专利名称：制备人干扰素β1a的细胞的培养方法和培养基及其应用的制作方法人干扰素β (IFN-β)是具有抗病毒、抗肿瘤、免疫调节作用的重要细胞因子，主要由成纤维细胞和某些上皮细胞产生，普通的干扰素诱生剂，例如病毒、双链RNA和一些微生物均能够诱导IFN-β的产生。自然IFN-β是一种糖蛋白(糖分约占20%)，相对分子质量约20000，由166个氨基酸组成，有21个氨基酸组成的信号肽，在S-M之间切开。在分子的第17位、31位、141位为Cys，在31位和141位之间形成的二硫键对其生物学活性的发挥是必需的。hIFN-β基因长777bp，位于染色体9p22，与IFN-α基因簇邻近。人白细胞干扰素与成纤维细胞干扰素之间在核苷酸水平上有45%的同源性，在氨基酸水平上有四％ 的同源性。IFN-a与IFN-β基因均无内含子。IFN-α与IFN-β结合于同一受体，但后者与受体的亲和力大于前者。美国FDA已于1993批准IFN-β Ib (大肠杆菌表达)和1996年批准IFN-β la (CH0 细胞表达)用于治疗多发性硬化症(MS)。目前，IFN-β是能够控制MS反复发作的唯一药物。据估计，我国MS患者至少有数十万人，迄今尚无特效药。CHO细胞与大肠杆菌表达的 IFN-β Ia相比，具有较高的抗病毒比活性，较小的副作用以及较长的半衰期。中国仓鼠卵巢细胞-CHO细胞(Chinese hamster ovary cell)目前被广泛用于生产各种基因工程蛋白产品。适合用于CHO细胞培养的培养基，根据它的来源及成分的明确程度来划分，其发展大致可分为三个阶段即天然培养基阶段(直接采用某些组织凝块、生物性液体和组织提取液等作为细胞的培养基)，合成培养基阶段(如MEM，DMEM，RPMI1640, F12等)和无血清培养基阶段。合成培养基通常需在其中添加一些诸如血清〈常用的如小牛血清、胎牛血清等，一般在5-15% )等天然的体液性补充物才能较长时间地维持细胞生长。血清的主要作用在于向细胞提供激素(生化因子)、转移蛋白和其它营养物质等。但即使采用低血清培养，还是不能忽视血清带来的问题(如在培养过程中贴壁，不适用于大规模培养)。无血清培养基的优势很大程度上体现在避免了血清的缺点，此外它还具有血清培养难以比拟的优点，如保存和应用方便；使用该种培养基制备的产品易于纯化，提高回收率；成分明确，有利于研究细胞的生理调节机制；可根据不同细胞株设计和优化出适合其高密度生长或高水平目的产物表达的培养基等。因此，近年来许多科研工作者致力于开发无血清培养基。目前国内干扰素β Ia研究较少，产干扰素IFN-β la(CH0细胞表达)的培养基配方效率较低，亟需开发一种适合工业化生产，成本低，产量高的产重组人干扰素β Ia的细胞培养基和培养方法
本发明的目的是提供一种产人干扰素β Ia的细胞的培养方法和细胞培养基及培养基的应用，从而得到一种适合工业化生产，活性高，产量高的产干扰素β Ia细胞培养方法。本发明的技术方案为提供一种制备人干扰素β Ia的细胞的培养基，其组分包括基础培养基和添加物，所述基础培养基的浓度为12-18g/L、所述基础培养基为CHO-S-SFM II培养基或SFM4CH0培养基，所述添加物为D-半乳糖0. 05-0. 45g/L、D-甘露糖0.3-0. 7g/L、N-乙酰氨基葡萄糖0. 10-0. 50g/L、D-葡萄糖1. 0-5. Og/L。优选的上述培养基中，所述添加物还包括正丁酸钠、磷酸二氢钾、氯化钠中的一种或几种。优选的上述培养基中，所述基础培养基为SFM培养基，所述SFM培养基为 CHO-S-SFM II培养基或SFM4CH0培养基。优选的上述培养基中，包括以下浓度的各组分基础培养基12_18g/L、D-半乳糖0. 05-0. 45g/L、D-甘露糖0. 3-0. 7g/L、N_ 乙酰氨基葡萄糖0. 10-0. 50g/L、D_ 葡萄糖1.0-5. Og/L、正丁酸钠0. 05-lmM、磷酸二氢钾0. 5-3. 5mM、氯化钠10_60mM。