成物进行分析，结果表明生成了N-甲酰基-L-天冬氨酸0.42g(33.9％相对L-天冬氨酸)。
<实施例3>
在反应容器中，顺次添加L-天冬氨酸1.00g(7.5mmol)、甲酰胺0.91ml(22.5mmol)、水0.21ml，然后加入氢氧化钠水溶液0.78ml(9.6M、7.5mmol)将pH值调节到8.7。在50℃下使其反应22小时后，用高速液相色谱对生成物进行分析，结果表明生成了N-甲酰基-L-天冬氨酸0.59g(48.7％相对L-天冬氨酸)。
<实施例4>
在反应容器中，顺次添加L-天冬氨酸1.03g(7.7mmol)、甲酰胺0.30ml(7.5mmol)、水0.77ml，然后加入颗粒状氢氧化钠0.61g(15.4mmol)将pH值调节到11.1。在50℃下使其反应22小时后，用高速液相色谱对生成物进行分析，结果表明生成了N-甲酰基-L-天冬氨酸0.76g(61.6％相对L-天冬氨酸)。
<实施例5>
在反应容器中，顺次添加L-天冬氨酸1.01g(7.6mmol)、甲酰胺0.61ml(15.0mmol)、水0.77ml，然后加入颗粒状氢氧化钠0.57g(15.1mmol)将pH值调节到11.2。在50℃下使其反应22小时后，用高速液相色谱对生成物进行分析，结果表明生成了N-甲酰基-L-天冬氨酸1.1g(90.6％相对L-天冬氨酸)。
<实施例6>
在反应容器中，顺次添加L-天冬氨酸1.02g(7.7mmol)、甲酰胺0.91ml(22.5mmol)、水0.77ml，然后加入颗粒状氢氧化钠0.61g(15.4mmol)将pH值调节到11.2。在50℃下使其反应22小时后，用高速液相色谱对生成物进行分析，结果表明生成了N-甲酰基-L-天冬氨酸1.2g(94.4％相对L-天冬氨酸)。
<实施例7)在反应容器中，添加L-天冬氨酸单钾盐1.50g(8.8mmol)、甲酰胺1.20g(26.3mmol)，然后在100℃下使其反应4.5小时。用高速液相色谱对生成物进行分析，结果表明生成了N-甲酰基-L-天冬氨酸1.20g(85.0％相对L-天冬氨酸)。
<实施例8>
在反应容器中，顺次添加L-天冬氨酸1.0g(7.6mmol)、甲酰胺0.71g(15.2mmol)、29％的氨水1.11g(19.0mmol)，然后在50℃下使其反应27小时。用高速液相色谱对生成物进行分析，结果表明生成了N-甲酰基-L-天冬氨酸1.1g(88.8％相对L-天冬氨酸)。
<实施例9>
在反应容器中，顺次添加L-天冬氨酸10.0g(75.1mmol)、甲酰胺7.0g(150.3mmol)、30％的甲醇-水21.4ml，然后加入颗粒状氢氧化钠6.26g(150.3mmol)将pH值调节到10.4，在40℃下使其反应27小时后，用高速液相色谱对生成物进行分析，结果表明生成了N-甲酰基-L-天冬氨酸9.4g(77.7％相对L-天冬氨酸)。
<比较例1>
按照US4789757的实施例1，在反应容器中添加L-天冬氨酸1.0g(7.7mmol)、甲酰胺1.8g(38.4mmol)，然后在95℃下使其反应2小时。用高速液相色谱对生成物进行分析，结果表明生成了N-甲酰基天冬氨酸0.49g(39.8％相对L-天冬氨酸)。
<比较例2>
在反应容器中，顺次添加L-天冬氨酸1.0g(7.5mmol)、甲酰胺0.91ml(22.5mmol)、水1.0ml，然后在50℃下使其反应22小时。用高速液相色谱对生成物进行分析，结果表明生成了N-甲酰基-L-天冬氨酸0.015g(1.2％相对L-天冬氨酸)。
