专利名称：一株冬枣根际促生枯草芽孢杆菌及其应用的制作方法冬枣(Ziziphus jujube Mill.)为鼠李科(Rhamnaceae)枣属(Ziziphus Mill.)植物，主要分布在中国的黄河三角洲一带，原产于我国，VC含量很高，可达400 600mg/100g,比柑桔类水果高10 13倍，营养非常丰富，具有极高的营养价值和食疗价值。 冬枣的生产管理过程非常复杂，施肥是其中一个非常重要的环节。冬枣的施肥效应除了受土壤、林木本身营养特性、施肥量的影响外，还与肥料品种有关。目前，冬枣的施肥以速效肥料为主，但冬枣根系不发达，生长缓慢，毛细根数量少，养分吸收能力差。因此，一般的速效肥料并不能满足冬枣树体养分需求长期性和持续性的特点。此外，随着全球能源危机和化肥施用量的增加，速效肥料施用的负面影响不断显现。大量化肥的施用不仅影响了冬枣的果品品质，还对环境造成了潜在的威胁。诸如土壤的可持续生产能力下降，土壤板结、地表水资源的富营养化，地下水资源硝酸盐含量超标等。因此，寻求一种新型肥料满足冬枣树体生长的需求尤为重要。微生物肥料不仅能改良土壤，改善土壤区系的生态环境，还能有效提高植物对土壤养分的吸收。因此，探寻新的生物质肥料，以替代或部分替代化肥的研究显得尤为重要。植物根际的微生物多而活跃，构成了根际特有的微生物区系。植物根际促生细菌 (PGPR)是生存在植物根际范围中，能直接或间接促进植物生长或对病原菌有拮抗作用的有益的细菌统称。植物根际促生细菌可分泌植物促生物质，包括植物激素、维生素、氨基酸和其它活性有机小分子及衍生物等。还可改善植物根际的营养环境，有效控制植物病害等。植物根际促生细菌的类群繁多，其中既有有益的种群，也有有害的种群。据不完全统计，已发现包括假单胞菌和芽抱杆菌等20多个属的植物根际促生细菌具有防病促生潜能。目前，有关冬枣根际促生细菌菌株的筛选及应用的研究未见报道。
针对上述现有技术，本发明提供了一株冬枣根际促生枯草芽孢杆菌及其应用。本发明是通过以下技术方案实现的一株冬枣根际促生枯草芽孢杆菌，，其分类命名为芽孢杆菌Bacillus sp.，已于 2011年10月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为 CGMCC No. 5318。所述冬枣根际促生枯草芽孢杆菌的菌落特征为DZ1在LB平板上培养24h后呈圆形不透明，表面光滑。菌体细胞大小为(0.7-0.8) μ mX (2.0-3.0) μ m。产芽孢，G+，细胞直杆状。所述冬枣根际促生枯草芽孢杆菌的生理生化特征为明胶液化试验阳性，淀粉水解试验阴性，吲哚试验阴性，伏-普试验阳性，硝酸盐还原试验阴性，柠檬酸盐利用试验阳性，葡萄糖产酸试验阴性，葡萄糖产气试验阴性，接触酶试验阳性，卵磷脂酶试验阴性，2%、 5%和7%生长所需NaCl试验均为阳性。所述冬枣根际促生假单胞菌的最适培养条件为LB培养基蛋白胨10g，酵母膏 5g，NaCl 10g，蒸馏水 1000ml。温度37°C，pH 7.0。所述冬枣根际促生枯草芽孢杆菌可以用于制备微生物肥料。应用时，培养冬枣根际促生枯草芽孢杆菌，得菌悬液，菌悬液作为液态肥料，菌悬液的浓度优选为ι χ IO8Cfu/ ml。或培养冬枣根际促生枯草芽孢杆菌，得菌悬液，然后将菌悬液接种到有机肥中，制成冬枣生物有机肥，菌悬液的浓度优选为5. OX 108cfu/ml，冬枣生物有机肥中活菌数优选为 0. 5X108cfu/g。所述有机肥为腐熟鸡粪。本发明还提供了一种微生物肥料，是通过以下制备方法得到的培养冬枣根际促生枯草芽孢杆菌，得菌悬液，菌悬液作为液态肥料。或培养冬枣根际促生枯草芽孢杆菌，得菌悬液，然后将菌悬液接种到有机肥中，制成冬枣生物有机肥。经研究表明，本发明的冬枣根际促生枯草芽孢杆菌制备的菌悬液菌接种于冬枣苗，可明显促进冬枣苗木根系的生长，提高根系中细根(< 2mm)的比例，增加冬枣苗地径和高度的生长。与对照相比，差异显著。将本发明的冬枣根际促生枯草芽孢杆菌接种到发酵鸡粪中制成生物肥料，施用于七年生的冬枣根系周围，可显著提高根系活力，增加冬枣根际土壤中根系分泌物的含量，增强冬枣根系对土壤养分的吸收利用能力。研究结果表明，该菌剂能明显促进冬枣生长发育，改善冬枣根际土壤的生态环境，本发明为将来开发冬枣专用的微生物肥料提供了优良的菌株资源，将会得到广泛的应用。一株冬枣根际促生枯草芽孢杆菌，菌株为DZ1，该菌株分类命名为芽孢杆菌 Bacillus sp.，已于2011年10月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC No. 5318，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。图1为DZl处理组与对照组的冬枣根系对比图。