优选的上述培养基中，包括以下浓度的各组分基础培养基12_18g/L、D-半乳糖0. 05g/L、D-甘露糖0. 3g/L、N-乙酰氨基葡萄糖0. 3g/L、D-葡萄糖5g/L、正丁酸钠 0. 5mM、磷酸二氢钾0. 5mM、氯化钠20mM。本发明的另一个方案为提供一种制备人干扰素β Ia的细胞培养方法，包括以下步骤a、取携带有表达人干扰素β Ia表达基因质粒的细胞冻存管复苏，传代培养，转瓶培养；b、按0. 2X 106-2X 106Cells/ml接种量接入步骤a转瓶消化下来的细胞，设置起始条件37°C、pH6. 8-7. 8、溶氧大于20%、转速40rpm进行细胞罐培养，每天转速增加lOrpm，最终加至120rpm，采用含血清培养基培养5_10天，在灌流速度大于0. 2-0. 8L/h时，瞬间排空含血清培养基更换权利要求1至3所述的制备人干扰素β Ia的细胞培养基，调整培养温度为34-36°C，根据检测的葡萄糖浓度调整无血清培养基灌流速度，控制糖浓度在0. 3-2. Og/ L之间，无血清培养基灌流培养时间约在30-50天左右；C、灌流培养至灌流速度小于0. 05-0. 2L/h，连续检测3次葡萄糖浓度变化不大， 均维持在2. 0-3. Og/L之间某个数值恒定，检测细胞收集液生物学活性小于0. 5X IO5IU/ ml-0. 5X106IU/ml时，判断为细胞培养终点，结束培养。优选的上述方法包括以下步骤a、取携带有表达人干扰素β Ia表达基因质粒的中国仓鼠卵巢细胞冻存管复苏， 通过25cm2、75cm2、175cm2方瓶传代培养15天，传代5_7代，3L转瓶培养7_12天，获得种子细胞量 5. OX IO7-IX IO9Cells ；b、5L细胞罐培养按0. 2X 106-2X 106cells/ml接种量接入步骤a转瓶消化下来的细胞，设置起始条件37°C、pH6. 8-7. 8、溶氧大于20%、转速40rpm进行培养，以后每天转速增加IOrpm，最终加至120rpm。采用含含血清培养基培养5_10天，所述含血清培养基为含10%的新生牛血清，90%高糖DMEM培养基，灌流速度大于0. 2-0. 8L/h时，瞬间排空含血清培养基更换上述无血清培养基，调整培养温度为34-36°C，根据检测的葡萄糖浓度调整无血清培养基灌流速度，控制糖浓度在0. 3-2. Og/L之间，无血清培养基灌流培养时间约在 30-50天左右。C、灌流培养至灌流速度小于0. 05-0. 2L/h，连续检测3次葡萄糖浓度变化不大， 均维持在2. 0-3. Og/L之间某个数值恒定，检测细胞收集液生物学活性小于0. 5X IO5IU/ ml-0. 5X106IU/ml时，判断为细胞培养终点，结束培养。本发明的又一个方案为提供上述制备人干扰素β Ia的细胞培养基在含表达人干扰素β Ia表达基因质粒的细胞培养中的应用。本发明的有益效果为本发明无血清培养基及培养方法解决了重组人干扰素 β Ia细胞培养得率低，活性低的问题，在未作培养基成分优化前，仅用商业用(基础培养基)无血清培养基，干扰素活性仅在1 X 104IU/ml 1 X 105IU/ml之间，干扰素含量在0. 5g/ L左右。而本发明最终获得的细胞收集液干扰素β Ia生物学活性达IX 106IU/ml以上， ELISA法检测干扰素β Ia含量达0. 8g/L以上。图1 :D_半乳糖各浓度同水平3个活性值之和变化趋势图；图2 =D-甘露糖各浓度同水平3个活性值之和变化趋势图；图3 =N-乙酰氨基葡萄糖各浓度同水平3个活性值之和变化趋势图；图4 =D-葡萄糖各浓度同水平3个活性值之和变化趋势图；图5 =D-半乳糖各浓度同水平3个干扰素含量之和变化趋势图；图6 =D-甘露糖各浓度同水平3个干扰素含量之和变化趋势图；图7 =N-乙酰氨基葡萄糖各浓度同水平3个干扰素含量之和变化趋势图；图8 =D-葡萄糖各浓度同水平3个干扰素含量之和变化趋势图；图9 上罐培养过程中生长动力学曲线；图10 上罐培养过程中葡萄糖浓度及培养基流加曲线。