<实施例10>
在反应容器中，添加L-天冬氨酸19.9g(0.15mol)、颗粒状氢氧化钠12.1g(0.30mol)、水30ml，冷却至0℃。再用9小时时间滴入甲酸甲酯27.3g(0.45mol)，然后再于0℃下进一步强力搅拌11小时。用高速液相色谱对生成物进行分析，结果表明生成了N-甲酰基-L-天冬氨酸16.6g(68.9％相对L-天冬氨酸)。
<实施例11>
在反应容器中，添加L-天冬氨酸19.9g(0.15mol)、颗粒状氢氧化钠12.1g(0.30mol)、水60ml，冷却至0℃。用9小时时间滴入甲酸甲酯27.3g(0.45mol)后，在0℃下进一步强力搅拌12小时。用高速液相色谱对生成物进行分析，结果表明生成了N-甲酰基-L-天冬氨酸12.6g(52.1％相对L-天冬氨酸)。
<实施例12>
在反应容器中，添加L-天冬氨酸19.9g(0.15mol)、颗粒状氢氧化钠12.1g(0.30mol)、水15ml，冷却至0℃。用9小时时间滴入甲酸甲酯27.8g(0.45mol)，然后再于0℃下进一步强力搅拌12小时。用高速液相色谱对所得浆液进行分析，结果表明生成了N-甲酰基-L-天冬氨酸17.7g(73.2％相对L-天冬氨酸)。
<实施例13>
在反应容器中，添加L-天冬氨酸19.9g(0.15mol)、颗粒状氢氧化钠12.1g(0.30mol)、水30ml，控制其温度为25℃。用1小时时间滴入甲酸甲酯27.3g(0.45mol)，然后继续在25℃下进一步强力搅拌13小时。用高速液相色谱对所得反应液进行分析，结果表明生成了N-甲酰基-L-天冬氨酸13.5g(56.0％相对L-天冬氨酸)。
<实施例14>
使用依利埃(イリエ)商会制造的台式捏合机作为搅拌装置。
在捏合机中，添加L-天冬氨酸99.7g(0.75mol)、颗粒状氢氧化钠60.4g(1.45mol)、水151ml，控制其温度为0℃。用9小时时间滴入甲酸甲酯136.4g(2.20mol)，然后再于0℃下进一步强力搅拌2小时。用高速液相色谱对所得浆液进行分析，结果表明生成了N-甲酰基-L-天冬氨酸84.2g(69.8％相对L-天冬氨酸)。
<实施例15>
在反应容器中，添加L-天冬氨酸19.9g(0.15mol)、颗粒状氢氧化钠19.8g(含量85％、0.30mol)、水30ml，控制其温度为25℃。用1小时时间滴入甲酸甲酯27.3g(0.45mol)，然后继续在25℃下进一步强力搅拌13小时。用高速液相色谱对所得反应液进行分析，结果表明生成了N-甲酰基-L-天冬氨酸9.9g(41％相对L-天冬氨酸)。
<实施例16>
在反应容器中，添加L-天冬氨酸10.0g(75.1mmol)、29％的氨水28.4g(480.8mmol)，控制其温度为25℃。用5分钟时间滴入甲酸甲酯9.2g(150.3mmol)，然后在50℃下进一步强力搅拌24小时。用高速液相色谱对所得反应液进行分析，结果表明生成了N-甲酰基-L-天冬氨酸9.4g(77.9％相对L-天冬氨酸)。
<实施例17>
在反应容器中，添加L-天冬氨酸19.9g(0.15mol)、颗粒状氢氧化钠12.1g(0.30mol)、20％甲醇-水40ml，控制其温度为25℃。用1小时时间滴入甲酸甲酯27.3g(0.45mol)，然后继续在25℃下进一步强力搅拌13小时。用高速液相色谱对所得反应液进行分析，结果表明生成了N-甲酰基-L-天冬氨酸10.2g(42.2％相对L-天冬氨酸)。
