专利名称：一种sod修饰生产工艺的制作方法自由基学说是在生命科学领域中，越来越被人们广泛接受的关于生命体衰老理论的学说，该学说认为自由基是造成生命体老化及诸多疾病的重要原因。据估计80 90%的老化性、退行性疾病都与自由基有关，其中包括癌症、老年痴呆症、帕金森氏症、皮肤色素沉积、白内障、心脏病等，所以清除自由基对维持健康体魄和保持年轻体态至关重要。 而SOD即超氧化物歧化酶是专一的自由基清除剂。SOD是一种广泛存在于动物、植物和微生物中，具有催化超氧阴离子自由基发生歧化反应的生物酶，其催化的歧化反应式如下 02—+ 02—+2H+ — H202+02 SOD能清除人体细胞内的超氧阴离子自由基(生物垃圾)，因而被誉为人体的生物 垃圾清道夫，而自由基过多则导致80多种疾病，因此人体适时适量补充S0D，就能预防甚至 治疗因自由基过多而导致的多种疾病，具有抗氧化、抗辐射、抗癌变、消炎等功能，用于治疗 或辅助治疗心脑血管疾病、自身免疫性疾病、血液再灌注损伤、慢性炎症和癌症等，而且可 用于日常的抗衰老保健，防治老年性疾病和慢性病等。 迄今为止，SOD的修饰技术有多种，如袁勤生用13 _环状糊精修饰SOD (药物生物 技术[J] ， 1996 ;3 (2) :87-90)和尹亮用PEG修饰SOD (生物技术[J] ， 2003 :8) ， P -环状糊 精和PEG等大分子化合物做修饰剂，使修饰SOD的分子量大幅度增加，达到300 400kd，静 脉注射时易引起血管堵塞，而且修饰时SOD酶活损失大，要失去40%左右的酶活。 也有学者用月桂酸等小分子修饰剂来修饰SOD的，如邹国林的《月桂酸修饰SOD 的制备及其稳定性研究》(武汉大学学报(自然科学版)[J]，199S ;44(4) :49(81))和阎家 麒的《月桂酸修饰SOD的制备及性质研究》(生物化学与生物物理进展[J] ， 1994 ;21 (2): 154-157)，还有邹国林的《硬脂酸修饰SOD的制备及其性质》(生物化学杂志[J] ，1996; 12(1) :64-67)等。阎家麒教授的修饰方法，需要把月桂酸活化，而活化是一个复杂的化学 反应过程，反应不完全容易导致氯化亚砜、吡啶等化学试剂的残留，影响产品的安全性。邹 国林教授的修饰方法，是用SOD干粉做原料，增加了生产成本和损失了酶活；并且在修饰工 艺中，先把月桂酰氯一次性地加到SOD酶液中，会导致SOD酶液的pH值急剧下降和月桂酰 氯局部浓度过高，造成SOD的活性损失大，在20%左右，反应过程不易控制而不适用于规模 化生产。 另外，目前的修饰方法中修饰后用有毒害的丙酮来沉淀收集SOD，影响了产品的安 全性，也降低了SOD的活性。

本发明根据现有技术中的不足公开了一种SOD修饰生产工艺，本发明通过以下技 术方案实现。 SOD修饰生产工艺，包括以下步骤 [OO11] (1)由动物血制备SOD酶液；
(2)步骤(1) SOD酶液修饰反应； [OO13] (3)步骤(2) SOD酶液制备SOD冻干粉。 所述步骤(l)SOD酶液制备是将动物血块经乳化、溶血、连续离心、超滤浓縮、热 变性、柱色谱生产工序，收集得到蓝绿色SOD酶液，根据体积、活性和A28。值推算月桂酰氯的 添加量。上述乳化、溶血、连续离心、超滤浓縮、热变性、柱色谱生产工序是常规生产工艺，见 周全法等的《动物血块中CuZn-SOD的提取研究》(再生资源研究[J]，2001(2) :34-36)。所 述推算月桂酰氯的添加量，是根据Lowry法检测SOD酶液的蛋白浓度，得到回归方程，不同 的检测设备、检测条件，得到的回归方程有一定的差别，由回归方程求得蛋白含量，再乘以 经验系数1. 4，就得到月桂酰氯的添加量。