0.10-0. 50g/L、D-葡萄糖1. 0-5. Og/L、正丁酸钠:0. 05_lmM、磷酸二氢钾:0. 5-3. 5mM、氯化钠10-60mM ；本发明人干扰素β Ia的细胞培养基(无血清培养基)可为配方一CHO-S-SFM II 培养基12g/L、D-半乳糖0. 05g/L、D-甘露糖0. 3g/L、 N-乙酰氨基葡萄糖0. lg/L、D-葡萄糖1. Og/L。配方二=CHO-S-SFM II 培养基16g/L、D-半乳糖0. 3g/L、D-甘露糖0. 5g/L、 N-乙酰氨基葡萄糖0. 3g/L、D-葡萄糖3. Og/L。配方三CHO-S-SFMII 培养基18g/L、D-半乳糖0. 05g/L、D-甘露糖0. 5g/L、 N-乙酰氨基葡萄糖0. 3g/L、D-葡萄糖1. Og/L。配方四:SFM4CH0培养基15g/L、D-半乳糖0. 05g/L、D-甘露糖0. 3g/L、N-乙酰氨基葡萄糖0. 3g/L、D-葡萄糖5g/L、正丁酸钠0. 5mM、磷酸二氢钾0. 5mM、氯化钠 20mM。在我们未作培养基成分优化，仅用商业用无血清培养基，如CHO-S-SFM II培养基、 HYC SFM4CH0培养基，得到干扰素活性仅在1 X 104IU/ml 1 X 105IU/ml之间，干扰素含量在0. 5g/L左右。按配方一的培养基及本发明的人干扰素β Ia的细胞培养方法，配方一得到的细胞收集液干扰素β Ia生物学活性达4. 5Χ 105IU/ml最终获得的细胞收集液干扰素为 1.253g/L0按配方二的培养基及本发明的人干扰素β Ia的细胞培养方法，配方二得到的细胞收集液干扰素β Ia生物学活性达4. 7Χ 105IU/ml最终获得的细胞收集液干扰素为
1.017g/L。按配方三的培养基及本发明的人干扰素β Ia的细胞培养方法，配方三得到的细胞收集液干扰素β Ia生物学活性达5. 2Χ 105IU/ml最终获得的细胞收集液干扰素为 1.253g/L0按配方四的培养基及本发明的人干扰素β Ia的细胞培养方法，配方四得到的细胞收集液干扰素β Ia生物学活性达1. 5Χ 106IU/ml最终获得的细胞收集液干扰素为 1. 425g/L0
实施例2人干扰素β Ia的培养基各成分对比实验分析实验材料1.细胞株细胞株来源于深圳市职业技术学院，利用表达重组人干扰素β Ia的质粒表达载体转入CHO-DHFR-细胞中，构建而成工程细胞，通过筛选获得高表达的细胞株进行扩增后制备成细胞冻存管，使用时取细胞冻存管于37°C快速融化后接种于已温浴的含血
清培养基中培养。2.含血清培养基为GIBCO公司的高糖DMEM培养基；所述含血清培养基为含10 % 的新生牛血清，90%高糖DMEM培养基。基础培养基=GIBCO公司的CHO-S-SFM II培养基、HYCL0NE公司的SFM4CH0培养基。3.试剂D-半乳糖、D-甘露糖、N-乙酰氨基葡萄糖、D-葡萄糖均为SIGMA公司生产，纯度均在99%以上。正丁酸钠国产分析纯试剂；氯化钠国产分析纯试剂；磷酸二氢钾国产分析纯试剂。4.仪器超净工作台；CO2培养箱；紫外可见分光光度计；酶标仪；双目倒置显微
^Mi ο本发明细胞培养方法中的含血清培养基为含10%的新生牛血清，90%高糖DMEM 培养基。无血清培养基为实施例1中配方配制所得培养基。一、制备人干扰素β Ia的细胞培养方法1、种子培养，取携带有表达人干扰素β Ia表达基因质粒的中国仓鼠卵巢细胞 (CH0细胞)冻存管复苏，通过25cm2、75cm2、175cm2方瓶传代培养15天，传代5 7代，3L转瓶培养7 12天，获得种子细胞量5. 0 X IO7 1 X IO9Cells ；目的是活化富集状态良好、生命力旺盛的种子细胞，这样接种于细胞罐后能快速稳定的进入对数生长期。2、5L细胞罐培养按0. 2X IO6 2X 106cellS/ml接种量接入转瓶消化下来的细胞，设置起始条件37°C、pH6. 8 7. 8、溶氧大于20%、转速40rpm进行培养，以后每天转速增加IOrpm，最终加至120rpm。