明胶液化试验阳性，淀粉水解试验阴性，吲哚试验阴性，伏-普试验阳性，硝酸盐还原试验阴性，柠檬酸盐利用试验阳性，葡萄糖产酸试验阴性，葡萄糖产气试验阴性，接触酶试验阳性，卵磷脂酶试验阴性，2%、5%和7%生长所需NaCl试验均为阳性。(4) 16S rDNA 序列分析16SrDNA基因序列，见核苷酸序列表所示。将DZl的16S rRNA基因序与数Genbank 据库中的序列进行BLAST比对分析，结果表明DZ1与Bacillus subtilis同处于一个最小的分支，进化距离最近DZl的16SrRNA基因序列与Bacillus subtilis (AJ276351)的相似性达98%。综合生理生化特征和菌落形态特征，将其鉴定为芽孢杆菌Bacillus sp.，已于 2011年10月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏编号为 CGMCC No. 5318。实施例2盆栽试验将保存的冬枣根际促生枯草芽孢杆菌DZl在LB斜面上活化，挑取一环接入牛肉膏蛋白胨培养基中，于37°C，ISOrpm条件下振荡培养2天，调菌液浓度为2. 5X108cfu/ml (悬液A)，备用。将冬枣苗在悬液A中沾根后定植。将制备好的悬液A调菌液浓度至1 X IO8Cfu/ ml (悬液B)，取50ml悬液B均勻浇灌于冬枣苗根部周围接种一年生冬枣苗。冬枣苗在无菌水中沾根后，浇灌等量的无菌水为对照。正常管理，于当年冬枣苗停长后测定根系的鲜重、 毛细根重、苗高和地径。结果如表1和图1所示。从表中可以看出，DZl处理冬枣的总根重、细根重、苗高和底径分别比对照提高了 25. 70%、86. 64%、6. 99%和15. 16%。以上表明菌株DZl对冬枣的生长，尤其是细根 (< 2mm)的生长具有明显的促进作用。表 1
总根重提高率细根重提高率苗高提高率底径提高率处理/g/%/g/%/cm/%/mm/%DZl28. 4725. 704. 6186. 6448. 246. 9915. 2715. 16CK22. 65一2. 47一45. 09一13. 26一实施例3田间试验冬枣根际促生枯草芽孢杆菌DZl在往返式振荡器中，于37°C，ISOrpm条件下振荡培养2天，调菌液浓度为5. OX 108CfU/ml，接种到腐熟鸡粪中，制成冬枣生物有机肥 (0.5X108cfu/g)o以等量的腐熟鸡粪为对照，每棵树施用83kg。施肥方式采用东南西北四侧沟施，沟长、宽和高分别为60、30和20cm，将冬枣生物有机肥与挖出的土壤充分混勻后再回填入。每处理30棵树，设置保护行。施用两年后，采用甲醛滴定法测定冬枣根际土壤中氨基酸总量，采用蒽酮比色法测定总糖含量，采用Agilent HP-IIOOseries液相色谱仪测定有机酸含量，结果见表2。从表中可以看出，施用冬枣根际促生枯草芽孢杆菌DZl制成的生物肥能促进冬枣根际土壤中的根系分泌物的增加。与对照(CK)相比，生物肥处理(DZl)的氨基酸总量、有机酸总量和总糖含量提高了分别达到了 55. 56%,27. 48%和37. 18%，冬枣根系对土壤养分的吸收利用能力显著增强。表

本发明公开了一株冬枣根际促生菌，其分类命名为芽孢杆菌Bacillus sp.，已于2011年10月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC No.5318。本发明还公开了上述冬枣根际枯草芽孢杆菌在促进冬枣生长中的应用。该菌株制成菌剂接种于冬枣苗，结果表明，该菌剂可明显促进冬枣苗木根系的生长，提高根系中细根的比例，增加冬枣苗地径和高度的生长。与对照相比，差异达显著水平。将本发明的冬枣根际促生枯草芽孢杆菌接种到发酵鸡粪中制成生物肥料，施用于七年生的冬枣根系周围，可显著提高根系活力，增加冬枣根际土壤中根系分泌物的含量，增强冬枣根系对土壤养分的吸收利用能力。