专利名称：放线菌制剂及其在防治植物寄生性线虫方面的应用的制作方法农用杀虫制剂要求具有较低毒性及低残留性质。农用抗生素低毒低残留，能够抑制病原微生物的生长和繁殖，或者能改变病原菌的形态而达到保护作物的效果。放线菌的突出特性就是能产生大量的、种类繁多的抗生素，是产抗生素最多的一类微生物。抗生素的生物学作用广泛，多数抗生素都能不同程度的表现出抗菌活性，少数种类还具有抗病毒、抗其它病原体、抗肿瘤活性。如申请号为200610122277. 7的中国发明专利，公开了一种土壤放线菌发酵液的提取物及其制备方法和应用。提取物的制备方法如下将高氏一号培养基制成试管斜面或茄子瓶斜面，接菌株孢子涂斜面，28°C培养7 10天；将斜面中成熟菌株制成孢子悬浮液，接入液体发酵培养基中进行液体发酵培养，接种量为8 16%，通气量为 1 0. 6 1. 2 V/Vmin,发酵温度为沈 32°C，发酵培养周期为72 108小时，得到发酵液； 将发酵液离心分离，弃去上清液，保留菌丝，用体积百分比为60 80%丙酮浸泡菌丝8 M 小时，离心除去菌丝体，保留滤液；用大孔吸附树脂对滤液进行吸附，用丙酮洗脱，对洗脱液进行减压浓缩，得到棕色油状物，即为土壤放线菌发酵液的提取物；所述菌株为土壤放线菌 ⑶PPRA 3704，在中国典型培养物保藏中心保藏，菌种保藏号为CCTCC No: M 2060670。小菜蛾和中华鳗对该提取物较敏感，较低浓度已具有杀灭作用，可望制成生物农药，具有较高的经济和社会效益。然而，据申请人了解，关于放线菌制剂防治植物寄生性线虫方面报道很少，而有明显防治效果的更是鲜见。
本发明的目的是为解决上述技术问题，提供一种能够杀灭或抑制植物寄生性线虫的放线菌制剂。本发明所述的放线菌，拉丁学名为Micromonospora humi。本发明的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的放线菌制剂，它是由以下方法制备的①对土壤样本进行放线菌的分离操作，获得放线菌菌种；②对所述放线菌菌种进行发酵培养，具体为将所述菌种接种至培养基，在20 30°C温度下，200rpm震荡培养5 10d，得发酵液；③发酵完成后，加入多于发酵液体积的甲醇，然后搅拌、离心分离、取上清液，然后对上清液进行蒸发浓缩以除去所述甲醇。作为上述技术方案的优选，所述土壤是红树林中的土壤。该土壤的选取方法如下，在离目标树种2 m内的范围内，选择表土下5 20厘米深度的土壤。作为上述技术方案的优选，所述培养基为，以重量百分比计，可溶性淀粉1 5%，葡萄糖0. 5 3%，酵母膏0. 1 0. 2%,酪蛋白0. 15 0. 4%,牛肉膏0. 1 0. 2%,碳酸钙 0. 1 0. 3%，余下为水。作为上述技术方案的优选，所述甲醇的加入量为所述发酵液体积的小于等于2 倍，对上清液进行蒸发浓缩时，将上清液浓缩至所述发酵液体积的1/4 1/3。加入甲醇的目的，一是把发酵液中的某些成分溶解出来，包括存在于放线菌菌体内的能够杀灭或者抑制植物寄生性线虫的物质，二是使发酵液各成分更稳定；在随后的蒸发过程会把甲醇除去，然后获得较为纯净的制剂。作为上述技术方案的优选，在所述发酵液中加入甲醇后，用磁力搅拌器搅拌过夜。作为上述技术方案的优选，在离心分离时，转速3500 4500rpm，时间8 12min。