<比较例3>
在反应容器中，添加L-天冬氨酸19.9g(0.15mol)、和水30ml，控制其温度为25℃。滴入甲酸甲酯27.3g(0.45mol)后，原样搅拌48小时。用高速液相色谱对所得反应液进行分析，结果表明根本没有生成N-甲酰基-L-天冬氨酸。
<比较例4>
按照美国第4,789,757号专利所述的实施例1，在反应容器中，添加L-天冬氨酸1.01g(7.7mmol)、甲酰胺1.55ml(38.4mmol)，然后在95℃下使其反应2小时。用高速液相色谱对生成物进行分析，结果表明生成了N-甲酰基-L-天冬氨酸0.49g(39.8％相对L-天冬氨酸)。
(本发明的F-APM的制备方法；缩合反应)关于酶缩合反应的转化率，是通过所谓高速液相色谱(HPLC)、使用210nm的紫外分光检测器、用填充十八碳烷基结合硅胶的色谱柱、使用0.1M磷酸二氢钾水溶液(pH＝2.8)/乙腈溶剂进行定量。
<实施例18>
把L-苯基丙氨酸甲酯盐酸盐(2.16g∶10.0mmol)、N-甲酰基-L-天冬氨酸钠盐2.11g(含有N-甲酰基-L-天冬氨酸0.81g∶5.0mmol)、二水合氯化钙65mg和水1.6g置于20ml的茄形烧瓶中，在40℃下混合、溶解。然后添加25重量％的氢氧化钠水溶液，把混合水溶液的pH值调节到5.45。在减压下馏去水分，使混合水溶液中的含水量达到17.5重量％(N-甲酰基-L-天冬氨酸浓度为7.2mol/L)，然后在残存的清净溶液中混合0.30g粗嗜热菌蛋白酶(大和化成社制造的粉末商品名为“萨摩阿塞PS160”、含有大约40％的蛋白酶和大约60％的硫酸钠)。在40℃下反应20小时后，反应液形成固态。把固态物质溶解在水中，通过HPLC进行分析，由分析结果可以确认以N-甲酰基-L-天冬氨酸为基准，向F-APM的最终转化率达到85％。
<实施例19>
在实施例18中，使(蒸)馏(除)去水分后混合水溶液中的含水量达到30重量％(N-甲酰基-L-天冬氨酸浓度为3.6mol/L)，除此之外，进行与实施例18相同的操作，结果可以确认以F-Asp为基准，向F-APM的最终转化率达到62.9％。
<实施例20>
在L-苯基丙氨酸甲酯盐酸盐(1.08g∶5.0mmol)和N-甲酰基-L-天冬氨酸(0.81g∶5.0mmol)中，加入10重量％的氯化钙水溶液0.66g和水1.0g，在40℃下使其溶解，用15重量％的氢氧化钠水溶液将其pH值调节到5.8。在减压下馏去水分，使混合水溶液中的含水量达到17.5重量％(N-甲酰基-L-天冬氨酸浓度为10.8mol/L)以后，向其中加入0.30g粗嗜热菌蛋白酶(与实施例18中使用的相同，“萨摩阿塞PS160”)，搅拌至反应液均匀。在40℃下反应20小时后，反应液形成固态。把固态物质溶解在水中，通过HPLC进行分析，由分析结果可以确认以N-甲酰基-L-天冬氨酸为基准，L-PM加成物的收率达到41.7％，该收率表示向F-APM的转化率为83.4％。
<实施例21>
在实施例20中，把L-苯基丙氨酸甲酯盐酸盐的用量改为0.54g(2.5mmol)，除此之外，进行与实施例20相同的缩合反应。通过HPLC进行分析，由分析结果可以确认以N-甲酰基-L-天冬氨酸为基准，L-PM加成物的收率达到34.8％，该收率表示向F-APM的转化率为69.6％。