起始条件相对温和，利于细胞改变一个生长环境后在较短时间内适应新的环境并开始增殖。采用含含血清培养基培养5 10天(，灌流速度大于0. 2 0. 8L/h时，先采用含血清培养基培养，是为了在营养最丰富的时候完成细胞数量的积累，灌流速度增加说明细胞数量增值较快，需要的营养相应增加，在灌流速度大于0. 2 0. 8L/h 时，说明细胞处于对数生长期中期，此时细胞量已达到一定积累，可以换成无血清培养基进行细胞维持生长和目的蛋白干扰素β Ia的表达收获了，瞬间排空含血清培养基更换上述无血清培养基，为了尽可能多的收获含干扰素β Ia的无血清培养基，因为含血清培养基的细胞收集液中杂蛋白较多，且用于制药生产时最好不要从有动物组织来源添加成分的收集液中的进行提取纯化。培养基中的蛋白含量减少可以降低成本，有利于分离纯化。调整培养温度为34 36°C，低温会适当减少细胞的比生长速率，延长培养周期，增加干扰素β Ia 的表达量，根据检测的葡萄糖浓度调整无血清培养基灌流速度，控制糖浓度在0. 3 2. Og/ L之间，无血清培养基灌流培养时间约在30 50天左右。3、灌流培养至灌流速度小于0. 05 0. 2L/h，连续检测3次葡萄糖浓度变化不大， 均维持在2. 0 3. Og/L之间某个数值恒定，检测细胞收集液生物学活性小于0. 5 X IO5IU/ ml-0. 5X106IU/ml时，判断为细胞培养终点，结束培养。
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二、检测指标及检测方法1.葡萄糖浓度使用血糖诊断试剂盒。将试剂盒内酶-显色剂和磷酸盐缓冲液以 1 9的体积比混合成工作液。准备3支试管，分别标记为空白管、标准管和样品管，每管加工作液3. 0ml，空白管不加，标准管再加0. 02ml标准液，样品管加0. 02ml样品液。混勻后置37°C温浴15min，以空白调零，在505nm处测吸光度值，分别记为标准管Al、样品管A2。 计算糖浓度=(A2/A1) X 1 (g/L)。2生物学活性检测2. 1 试剂(1) RPMI 1640培养液取RPMI 1640培养基粉末1袋(规格为1L)，加水溶解并稀释至1000ml，加青霉素IO5IU和链霉素IO5IU,再加碳酸氢钠2. lg，溶解后，混勻，除菌过滤， 4°C保存。( 完全培养液量取新生牛血清IOml，WRPMI 1640培养液90ml。4°C保存。(3)测定培养液量取新生牛血清7ml，加RPMI 1640培养液93ml。4°C保存。(4)攻毒培养液量取新生牛血清:3ml JnRPMI 1640培养液97ml。4°C保存。(5)消化液取乙二胺四乙酸二钠0. 2g、氯化钠8. 0g、氯化钾0. 2g、磷酸氢二钠 1. 152g、磷酸二氢钾0. 2g，加水溶解并稀释至1000ml，经121 °C 15分钟灭菌。(6)染色液取MTS 0. lg, PMS 0. 0023g,分别用PBS溶解，混合定容至50ml，除菌过滤，分装于EP管中，-20°C避光保存。(7) PBS取氯化钠8. 0g、氯化钾0. 20g、磷酸氢二钠1. 44g、磷酸二氢钾0. Mg，加水溶解并稀释至1000ml，经121 °C 15分钟灭菌。2. 2标准品溶液的制备取人干扰素生物学活性测定的国家标准品，按说明书复溶后，用测定培养液稀释至每Iml含1000IU。在96孔细胞培养板中，做4倍系列稀释，共8 个稀释度，每个稀释度做2孔。在无菌条件下操作。2. 3样品的制备将样品分别进行100倍或1000倍预稀释。在96孔细胞培养板中，做4倍系列稀释，共8个稀释度，每个稀释度做2个孔。在无菌条件下操作。2. 4测定法使WISH细胞在培养基中贴壁生长。按1 2 1 4传代，每周2 3次，于完全培养液中生长。取培养的细胞弃去培养液，用PBS洗2次后消化和收集细胞， 用完全培养液配制成每Iml含1. 0 X IO5 2. 0 X IO5个细胞的细胞悬液，接种于96孔细胞培养板中，每孔ΙΟΟμΙ。于37°C、5% 二氧化碳条件下培养4 6小时。