作为上述技术方案的优选，所述甲醇的加入量为所述发酵液体积的小于等于2 倍，然后用磁力搅拌器搅拌过夜，然后离心分离，得上清液，然后对上清液进行蒸发浓缩的操作以除去甲醇，浓缩至所述发酵液体积的1/4 1/3。本发明的另一个目的是提供用拉丁学名为Micromonospora humi的放线菌制成的制剂在防治植物寄生性线虫方面的应用。本发明的再一个目的是提供上述任一放线菌制剂的在防治植物寄生性线虫方面的应用。本发明的还有一个目的是提供一种由上述任一放线菌制剂为活性成分的杀线虫制剂。本发明具有以下有益效果本发明提供的一种放线菌制剂在处理植物寄生性线虫时具有有效的杀灭或抑制作用。于2008年6月，在海南省文昌清澜港红树林保护区采集红树林植物的土壤。2培养基麦芽汁一酵母膏琼脂(YE)、淀粉酪素琼脂(SC)、葡萄糖天冬氨酸琼脂(GA ) 3采样方法
土壤样品是在离目的树种1 2 m的范围内，选择表土下5 20厘米深度的土壤，将土壤装入灭菌的纸带里，编号注明采土时间，地点，地表植被等。样品采集后放入无菌塑料封口袋内，冷藏，迅速运回实验室并立即进行样品处理。4 步骤
1)称取2g样品到含有1. 5%苯酚或0. 05% SDS、6%酵母膏的20mL无菌海水中，30°C、 200r/min 下振荡 30min ；
2)然后取1 ml按梯度稀释法稀释至10_3、10_4和10_5，各取0. 2 ml分别涂平板，平板培养基分别为麦芽汁一酵母膏琼脂(YE)、淀粉酪素琼脂(SC)、葡萄糖天冬氨酸琼脂(GA )；
3)培养7 10d，挑菌；
4)待平板长菌落出后，菌株用光电显微镜(型号XS-212-202)，在油镜下观察菌落形态；
5)挑菌落待平板长出菌落后，鉴定微生物类群，并根据镜检结果，判断是否已分离到了纯菌种；对于已经提纯的菌种，转至斜面培养基，用牛皮纸包好，置-20°C冰箱中保存。(二)发酵培养
对所述放线菌菌种进行发酵培养，具体为将所述菌种接种至培养基，在20°C温度下， 200rpm震荡培养5d，得发酵液；发酵完成后在发酵液中加入1倍体积的甲醇，然后用磁力搅拌器搅拌过夜，然后3500rpm，8min离心分离，取上清液，然后用旋转蒸发仪对上清液进行蒸发浓缩以除去所述甲醇，浓缩至所述发酵液体积的1/4，制得放线菌制剂。所述培养基配方为以重量百分比计，可溶性淀粉1%，葡萄糖0. 5%，酵母膏0. 1%， 酪蛋白0. 15%，牛肉膏0. 1%，碳酸钙0. 1%，余下为水，pH 7.0 9.0。实施例二
(一)菌种的制备
采用实施例一所得的菌种
(二)发酵培养
对所述放线菌菌种进行发酵培养，具体为将所述菌种接种至培养基，在22°C温度下， 200rpm震荡培养6d，得发酵液；发酵完成后在发酵液中加入1倍体积的甲醇，然后用磁力搅拌器搅拌过夜，然后4000rpm，9min离心分离，取上清液，然后用旋转蒸发仪对上清液进行蒸发浓缩以除去所述甲醇，浓缩至所述发酵液体积的1/4，制得放线菌制剂。所述培养基配方为以重量百分比计，可溶性淀粉洲，葡萄糖1%，酵母膏0. 1%，酪蛋白0. 2%，牛肉膏0. 1%，碳酸钙0. 1%，余下为水，pH 7. 0 9. 0。实施例三
(一)菌种的制备
采用实施例一所得的菌种
(二)发酵培养