<比较例5>
在L-苯基丙氨酸甲酯盐酸盐2.16g(10.0mmol)和N-甲酰基-L-天冬氨酸钠盐2.11g(含有N-甲酰基-L-天冬氨酸0.81g∶5.0mmol)中，加入10重量％的氯化钙水溶液0.71g和水1.0g，用25重量％的氢氧化钠水溶液将其pH值调节到5.5，再用水将溶液总量调节至8.62g(混合水溶液中的含水率为59.0重量％)(N-甲酰基-L-天冬氨酸的浓度为1.0mol/L)。向该溶液中加入0.30g粗嗜热菌蛋白酶(与实施例18中使用的相同，“萨摩阿塞PS160”)混合。在40℃下反应20小时后。把反应析出的固体溶解在水中，通过HPLC进行分析，由分析结果可以确认以F-Asp为基准，向F-APM的最终转化率是45.7％。
<参考例1>
在L-苯基丙氨酸甲酯盐酸盐2.15g(10.0mmol)和F-N-甲酰基-L-天冬氨酸钠盐2.11g(含有F-Asp 0.81g∶5.0mmol)中，加入10重量％的氯化钙水溶液0.7g和水1.0g，用25重量％的氢氧化钠水溶液将其pH值调节到6.5。在减压下馏去水分，使混合水溶液中的含水量达到18.7重量％以后(N-甲酰基-L-天冬氨酸浓度为6.6mol/L)，向其中加入0.30g粗嗜热菌蛋白酶(与实施例18中使用的相同，“萨摩阿塞PS160”)混合。在40℃下反应18小时后，反应液形成固态。把固态物质溶解在水中，通过HPLC进行分析，由分析结果可以确认，以F-Asp为基准，向F-APM的最终转化率为43.0％。
<参考例2>
在参考例1中，把pH值调节到7.5，除此之外，实施与参考例1相同的缩合反应。以F-Asp为基准，向F-APM的最终转化率为5.8％。
(本发明F-APM的制备方法；缩合反应同时存在有三烷基磷酸酯)<实施例22>
使L-苯基丙氨酸甲酯盐酸盐(8.16g∶40mmol)溶解在水20.0g中，在其中加入三正丁基磷酸酯(以下简称为“TBP”)20.0g，激烈搅拌，用15重量％的氢氧化钠水溶液将其pH值调节到7.0。再进一步于40℃下激烈搅拌30分钟、萃取后分离水层和有机层。把该有机层作为L-PM/TBP溶液(PM1.05mmol/g；7重量％)用于以下的反应中。
在L-苯基丙氨酸甲酯盐酸盐(2.15g∶10mmol)和N-甲酰基-L-天冬氨酸(0.81g∶5.0mmol)中，加入10重量％的氯化钙水溶液0.66g和水1.0g，在40℃下使其溶解，用15重量％的氢氧化钠水溶液将其pH值调节到5.8。在减压下馏去水分，使混合水溶液中的含水量达到23.3％以后(N-甲酰基-L-天冬氨酸浓度为5.05mol/L)，向其中加入PM/TBP溶液12g(TBP 8.9g)和粗嗜热菌蛋白酶(大和化成社制造的粉末商品名为“萨摩阿塞PS160”、含有大约40％的蛋白酶蛋白质和大约60％的硫酸钠)0.3g，搅拌至反应液均匀。在40℃下搅拌20小时后，过滤所得浆液得到F-APM的L-PM加成物结晶。分别对结晶和母液进行HPLC分析，由分析结果可以确认以F-Asp为基准，向F-APM的最终转化率达到77.3％(结晶中为73.3％，母液中为4.0％)。
<实施例23>
添加PM/TBP溶液6.0g(TBP4.45g)，除此之外按照与实施例22同样的方法进行酶缩合反应。对所得浆液进行过滤分离，并分别对结晶和母液进行HPLC分析，结果表明向F-APM的最终转化率为72.0％(结晶中为68.4％，母液中为3.6％)。