所述步骤(2)是在步骤(1)制备的SOD酶液中进行； 步骤(2)的具体方法是SOD酶液倒入带夹套的反应釜中，搅拌，滴加2M碱溶液调 节pH值至9. 0 ;加热至36 45t:，并保持恒温；然后连续缓慢滴加一定量的月桂酰氯，同时 滴加2M碱溶液，使SOD酶液的pH值始终维持在9. 0左右；反应1小时，其中月桂酰氯在前 20分钟左右添加完毕；碱溶液的连续缓慢滴加贯穿整个反应过程以维持pH稳定；修饰反应 完毕后，迅速冷却至4°C ，离心，得到修饰的SOD酶液。 所述碱溶液可以是氢氧化钾溶液或氢氧化钠溶液以及其它碱性溶液其中之一，也 可以是它们中两种或两种以上的混合液。优选2M的氢氧化钠溶液。 所述步骤(3)S0D酶液制备S0D冻干粉是将步骤(2)得到的修饰反应后的SOD酶液 经滤菌膜灭菌、超滤浓縮、冷冻干燥，得到修饰SOD冻干粉。上述经滤菌膜灭菌、超滤浓縮、 冷冻干燥是常规生产工艺，见袁勤生等的《猪血超氧化物歧化酶的纯化及其性质研究》(生 物化学与生物物理学报[J]，1987 ;19(1) :22-25)。 本发明的原理月桂酰氯在弱碱性条件下，作用于SOD分子表面的非活性部位的 赖氨酸，并与赖氨酸的e -NH2共价结合，形成一种酰化SOD，增强了 SOD的刚性构象，酰化所 产生的空间障碍和静电斥力，阻挡了蛋白水解酶和其他抑制剂对SOD的进攻，使稳定SOD分 子构象的次级键得到保护，SOD的稳定性提高。 本发明是以SOD提取纯化生产中下色谱柱的SOD酶液为修饰对象，量取SOD酶液 的体积和A28。值，测得SOD酶液的活性，就可推算出要添加的月桂酰氯的量，这样，使SOD的 修饰工艺与提取纯化工艺在同一条生产线上实现，减少了生产环节，节约了 20%左右的生 产成本。其次，在修饰工艺中，直接用高纯度月桂酰氯做修饰剂，更重要的是，月桂酰氯是缓 慢逐渐加入反应，加入约需要20分钟左右的时间，加月桂酰氯的同时，添加2M的碱溶液液 调节pH值，使酶液的pH值始终稳定在9. 0左右，这样，SOD酶液的pH值波动不大，反应过 程容易控制而适于规模化生产；并且SOD活性损失少，整个修饰工艺，SOD的活性损失在5% 以内，不会造成月桂酰氯一次性加入后，SOD酶液的pH值急剧下降导致SOD活性损失大的 现象；在上述修饰反应完毕后，SOD酶液经冷却、离心、灭菌、超滤浓縮、冷冻干燥，生产出修饰SOD冻干粉，不添加丙酮等有害物质，保证了产品的安全性，而且SOD活性损失少。
综上所述，本发明与现有技术比较具有以下有益性SOD的修饰工艺与提取纯化 工艺在同一条生产线上实现，减少了生产环节，节约了 20X左右的生产成本，与S0D干粉溶 解制备原液方法比较，较好地保护了 SOD的活性；月桂酰氯和碱溶液的加入方法改变了修 饰化学反应的环境和过程，使SOD酶液的pH值波动不大，反应过程容易控制而适于规模化 生产，并且SOD活性损失少；在全部生产过程中没有传统工艺的丙酮加入工艺，保证了产品 的安全性，而且SOD活性损失少。

下面结合实施例对本发明进一步说明。