对所述放线菌菌种进行发酵培养，具体为将所述菌种接种至培养基，在温度下， 200rpm震荡培养7d,得发酵液；发酵完成后在发酵液中加入1. 5倍体积的甲醇，然后用磁力搅拌器搅拌过夜，然后4000rpm，IOmin离心分离，取上清液，然后用旋转蒸发仪对上清液进行蒸发浓缩以除去所述甲醇，浓缩至所述发酵液体积的1/4，制得放线菌制剂。所述培养基配方为以重量百分比计，可溶性淀粉3%，葡萄糖洲，酵母膏0. 15%，酪蛋白0. 3%，牛肉膏0. 1%，碳酸钙0. 2%，余下为水，pH 7. 0 9. 0。实施例四
(一)菌种的制备
采用实施例一所得的菌种
(二)发酵培养
对所述放线菌菌种进行发酵培养，具体为将所述菌种接种至培养基，在26°C温度下，200rpm震荡培养8d，得发酵液；发酵完成后在发酵液中加入2倍体积的甲醇，然后用磁力搅拌器搅拌过夜，然后4000rpm，IOmin离心分离，取上清液，然后用旋转蒸发仪对上清液进行蒸发浓缩以除去所述甲醇，浓缩至所述发酵液体积的1/3，制得放线菌制剂。所述培养基配方为以重量百分比计，可溶性淀粉4%，葡萄糖2%，酵母膏0. 2%，酪蛋白0. 3%，牛肉膏0. 2%，碳酸钙0. 2%，余下为水，pH 7. 0 9. 0。实施例五
(一)菌种的制备
采用实施例一所得的菌种
(二)发酵培养
对所述放线菌菌种进行发酵培养，具体为将所述菌种接种至培养基，在温度下， 200rpm震荡培养9d，得发酵液；发酵完成后在发酵液中加入2倍体积的甲醇，然后用磁力搅拌器搅拌过夜，然后4000rpm，Ilmin离心分离，取上清液，然后用旋转蒸发仪对上清液进行蒸发浓缩以除去所述甲醇，浓缩至所述发酵液体积的1/3，制得放线菌制剂。所述培养基配方为以重量百分比计，可溶性淀粉4%，葡萄糖3%，酵母膏0. 2%，酪蛋白0. 3%，牛肉膏0. 2%，碳酸钙0. 2%，余下为水，pH 7. 0 9. 0。实施例六
(一)菌种的制备
采用实施例一所得的菌种
(二)发酵培养
对所述放线菌菌种进行发酵培养，具体为将所述菌种接种至培养基，在30°C温度下， 200rpm震荡培养10d，得发酵液；发酵完成后在发酵液中加入2倍体积的甲醇，然后用磁力搅拌器搅拌过夜，然后4500rpm，12min离心分离，取上清液，然后用旋转蒸发仪对上清液进行蒸发浓缩以除去所述甲醇，浓缩至所述发酵液体积的1/3，制得放线菌制剂。所述培养基配方为以重量百分比计，可溶性淀粉5%，葡萄糖3%，酵母膏0. 2%，酪蛋白0. 4%，牛肉膏0. 2%，碳酸钙0. 3%，余下为水，pH 7. 0 9. 0。实施例二放线菌制剂杀根结线虫活性测定 1.方法
①将土和沙按一定比例均与搅拌，装入盆中；
②移栽10天的黄瓜苗一株；
③打入300ul的待试药品；
④处理一天；
⑤打入3000个根结线虫虫卵；
⑥40天后观察黄瓜苗根部情况。2.根结线虫发病等级判定标准 数字0 10个；
M级10 20个； 3.实验结果


本发明涉及放线菌制剂及其在防治植物寄生性线虫方面的应用。属于生物农药技术领域。本发明公开了用拉丁学名为Micromonosporahumi的放线菌制成的制剂在防治植物寄生性线虫方面的应用，公开了一种放线菌制剂，公开了所述的放线菌制剂在防治植物寄生性线虫方面的应用，也公开了由所述的放线菌制剂为活性成分制备的杀线虫剂。本发明提供的一种放线菌制剂在处理植物寄生性线虫时具有有效的杀灭或抑制作用。