专利名称：产锰依赖过氧化物酶的脱色酵母菌及其应用的制作方法
本发明的目的在于为了解决上述问题从自然环境中取样并筛选到两株能够对偶氮活性染料活性黑(Reactive Black 5)以及其它与此染料结构类似的染料或化合物进行降解或脱色的产锰依赖过氧化物酶的脱色酵母菌及其应用。经鉴定该两株酵母菌为多型德巴利酵母Debaryomyces polymorphus和热带假丝酵母Candidatropicalis。该两株酵母菌在接种量为0.2g湿细胞/50ml培养液或更大接种量的情况下对含活性黑5浓度为1000mg/L以下的培养液可以有效脱色，对活性黑5浓度为200mg/L以下的培养液16小时内达到100％脱色。这两株酵母菌均可在培养液pH为3到10的范围内发挥有效脱色作用。本发明的技术方案如下本发明提供的产锰依赖过氧化物酶的脱色酵母菌，包括于2002年10月11日保藏于《中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心》的多型德巴利酵母Debaryomyces polymorphus，其保藏号分别为CGMCC NO.0813；所述的多型德巴利酵母的18SrDNA序列发表在Genebank，序列号为AF545629，其18SrDNA序列见附图1；所述的多型德巴利酵母的26SrDNA序列发表在Genebank上，序列号为AF545634，其26SrDNA序列见附图2；所述的多型德巴利酵母生物学特征为在马铃薯葡萄糖培养基上为乳白色圆形菌落，表面稍干燥，菌落厚，易挑起，有酒香味，呈现典型的酵母菌菌落。本发明提供的产锰依赖过氧化物酶的脱色酵母菌，还包括于2002年10月11日保藏于《中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心》的热带假丝酵母Candida tropicalis，其保藏号分别为CGMCC NO.0814；所述的热带假丝酵母的18SrDNA序列发表在Genebank上，序列号AF545630，其18SrDNA序列见附图3；所述的热带假丝酵母的26SrDNA序列发表在Genebank上，序列号AF545635，其26SrDNA序列见附图4；所述的热带假丝酵母生物学特征为在马铃薯葡萄糖培养基上为乳白色圆形菌落，表面稍干燥，菌落厚，易挑起，有酒香味，呈现典型的酵母菌菌落。本发明提供的产锰依赖过氧化物酶的脱色酵母菌的用途，其特征在于，所述的多型德巴利酵母所产生的锰依赖过氧化物酶用于纺织废水、印染废水、染料生产废水以及与染料使用相关的工业废水的脱色；用于纸张的漂白以及与染料结构类似的化合物的降解；所述的热带假丝酵母所产生的锰依赖过氧化物酶用于纺织废水、印染废水、染料生产废水以及与染料使用相关的工业废水的脱色；用于纸张的漂白以及与染料结构类似的化合物的降解。本发明提供的两株酵母菌的筛选过程为从城市污水处理厂和印染废水处理厂取得活性污泥样品，按照下述流程进行筛选 所述的富集培养基组分为葡萄糖5g，KH2PO41g，(NH4)2SO41g，MgSO4·7H2O 500mg，酵母粉200mg，自来水1000ml，pH5.0-6.0。；所述的染料培养基1组分为葡萄糖5g，KH2PO41g，(NH4)2SO41g，MgSO4·7H2O 500mg，酵母粉200mg，自来水1000ml，pH5.0-6.0，灭菌后加入10g/L的活性黑5，使其终浓度分别为30mg/L；所述的染料培养基2组分为葡萄糖5g，KH2PO41g，(NH4)2SO41g，MgSO4·7H2O 500mg，酵母粉200mg，自来水1000ml，pH5.0-6.0，灭菌后加入10g/L的活性黑5，使其终浓度分别为60mg/L；所述的染料培养基3组分为葡萄糖5g，KH2PO41g，(NH4)2SO41g，MgSO4·7H2O 500mg，酵母粉200mg，自来水1000ml，pH5.0-6.0，灭菌后加入10g/L的活性黑5，使其终浓度分别为100mg/L；所述的选择性培养基组分为葡萄糖5g，KH2PO41g，(NH4)2SO41g，MgSO4·7H2O 500mg，酵母粉200mg，自来水1000ml，pH5.0-6.0，灭菌后加入10g/L的活性黑5，使其终浓度分别为100mg/L，加入链霉素使其终浓度为50U/L；其具体筛选步骤如下取1克污泥样品放入盛有玻璃珠和100mL无菌水的三角瓶中充分混匀，取该混合液10mL接入100mL灭过菌的富基培养基中，并在28℃摇床中140转培养5天。取该培养液10mL接种于含30mg/L活性黑5的染料培养基中同样条件下培养3天，从完全脱色的三角瓶中取10mL培养液接种于含60mg/L活性黑5的染料培养基中同样条件下培养3天，并将完全脱色的培养液以同样的方法转接于100mg/L的染料培养基中。将在100mg/L染料存在下能完全脱色的培养液进行梯度稀释后，取0.2mL不同稀释度的培养物涂布于选择性染料培养基平板上在28℃培养3天。挑取有明显脱色圈的菌落并在染料培养基平板上纯化三次。将挑取的脱色菌株接种于含100mg/L活性黑5的液体培养基中在28℃，140转培养，每隔6小时取样测定脱色率，挑取在液体培养基中能完全脱色并且菌体不吸附染料的菌株即为本专利所得到的菌株，并对其进行鉴定和保藏。本发明得到的菌株经鉴定为多型德巴利酵母Debaryomyces polymorphus和热带假丝酵母Candida tropicalis，并分别保藏于《中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心》，其保藏号分别为CGMCC NO.0813和保藏号分别为CGMCCNO.0814。本发明提供的产锰依赖过氧化物酶的脱色酵母菌的用途为该产锰依赖过氧化物酶的脱色酵母菌应用酶所产生的锰依赖过氧化物酶用于纺织废水、印染废水、染料生产废水以及与染料使用相关的工业废水的脱色；用于纸张的漂白以及与染料结构类似的化合物的降解。本发明提供的产锰依赖过氧化物酶的脱色酵母菌，可解决已有技术中存在的问题，在在接种量为0.2g湿细胞/50ml培养液或更大接种量的情况下对含活性黑5浓度为1000mg/L以下的培养液可以有效脱色，对活性黑5浓度为200mg/L以下的培养液16小时内达到100％脱色；均可在培养液pH为3到10的范围内发挥有效脱色作用。


