专利名称：家用冬虫夏草鉴定试剂盒及其使用方法家用冬虫夏草鉴定试剂盒及其使用方法本发明涉及生物鉴定试剂盒，更具体地，涉及一种家用冬虫夏草鉴定试剂盒及其使用方法。冬虫夏草是我国传统名贵中药，冬虫夏草已经被用来治疗高血糖症、呼吸系统疾病、肝病、肾衰竭，并作为抗癌药物和抗氧化剂等。目前，与冬虫夏草有关的无性型菌种报到已有22个学名，涉及13个属。经过多年争论，2005年10月，中国菌物学会在北京召开了 《冬虫夏草及其无性型研讨会》，确定中国被毛孢(Hirsutella sinensis)为冬虫夏草唯一无性型菌种。目前市场上伪品和混淆品众多，不容易区分，为临床和推广带来了很多困难。冬虫夏草的鉴定多为生药学的鉴定，主要针对外观、颜色、气味、味道等，这些方法比较主观，也需要一定的经验，普通人很难在短期内掌握。目前也有一些使用液相色谱对其中的一些成分进行检测，从而进行鉴定的报到，但是需要昂贵的大型设备，很难普及和现场使用。随着分子生物学的深入研究，聚合酶链式反应技术(PCR)也被应用到了冬虫夏草的鉴定，同样的也需要PCR仪、电泳仪等设备，而且存在着操作过程繁琐的缺点。所以及时运用生物技术发展的最新成果来进行冬虫夏草的鉴定具有重要意义。环介导恒温扩增技术 (LAMP)只需要一个恒温环境就能够产生肉眼可见的颜色变化，具有很多优越性。环介导恒温扩增技术(LAMP)需要样品的DNA作为模板进行扩增，其样品的制备过程仍然有些复杂繁琐，无法满足家庭和现场使用。因此需要一种鉴定结果直观、操作简单、特异性好、适合家用的冬虫夏草鉴定试剂盒及其使用方法来解决以上问题。本发明的目的是在于解决现有技术的不足之处而提供一种提供一种鉴定结果直观、操作简单、特异性好、适合家用的冬虫夏草鉴定试剂盒。本发明的目的可以通过以下技术措施实现家用冬虫夏草鉴定试剂盒包括以冬虫夏草真菌ITS基因为靶基因、基于环介导恒温扩增技术设计的三对引物内引物FIP/BIP、 外引物F3/B3和环引物LB/LP。核糖体RNA (rRNA)位于18s48s rDNA之间的内转录间隔区(ITS区)，它包括进化上高度保守的5. 8s rDNA和包含有rDNA前体加工信息的两个间隔区ITS-I、ITS_2。在rDNA 多基因家族成员中，ITS是多拷贝，以串联重复方式出现在一个或多个染色体基因位点上， 同时ITS区又有通过不等交换和基因转变等方式经历快速一致进化的的特性，使得重复单位在基因组内保持了高度一致性；而且ITS区两侧有高度保守序列存在，通过设计在保守区域上的引物扩增ITS区，可以有效地解决系统发育和生物鉴别问题。ITS序列是真菌菌种和分离物鉴定的可靠依据。本发明就是针对该区域进行冬虫夏草的鉴定。根据Genebank上的冬虫夏草基因设计引物如下 FIP :GTCGCAGTGGCATCTCTCAGTC-ATGCCCGCCAGAGTGC BIP :AGGAGGGTCTGGGGGTCCTC-CAGCAGTTGCCTCGGCF3 :GGTTGAGATGACGCTCGGAB3 :CCCCCTGCGAACACCAFL TACTGCGCAGGGGAGCBL CCTGCGAACACCACAGC作为本发明家用冬虫夏草鉴定试剂盒的优选实施方式，所述的冬虫夏草鉴定试剂盒还包括稀释液、一次性移液管、反应管。作为本发明家用冬虫夏草鉴定试剂盒的更优选的实施方式，所述的反应管含有冷冻干燥物质，冻干物质含有Bst DNA聚合酶1 10单位/管，1.6 2mmol/L dNTP、 20 50mmol/LTris-HCl、10 20mmol/L KCl、10 50mmol/L MgS04、0. 1 0· 5 体积 ％ TritonX-100、0. 8 2mmol/L甜菜碱、0. 2 2mol/L HNB,内引物 FIP/BIP 0. 6 1. 6ummol/ L、外引物F3/B30. 1 0. 4ummol/L、环引物LB/LP 0. 2 0. 8ummol/L以上物质溶于10 IOOul水中，然后冷冻干燥处理。作为本发明家用冬虫夏草鉴定试剂盒的更优选的实施方式，其特征在于，该方法包括以下步骤(1)将待检测、阴性和阳性样品分别用剪刀剪成尽可能小的薄片2 8片。(2)分别放入稀释液中，做好标记，盖好管盖，摇晃混勻，静置。(3)分别用一次性移液管吸取上清滴加到反应管。(4)用一次性移液管吸头轻轻吹打反应管中的底部蓝色物质，直至完全溶解。(5)将反应管放入恒温反应环境反应。(6)观察反应管颜色变化，蓝色为阳性，浅红色为阴性。