<实施例24>
添加PM/TBP溶液16.6g(TBP12.32g)，除此之外按照与实施例22同样的方法进行酶缩合反应。对所得浆液进行过滤分离，并分别对结晶和母液进行HPLC分析，结果表明向F-APM的最终转化率为54.1％(结晶中为47.3％，母液中为6.8％)。
<实施例25>
把N-甲酰基-L-天冬氨酸的浓度调节至6.25mol/L，除此之外按照与实施例22同样的方法进行酶缩合反应。对所得浆液进行过滤分离，并分别对结晶和母液进行HPLC分析，结果表明向F-APM的最终转化率为65.1％(结晶中为62.8％，母液中为2.3％)。
<实施例26>
把N-甲酰基-L-天冬氨酸的浓度调节至3.58mol/L，除此之外按照与实施例22同样的方法进行酶缩合反应。对所得浆液进行过滤分离，并分别对结晶和母液进行HPLC分析，结果表明向F-APM的最终转化率为58.2％(结晶中为54.9％，母液中为3.3％)。
<实施例27>
把N-甲酰基-L-天冬氨酸的浓度调节至1.53mol/L，除此之外按照与实施例22同样的方法进行酶缩合反应。对所得浆液进行过滤分离，并分别对结晶和母液进行HPLC分析，结果表明向F-APM的最终转化率为54.6％(结晶中为49.0％，母液中为5.6％)。
(本发明的F-APM的制备方法；分离方法)
<实施例28>
进行与实施例18同样的反应，在所得反应液中，加入水10ml、使析出的固体分散，在冰冷下搅拌1小时后、进行固液分离。再用2ml水洗涤湿结晶。用HPLC对所得湿结晶2.73g进行分析，结果表明其中含有F-APM42.4重量％(3.59mmol)和L-PM25.1重量％(3.82mmol)。同时，在加入有结晶洗涤液的母液13.4g中，含有1.0重量％(0.42mmol)的F-APM。也就是反应的总收率为80％、分离后的收率为72％。把所得湿结晶悬浊在10ml水中，用1N盐酸将pH值调节至1.7。在冰冷下搅拌1小时后，对悬浊液进行分离、得到1.86g湿结晶。该湿结晶中，含有F-APM54.0重量％(3.11mmol)和L-PM2.9重量％(0.3mmol)。即可以确认F-APM的收率为86.8％、91.4％的L-PM被淘汰在母液之中。
<实施例29>
进行与实施例22同样的操作，得到F-APM的L-PM加成物的湿结晶4.98g(F-APM3.64mmol、L-PM4.62mmol、反应收率77.4％、结晶中的F-APM的收率为72.8％)。把所得湿结晶悬浊在10ml水中后进行冰冷，用1N盐酸将其pH值调节至1.8。在冰冷下搅拌1小时后，对该悬浊液进行过滤、得到1.92g湿结晶。该湿结晶中，含有F-APM3.17mmol、L-PM0.43mmol。即可以确认F-APM的收率为87.1％、93％的L-PM被淘汰在母液之中。
(本发明的甲酰化法2)<实施例30>
在反应容器中，加入L-亮氨酸1.31g(0.01摩尔)、氢氧化钠0.40g(0.01摩尔)、甲酰胺1.35g(0.03摩尔)和水1.2ml，在50℃下使其反应48小时。用高速液相色谱法对所得反应液的生成物进行分析，结果表明生成了N-甲酰基-L-亮氨酸1.18g(74.1％相对L-亮氨酸)。
<实施例31>
在反应容器中，加入L-亮氨酸1.31g(0.01摩尔)、29％的氨水0.64g(0.011摩尔)、甲酰胺1.35g(0.03摩尔)和水1.2ml，在50℃下使其反应48小时。用高速液相色谱法对所得反应液的生成物进行分析，结果表明生成了N-甲酰基-L-亮氨酸1.14g(71.6％相对L-亮氨酸)。