将配制完成的标准品溶液和样品溶液移入接种WISH细胞的培养板中，每孔加入100μ 1。于37°C、5%二氧化碳条件下培养18 M小时。弃去细胞培养板中的上清液。将保存的水泡性口炎病毒 (VSV，-70°C保存)用攻毒培养液稀释至约100CCID50，每孔100μ 1。于37°C、5%二氧化碳培养M 48小时(镜检标准品溶液的50%病变点在lIU/ml)。然后弃去细胞培养板中的上清液，每孔加入100 μ 1 PBS和20 μ 1 MTS，于37°C、5%二氧化碳培养箱中放置1小时后， 混勻，用酶标仪以630nm为参比波长，在波长492nm处测定吸光度，记录测定结果。试验数据采用计算机程序或四参数回归计算法进行处理。并按下式计算试验结果供试品生物学活性(IU/ml) = PrX (Ds X Es) / (Dr X Er)式中ft·为标准品生物学活性，IU/ml ；Ds为供试品预稀释倍数；Dr为标准品预稀释倍数出s为供试品相当于标准品半效量的稀释倍数；Er为标准品半效稀释倍数。3IFN-3-la 含量检测3. IELISA试剂盒R&D公司生产，批号为201011。3. 2标准品的稀释取原倍标准品一支，分别稀释至2、4、8、16和32pg/ml。3. 3加样分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。在酶标包被板上准确加样标准品 50μ 1，待测样品孔中先加样品稀释液40μ 1，然后再加待测样品10μ 1(样品最终稀释度为 5倍)。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混勻。3. 4温浴-洗涤用封板膜将酶标板封口后置37°C温育30分钟后小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。3. 5加酶每孔加入酶标试剂50 μ 1，空白孔除外。3. 6温育-洗涤操作同4. 4。3. 7显色每孔先加入显色剂A 50 μ 1，再加入显色剂B 50 μ 1，轻轻震荡混勻， 37 °C避光显色15分钟.3. 8终止每孔加终止液50 μ 1，终止反应(此时蓝色立转黄色)。3. 9测定及计算以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度(0D值)。以标准物的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，在坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。三、培养基中添加各组分的结果分析1.培养基中添加四种低聚糖正交试验设计了一个正交试验确定几种低聚糖对CHO-IFN-β细胞生长及干扰素表达、干扰素活性综合影响，确定本发明无血清培养基中(基础培养基12-18g/L中添加的各类低聚糖)各组分浓度的最优配比，正交试验设计表见下表1 低聚糖种类及3个水平方案，试验结果见下表2。表 1
A: D-半乳糖|B: D-甘露糖I C: N-乙酰氨基I D: D-葡萄
水平
(g/L)(g/L)葡萄糖(g/L)糖(g/L)
OsOoOo
2^50^0Oo3
30^5θ77θOo5表

本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种制备人干扰素β1a的细胞的培养方法和细胞培养基及细胞培养基的应用。本发明的技术方案为提供一种制备人干扰素β1a的细胞的培养基，其组分包括基础培养基和添加物，所述基础培养基的浓度为12-18g/L、所述添加物为D-半乳糖0.05-0.45g/L、D-甘露糖0.3-0.7g/L、N-乙酰氨基葡萄糖0.10-0.50g/L、D-葡萄糖1.0-5.0g/L。本发明无血清培养基及培养方法解决了重组人干扰素β1a细胞培养得率低，活性低的问题，本发明最终获得的细胞收集液干扰素β1a生物学活性达1×106IU/ml以上，ELISA法检测干扰素β1a含量达0.8g/L以上。