本发明所说的基于环介导恒温扩增技术(LAMP)鉴定冬虫夏草的方法，是利用Bst DNA聚合酶和根据靶基因序列设计的三对特殊内引物FIP/BIP、外引物F3/B3和环引物LB/ LP，特异性的识别靶序列上的8个独立区域，启动循环链置换反应，在靶标DNA区域启动互补链合成，结果在同一链上互补序列周而复始形成有很多环的花椰菜结构的茎-环DNA混合物。LAMP反应过程中，从DNTP析出的焦磷酸根离子与反应液中的镁离子结合，产生副产物焦磷酸镁沉淀。使溶液中的镁离子浓度降低，从而使HNB呈现不同的颜色变化。LAMP反应时在恒温(63 65度)条件下20 100分钟内完成。这种比较温和的温度条件以及没有温度循环使所需仪器简化，克服了传统PCR技术所需时间长、检测成本高的缺点。此外此种鉴定对操作人员技术要求低，实际操作极为简便，不需要特殊仪器设备，适合家庭和现场使用。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果1.本发明的家用冬虫夏草鉴定试剂盒只需要一个恒定温度就能扩增反应，不需要其他特殊设备，检测方便，成本低，适合家庭和现场使用。2.本发明的家用冬虫夏草鉴定试剂盒应用8个区段、六条引物区扩增靶基因序列，因此具有高特异性。3.本发明的家用冬虫夏草鉴定试剂盒扩增快速且高效，在半个小时左右就可以完成反应。4.本发明的家用冬虫夏草鉴定试剂盒使用HNB作为显色剂，可以通过肉眼观察颜色，阴阳结果差异显著，验证效率高，结果可靠。5.本发明的家用冬虫夏草鉴定试剂盒由于选择了 ITS序列这一真菌菌种和分离物鉴定的可靠依据，使得本发明的检测准确率高。6.本发明的家用冬虫夏草鉴定试剂盒将样品DNA的制备过程简化为剪切、手动裂解，使得冬虫夏草鉴定技术走进家庭成为了可能。7.本发明的冬虫夏草鉴定试剂盒全部采用密封的一次性小管，减少了气溶胶污染的可能。为了使本发明更加容易理解，下面将进一步阐述本发明的具体实施。实施例1试剂盒的制备(1)按以下序列合成寡聚脱氧核酸引物FIP :GTCGCAGTGGCATCTCTCAGTC-ATGCCCGCCAGAGTGCBIP :AGGAGGGTCTGGGGGTCCTC-CAGCAGTTGCCTCGGCF3 GGTTGAGATGACGCTCGGAB3 :CCCCCTGCGAACACCAFL :TACTGCGCAGGGGAGCBL :CCTGCGAACACCACAGC(2)制备工艺如下将Bst DNA 聚合酶 10 单位 / 管，2mmol/L dNTP、50mmol/L Tris-HCl、20mmol/L KCl、50mmol/L MgS04、0. 5 体积％ TritonX-100、lmmol/L 甜菜碱、lmol/L HNB，内引物 FIP/ BIP1. 6ummol/L、外引物 F3/B3 0. 2ummol/L、环引物 LB/LP 0. 4ummol/L。以上物质溶于25ul水中，然后冷冻干燥处理。(3)试剂盒的应用a.将冬虫夏草和亚香棒虫草、分支虫草、四川虫草、湖北虫草、安徽虫草分别用剪刀剪成尽可能小的薄片2 8片。b.分别放入稀释液中，做好标记，盖好管盖，摇晃混勻，静置。c.分别用一次性移液管吸取上清滴加到反应管。d.用一次性移液管吸头轻轻吹打反应管中的底部蓝色物质，直至完全溶解。e.将反应管放入65度恒温反应环境反应20-60分钟。f.观察反应管颜色变化，冬虫夏草为浅蓝色，亚香棒虫草、分支虫草、四川虫草、湖北虫草、安徽虫草为浅红色。(4)材料a.冬虫夏草和亚香棒虫草、分支虫草、四川虫草、湖北虫草、安徽虫草购买自安徽亳州药材市场。b.Bst DNA聚合酶购买自北京纽英仑公司，HNB、甜菜碱购买自Sigma公司，引物由上海生工合成。(5)结论本发明方法操作简单，方便快捷，且显色结果清晰。本发明不需要特别设备和仪器，适合家庭和现场使用，并且该方法具有广泛的适用性。最后应当说明的是，以上实施例仅用于说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明做了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解， 可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。本发明提供了一种家用冬虫夏草鉴定试剂盒，所述的家用冬虫夏草鉴定试剂盒包括快速简便的处理真菌，得到足够可以用于基因扩增的真菌基因。本发明的家用冬虫夏草鉴定试剂盒以冬虫夏草菌ITS基因为靶基因、基于环介导恒温扩增技术设计了三对引物。本发明的家用冬虫夏草试剂盒鉴定结果直观、操作简单、特异性好，不需要特别的设备和仪器，适合家用或者现场使用。