<实施例32>
在反应容器中，加入L-亮氨酸1.31g(0.01摩尔)、氢氧化钠0.40g(0.01摩尔)、甲酰胺0.90g(0.02摩尔)和水1.2ml，在80℃下使其反应5小时。用高速液相色谱法对所得反应液的生成物进行分析，结果表明生成了N-甲酰基-L-亮氨酸1.11g(69.7％相对L-亮氨酸)。
<实施例33>
在反应容器中，加入L-亮氨酸1.31g(0.01摩尔)、氢氧化钠0.40g(0.01摩尔)、甲酸甲酯1.80g(0.03摩尔)和水1.2ml，在冰冷下2小时，然后在室温下使其反应22小时。用高速液相色谱法对所得反应液的生成物进行分析，结果表明生成了N-甲酰基-L-亮氨酸1.27g(79.8％相对L-亮氨酸)。
<实施例34>
在反应容器中，加入L-亮氨酸1.31g(0.01摩尔)、29％的氨水0.64g(0.011摩尔)、甲酸甲酯1.80g(0.03摩尔)和水1.2ml，在冰冷下2小时，然后在室温下使其反应22小时。用高速液相色谱法对所得反应液的生成物进行分析，结果表明生成了N-甲酰基-L-亮氨酸1.21g(76.0％相对L-亮氨酸)。
<实施例35>
在反应容器中，把L-亮氨酸19.7g(0.15摩尔)、氢氧化钠6.0g(0.15摩尔)、加入到水30ml中，冷却至0℃。用9小时时间滴入甲酸甲酯27.3g(0.45摩尔)，然后在室温下强力搅拌15小时。用高速液相色谱法对所得反应液的生成物进行分析，结果表明生成了N-甲酰基-L-亮氨酸19.2g(80.4％相对L-亮氨酸)。
由以上说明可以清楚地了解到，通过高效制备N-甲酰基天冬氨酸(或其盐)并使其与L-和/或DL-苯基丙氨酸甲酯的酶缩合反应、并接着进行分离的方法，可以高收率并高纯度地制备天冬酰苯丙氨酸甲酯的前体F-APM。用这样制备的F-APM，按照前述的一般方法进行脱甲酰化处理，可以高收率制备天冬酰苯丙氨酸甲酯。
另外，还可以以相当高的收率对中性氨基酸进行N-甲酰化处理。
在上述甲酰化反应中，很难发生外消旋，所以通过使用具有旋光性的天冬氨酸或中性氨基酸(或这些物质的盐)作为原料，在该N-甲酰化反应之后，可以得到作为旋光物的N-甲酰基氨基酸或其盐。
发明的效果如果按照本发明可以在工业上高效而简便地制备作为各种合成中间体、特别是作为肽合成中间体等的重要的N-甲酰基氨基酸、特别是N-甲酰基天冬氨酸(或其盐)和亮氨酸等N-甲酰基中性氨基酸(或其盐)。
还可以在工业上高效而简便地用N-甲酰基-L-天冬氨酸制备甜味剂天冬酰苯丙氨酸甲酯的前体N-甲酰基-α-L-天冬氨酰基-L-苯基丙氨酸甲酯和该天冬酰苯丙氨酸甲酯。
因此，本发明在工业上特别在食品和药品领域是相当有用的。


本发明提供通过在碱存在的条件下，使氨基酸或氨基酸盐与甲酰胺和/或甲酸甲酯反应，在工业上高效而简便地制备N－甲酰基氨基酸的方法。本发明还提供在N－甲酰基天冬氨酸和苯基丙氨酸甲酯的酶缩合反应中，通过调节特定的N－甲酰基天冬氨酸的浓度或者是在三烷基磷酸酯存在的条件下进行反应，在工业上高效而简便地制备天冬酰苯丙氨酸甲酯的前体N－甲酰基－α－天冬氨酰基苯基丙氨酸甲酯的方法。本发明还提供通过调节N－甲酰基－α－天冬氨酰基苯基丙氨酸甲酯的苯基丙氨酸甲酯加成物的pH值，制备高纯度N－甲酰基－α－天冬氨酰基苯基丙氨酸甲酯的方法。