附图1为多型德巴利酵母Debaryomyces polymorphus的18SrDNA序列表；附图2为多型德巴利酵母Debaryomyces polymorphus的26SrDNA序列表；附图3为热带假丝酵母Candida tropicalis的18SrDNA序列表；附图4为热带假丝酵母Candida tropicalis的26SrDNA序列表；附图5为多型德巴利酵母在好氧的条件下对不同浓度的活性黑5的脱色其中◇—100mgL-1■—200mgL-1▲—300mgL-1；○—400mgL-1●—1000mgL-1附图6为热带假丝酵母在好氧的条件下对不同浓度的活性黑5的脱色其中◆—100mgL-1■—200mgL-1▲—300mgL-1；○—400mgL-1△—1000mgL-1附图7为多型德巴利酵母在活性黑5存在和不存在两种情况MnP活性比较；附图8为热带假丝酵母在活性黑5存在和不存在两种情况MnP活性比较；附图9为多型德巴利酵母对不同染料的脱色；附图10为热带假丝酵母对不同染料的脱色；
实施例1本发明的两株酵母菌株对含100～1000mg/L活性黑5的染料培养液在24小时之内可有效脱色，对300mg/L以下的染料培养液可达100％脱色。(见附图5和6)。
该两株酵母菌均可在活性黑5存在的条件下产生锰依赖过氧化物酶(MnP)，该酶在培养液中的活性可达2000U/L或更高；见附图7和图8。
实施例2本发明的两株酵母菌对具有偶氮键和苯环结构的其他偶氮活性染料以及对不具偶氮键的蒽醌染料同样具有明显的脱色作用。Debaryomyces polymorphus和Candida tropicalis在好氧培养的条件下对浓度为100mg/L如下几种染料蒽醌染料活性蓝RB19，偶氮染料活性红(Reactive Red)M-3BE，偶氮染料活性黄(ReactiveYellow)M-3RE，偶氮染料活性艳红(Reactive Brilliant Red)K-2BF，偶氮染料Procion Scharlach H-E3G，偶氮染料Procion MarineH-EXL在24和48小时内的脱色率分别如图9和10。然而本发明对化合物的脱色和降解不仅限于此。
SEQUENCE LISTING<110>中国科学院生态环境研究中心<120>产锰依赖过氧化物酶的脱色酵母菌及其应用<130>PI023972<160>4<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>519<212>DNA<213>Debaryomyces polymorphus<400>1ccatgcatgt ctaagtataa gcaatttata cagtgaaact gcgaatggct cattaaatca 60gttatcgttt atttgatagt acctttacta cttggataac cgtggtaatt ctagagctaa120tacatgctaa aaatcccgac tgtttggaag ggatgtattt attagataaa aaatcaatgc180ttttcggagc tctttgatga ttcataataa cttttcgaat cgcatggcct tgtgctggcg240atggttcatt caaatttctg ccctatcaac tttcgatggt aggatagtgg cctaccatgg300tttcaacggg taacggggaa taagggttcg attccggaga gggagcctga gaaacggcta360ccacatccaa ggaaggcagc aggcgcgcaa attacccaat cccaatacgg ggaggtagtg420acaataaata acgatacagg gccctttcgg gtcttgtaat tggaatgagt acaatgtaaa480taccttaacg aggaacaatt ggagggcaag tctggtgcc 519<210>2<211>557<212>DNA<213>Debaryomyces polymorphus<400>2aacggcgagt gaagcggcaa aagctcaaat ttgaaatctg gcaccttcgg tgtccgagtt 60gtaatttgaa gaaggtaact ttggagttgg ctcttgtcta tgttccttgg aacaggacgt120cacagagggt gagaatcccg tgcgatgaga tgcccaactc tatgtaaagt gctttcgaag180
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本发明涉及的产锰依赖过氧化物酶的脱色酵母菌，包括从自然环境中分离选育得到，并于2002年10月11日保藏于《中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心》的保藏号分别为CGMCC NO.0813和CGMCC NO.0814的多型德巴利酵母Debaryomyces polymorphus酵母菌和热带假丝酵母Candida tropicalis酵母菌；其生物学特征为在马铃薯葡萄糖培养基上为乳白色圆形菌落，表面稍干燥，菌落厚，易挑起，有酒香味，呈现典型的酵母菌菌落；所产生的锰依赖过氧化物酶用于纺织废水、印染废水、染料生产废水以及与染料使用相关的工业废水的脱色；用于纸张的漂白以及与染料结构类似的化合物的降解。