实施例1 1、0. 5吨猪血块经乳化、溶血、连续离心、超滤浓縮、热变性、柱色谱等生产工序，收 集得到活性为10. 33万U/ml、 A28。值为14. 6、体积为2. 65L的蓝绿色SOD酶液，推算出月桂 酰氯的添加量为46ml 。 2、S0D酶液倒入带夹套的10L玻璃反应釜中，开动搅拌装置，滴加2M的NaOH液调 节pH值至9.0。然后夹套热水循环加热至4(TC，并保持恒温；然后连续缓慢滴加46ml月桂 酰氯，同时滴加2M NaOH液，使SOD酶液的pH值始终维持在9. 0左右，反应1小时，其中月 桂酰氯在前20分钟左右添加完毕；而2M NaOH液的添加贯穿整个反应过程，但添加量逐渐 减少。修饰反应完毕后，SOD酶液用热交换器迅速冷却至4°C ，离心，得到修饰的SOD酶液。
3、修饰的SOD酶液经滤菌膜灭菌、超滤浓縮、冷冻干燥，生产出20. 4克修饰SOD冻 干粉，其比活性为1.21X104U/mg*蛋白，蛋白含量为98.7%。
实施例2 1、2. 0吨猪血块经乳化、溶血、连续离心、超滤浓縮、热变性、柱色谱等生产工序，收 集得到活性为15. 27万U/ml、A28。值为30. 8、体积为6. 1L的蓝绿色SOD酶液，推算出月桂酰 氯的添加量为112ml。 2、 SOD酶液倒入带夹套的10L玻璃反应釜中，开动搅拌装置，滴加2M的KOH液调 节pH值至9. 0。然后夹套热水循环加热至42°C ，并保持恒温；然后连续缓慢滴加112ml月 桂酰氯，同时滴加2M KOH液，使SOD酶液的pH值始终维持在9. 0左右，反应1小时，其中月 桂酰氯在前20分钟左右添加完毕；而2M KOH液的添加贯穿整个反应过程，但添加量逐渐减 少。修饰反应完毕后，用热交换器迅速冷却至4°C ，离心，得到修饰的SOD酶液。
3、修饰的SOD酶液经滤菌膜灭菌、超滤浓縮、冷冻干燥，生产出90. 4克修饰SOD冻 干粉，其比活性为9. 72X 103U/mg 蛋白，蛋白含量为96. 6%。
实施例3 1、2. 5吨牛血块经乳化、溶血、连续离心、超滤浓縮、热变性、柱色谱等生产工序，收 集得到活性为16. 4万U/ml、 A28。值为42. 3、体积为7. 8L的蓝绿色SOD酶液，推算出月桂酰 氯的添加量为147ml 。 2、S0D酶液倒入带夹套的10L玻璃反应釜中，开动搅拌装置，滴加2M的NaOH液调 节pH值至9. 0。然后夹套热水循环加热至45°C ，并保持恒温；然后连续缓慢滴加147ml月 桂酰氯，同时滴加2M NaOH液，使SOD酶液的pH值始终维持在9. 0左右，反应1小时，其中
5月桂酰氯在前20分钟左右添加完毕；而2M NaOH液的添加贯穿整个反应过程，但添加量逐 渐减少。修饰反应完毕后，用热交换器迅速冷却至4°C ，离心，得到修饰的SOD酶液。
3、修饰的SOD酶液经滤菌膜灭菌、超滤浓縮、冷冻干燥，生产出110. 8克修饰SOD 冻干粉，其比活性为1.08X 104U/mg*蛋白，蛋白含量为97.8%。 上述实施例是对本发明的具体说明，并不构成对本发明的限制，与本发明权利要 求书相当含义和范围内的任何改变都应在本发明的保护范围内。


本发明公开了一种SOD修饰生产工艺。包括由动物血制备SOD酶液；SOD酶液修饰反应；SOD酶液制备SOD冻干粉3步骤。本发明SOD的修饰工艺与提取纯化工艺在同一条生产线上实现，减少了生产环节，节约了20％左右的生产成本，与SOD干粉溶解制备原液方法比较，较好地保护了SOD的活性；月桂酰氯和碱溶液的加入方法改变了修饰化学反应的环境和过程，使SOD酶液的pH值波动不大，反应过程容易控制而适于规模化生产，SOD活性损失少；在全部生产过程中没有传统工艺的丙酮加入工艺，保证了产品的安全性，而且SOD活性损失少。